姬慶龍，趙貴明，王 娉，趙勇勝，趙曉美，楊海榮，陳 穎

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

薩拉米香腸是以豬、牛肉等為原料，按照一定肥瘦比例，加入鹽、大蒜、胡椒、辣椒等香料調(diào)味，經(jīng)菌種發(fā)酵后在特定條件下干燥制成的干發(fā)酵香腸。香腸切開后，橫斷面呈現(xiàn)漂亮的大理石紋理，有股獨(dú)特的香氣與酸味[1]，是意大利傳統(tǒng)美食，也是歐洲人必不可少的大宗食品，雖然目前在我國生產(chǎn)消費(fèi)量相對較少，但其國內(nèi)市場正在逐步擴(kuò)大，已形成自己的消費(fèi)群體[2-3]。

發(fā)酵香腸的風(fēng)味不僅取決于原材料和調(diào)味料，更與其中的微生物密切相關(guān)，因此了解其中微生物群落結(jié)構(gòu)是風(fēng)味研究及安全質(zhì)控的關(guān)鍵[4-5]。但是傳統(tǒng)方法依靠培養(yǎng)、分離、純化等一系列手段，對微生物具有一定選擇性，無法全面反映發(fā)酵過程中微生物的種群結(jié)構(gòu)。高通量測序技術(shù)與傳統(tǒng)微生物群落研究相比，可對樣品中微生物進(jìn)行大規(guī)模平行測序，能夠客觀反映樣品中群落構(gòu)成和多樣性，在腸道微生物、土壤微生物、海洋微生物、食品微生物等不同類型的環(huán)境樣品中微生態(tài)研究中得到了應(yīng)用。目前，該技術(shù)已用于奶制品[6-8]、茶葉[9-10]、肉制品[11-15]、醬[16]、腌菜[17-18]等發(fā)酵食品的菌群結(jié)構(gòu)分析。盡管高通量測序技術(shù)在分析食品菌群結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，但DNA提取方法、樣品濃度、建庫方法、引物選擇、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）循環(huán)數(shù)、目標(biāo)菌鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）含量、測序平臺(tái)等[19]都會(huì)影響最終測序結(jié)果。為保證結(jié)果的可靠性以及不同研究之間結(jié)果的可比性，需要建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的高通量菌群分析實(shí)驗(yàn)流程。其中，DNA提取方法的比較是近年來研究關(guān)注點(diǎn)之一[20-21]，而樣品前處理是DNA提取的第一步。

與糞便、土壤、海水等樣品不同，食品樣品的組成較為復(fù)雜且菌群分布并不均一。因此從食品樣品中提取細(xì)菌DNA時(shí)，通常需對樣品進(jìn)行前處理，如剪碎混勻、富集濃縮等。但不同前處理方法對樣品中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，國內(nèi)外少有報(bào)道。目前，通常采用DNA的產(chǎn)量與純度評價(jià)前處理方法有效性[22-24]。但DNA產(chǎn)量與微生物多樣性之間沒有明顯關(guān)聯(lián)，DNA產(chǎn)量大并不表明前處理方法滿足要求，只有盡可能獲得整個(gè)樣品中所有的微生物基因組，才能真實(shí)地反映樣品中實(shí)際的菌群結(jié)構(gòu)[25]。

為此，本研究采用3種不同前處理方法提取薩拉米香腸細(xì)菌DNA，采用MiSeq高通量測序技術(shù)對其細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過比較3種方法提取的樣品中細(xì)菌種群差異，篩選出較適合的前處理方法，以期為建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)酵香腸高通量菌群分析實(shí)驗(yàn)流程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取不同發(fā)酵劑的3種薩拉米香腸樣品，分別命名為S1、S2、S3，樣品信息見表1。在保質(zhì)期內(nèi)對樣品進(jìn)行測序分析。

表1 薩拉米香腸樣品基本信息Table 1 Information about salami samples tested in this study

QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒、3 mm碳化鎢研磨珠 德國QIAGEN公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；BagFilter側(cè)過濾均質(zhì)袋 法國Interscience公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BagMixer拍打式均質(zhì)機(jī) 法國Interscience公司；TissueLyser II高通量組織研磨儀 德國QIAGEN公司；NanoDrop One超微量分光光度計(jì)、小型臺(tái)式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理與DNA提取

前處理方法分為3種，分別為直接提取法（M0）、拍擊均質(zhì)法（M1）和振蕩珠磨法（M2），每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)平行。按照GB/T 4789.17—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 肉與肉制品檢驗(yàn)》的處理方法，直接切取25 g樣品，放入滅菌研缽內(nèi)用滅菌剪子切碎后，加滅菌玻璃砂研磨，攪拌混勻。M0方法，直接稱取混勻后的200 mg樣品于2 mL離心管中用于DNA提取。M1方法參考米瑞芳等[4]對酸肉中細(xì)菌群落的高通量測序分析，稱取25 g樣品，加入225 mL無菌PBS，均質(zhì)機(jī)拍打2 min后，至4 ℃搖床振蕩30 min，靜置10 min后取上清液離心收集沉淀，用于DNA提取。M2方法為將樣品切碎混勻后，稱取200 mg樣品，加入1.5 mL無菌PBS和4個(gè)3 mm碳化鎢研磨珠，在高通量組織研磨儀上以30 次/s的頻率，振蕩3×1 min，每次間隔30 s以上。250×g離心5 min后取上清液，沉淀加入2 mL無菌PBS，渦旋混勻后，再次250×g離心5min后取上清液，合并上清液，15 000×g以上離心3 min收集沉淀，無菌PBS清洗3 次后，備用。

DNA提取使用QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒，根據(jù)試劑盒說明書的步驟提取DNA，其中水浴溫度選擇95 ℃，使用50 μL洗脫液溶解DNA。提取的樣品DNA編號(hào)與前處理法名稱一致。DNA純度和濃度采用NanoDrop One超微量分光光度計(jì)測定。

1.3.2 細(xì)菌群落的高通量測序分析

高通量測序由北京奧維森基因科技有限公司完成。引物為343F（5′-CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）[26]，為細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)，第2輪擴(kuò)增引入Illumina橋式擴(kuò)增引物，并利用膠回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng) Qubit 2.0精確定量后完成文庫構(gòu)建，MiSeq平臺(tái)PE300測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

MiSeq測序可得到雙端序列數(shù)據(jù)，對測得的Fastq數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)質(zhì)控處理，最終得到優(yōu)質(zhì)的Fasta數(shù)據(jù)，在去除標(biāo)簽和引物后，進(jìn)一步去除嵌合體和短序列后得到最終序列。在97%的相似水平下，對序列使用vsearch軟件生成可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。與數(shù)據(jù)庫silva 128比對進(jìn)行原核微生物的信息注釋?；诜诸悓W(xué)信息，在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)。利用qiime軟件進(jìn)行α多樣性分析，包括物種豐富度統(tǒng)計(jì)（Chao1指數(shù)）、物種多樣性統(tǒng)計(jì)（Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)）。使用Venn圖軟件統(tǒng)計(jì)方法中共有和獨(dú)有OTU數(shù)目，分析方法間OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。使用SPSS 25軟件進(jìn)行單因素方差分析及繪制箱形圖，其他圖在Excel中繪制完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

采用上述3種前處理方法處理薩拉米香腸樣品后，M0提取的DNA平均質(zhì)量濃度為（361.5±9.36）ng/μL，M1為（15.56±6.79）ng/μL，M2為（23.77±2.21）ng/μL。 3種方法得到的DNA的A260nm/A280nm比值均在1.9左右，表明純度良好。使用引物343F/806R擴(kuò)增后，3種方法均可擴(kuò)增出450 bp的目的條帶。雖然M1和M2的DNA質(zhì)量濃度低于M0（混有樣品組織DNA），但3種方法均滿足樣品菌群結(jié)構(gòu)分析的建庫需要。

2.2 OTU分布及α多樣性分析

為突出3種前處理方法間測序結(jié)果的差異性，將2個(gè)平行對照的數(shù)據(jù)合并成1個(gè)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。M0、M1和M2平均每個(gè)樣品測得原始序列為33 722、47 135、44 033 條，去除嵌合體、短序列后得到最終優(yōu)質(zhì)序列數(shù)目分別是29 685、42 343、39 768 條，按照97%相似性，聚類共產(chǎn)生417個(gè)OTU，經(jīng)過抽平處理剩余405個(gè)OTU。如圖1所示，M0、M1和M2的OTU數(shù)分別為319、206和253，其中M0獨(dú)有OTU數(shù)為90個(gè)，M1獨(dú)有OTU數(shù)為33個(gè)，M2獨(dú)有OTU數(shù)為38個(gè)。方法間共有的OTU數(shù)為129個(gè)，占樣品總數(shù)的31.85%；任意兩種前處理方法共有OTU數(shù)均在140個(gè)以上，M0和M2的共有OTU數(shù)最多（200個(gè)），占樣品總數(shù)的49.38%。非共有OTU雖然數(shù)量很多，但豐度卻極低，代表并不是主要菌群。

圖1 3種前處理方法共有和獨(dú)有OTU的Venn分析Fig. 1 Venn diagram representation of shared and unique OTUs among three pretreatments

每個(gè)樣品的文庫覆蓋率均為100%，表明目前數(shù)據(jù)量的分析符合要求，已測數(shù)據(jù)可以反映薩拉米香腸樣品中絕大多數(shù)的細(xì)菌物種信息，增加測序數(shù)據(jù)已無法找到更多的OTU，詳細(xì)見表2。Chao1指數(shù)反映樣品微生物種群的豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣品微生物種群的多樣性，表現(xiàn)微生物種群的均勻度。結(jié)果表明，M0、M1和M2的Chao1指數(shù)分別為177.93±31.02、120.76±28.60、166.96±15.63；Shannon指數(shù)分別為2.79±0.22、2.95±0.31、3.25±0.30；Simpson指數(shù)分別為0.70±0.06、0.78±0.05、0.81±0.05。Chao1指數(shù)最高的是M0，同樣品3個(gè)方法間最多相差145.98，證明M0可獲得更高的物種豐富度；種群分布最均勻、種群多樣性最高的是M2，同樣品方法間Shannon指數(shù)最多相差0.83，而Simpson指數(shù)相差最多0.15。證明不同前處理方法可對樣品的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

表2 3種前處理方法的α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of samples with three pre-treatments

2.3 細(xì)菌組成分析

在門分類水平上，3種前處理方法共有13個(gè)門（含無法鑒定），厚壁菌門和變形菌門為主要優(yōu)勢細(xì)菌，此外還存在少量的放線菌門和擬桿菌門等，與國內(nèi)外同類研究一致[27-29]。3種前處理方法在門水平上種群結(jié)構(gòu)相似，但豐度上存在差異，其中厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，相對豐度分布為M0（85.03%）＞M2（79.21%）＞ M1（68.70%）；變形菌門的相對豐度分布分別為 M1（22.03%）＞M2（18.09%）＞M0（10.09%）；放線菌門的相對豐度分布分別為M1（8.37%）＞M0（2.83%）＞M2（1.02%）。

在科分類水平上，M0、M1和M2分別有84、74、81個(gè)科，共有科為59個(gè)，占比99.5%以上。非共有科所占比例極低，對科分類水平上種群結(jié)構(gòu)影響不大，但優(yōu)勢科的相對豐度存在差異（表3）。M0的優(yōu)勢科細(xì)菌（相對豐度＞1%）為乳桿菌科、鏈球菌科、葡萄球菌科、明串珠菌科、腸桿菌科和短桿菌科，所占比例總和為94.19%。M1的優(yōu)勢科與M0相同，但相對豐度存在差異，所占總比例為97.13%。與M0相比，M1的乳桿菌科和鏈球菌科相對豐度偏低，但腸桿菌科和短桿菌科的相對豐度顯著升高。M2的優(yōu)勢科與M0和M1略有不同，黃桿菌科的相對豐度（1.32%）大于短桿菌科（0.59%），優(yōu)勢菌占比94.92%。

表3 3種前處理方法提取的薩拉米香腸樣品中優(yōu)勢細(xì)菌及相對豐度Table 3 Relative abundances of dominant bacteria in salami with three pretreatments

如圖2所示，在屬分類水平上，M0、M1和M2分別有112、104、115個(gè)屬，共有屬為70個(gè)，占比99%以上。M0有8個(gè)優(yōu)勢菌屬，分別為乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、烏拉爾菌屬、檸檬酸桿菌屬和短桿菌屬，所占比例總和為90.87%。M1則有11個(gè)優(yōu)勢菌屬，除上述8個(gè)菌屬外，還包括巨大球菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬，所占比例總和為93.31%。而M2有9個(gè)優(yōu)勢菌屬，與M0相比，多了腸桿菌屬和克羅諾菌屬為優(yōu)勢菌屬，而其短桿菌屬相對豐度小于1%，其優(yōu)勢菌屬占比91.53%左右。3種前處理方法在屬水平對薩拉米香腸樣品的種群結(jié)構(gòu)及相對豐度差異顯著（P＜0.05）。

圖2 3種前處理方法提取的薩拉米香腸樣品中優(yōu)勢細(xì)菌及相對豐度Fig. 2 Abundances of dominant bacteria in salami with three pretreatments

3 討論與結(jié)論

高通量測序技術(shù)可對樣品中微生物進(jìn)行大規(guī)模平行測序，能夠客觀反映樣品中群落構(gòu)成和多樣性，已經(jīng)在腸道微生物、土壤微生物、海洋微生物、食品微生物等不同類型的環(huán)境樣品中的微生態(tài)研究展開了廣泛應(yīng)用，但是影響最終測序結(jié)果的因素有很多，為保證結(jié)果的可靠性以及不同研究之間結(jié)果的可比性，需要建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的高通量菌群分析實(shí)驗(yàn)流程。與糞便、土壤、海水等樣品不同，食品樣品的組成較為復(fù)雜且菌群分布并不均一，從食品樣品中提取細(xì)菌DNA時(shí)，必須對樣品進(jìn)行前處理，如剪碎混勻、富集濃縮等步驟。因此，食品樣品前處理是高通量測序分析第1步。目前各項(xiàng)研究采取的前處理方法沒有統(tǒng)一的操作流程：有些研究僅將樣品切碎后，帶著食品組織直接提取DNA，有些研究則參考傳統(tǒng)微生物檢測的操作流程均質(zhì)混勻稀釋后再進(jìn)行DNA提取。不同的前處理方法是否對樣品中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，國內(nèi)外較少報(bào)道。

本研究分析3種常用前處理方法對不同規(guī)格薩拉米香腸中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)的影響：在DNA提取結(jié)果上，3種前處理方法采用同一個(gè)DNA提取步驟，但由于M0包含大量的樣本組織，導(dǎo)致M0提取的平均DNA質(zhì)量濃度為（361.5±9.36）ng/μL，遠(yuǎn)高于M1（15.56±6.79）ng/μL和M2（23.77±2.21）ng/μL，但在后續(xù)的建庫測序中，M0、M1和M2平均每個(gè)樣品得到最終優(yōu)質(zhì)序列數(shù)目分別為29 685、42 343、39 768 條，說明DNA的產(chǎn)量與測序的建庫質(zhì)量沒有明顯關(guān)聯(lián)，因此僅靠DNA的產(chǎn)量與純度不能評價(jià)前處理方法的有效性[24,30-31]，只有盡可能獲得整個(gè)樣品中所有的微生物基因組，才能真實(shí)地反映樣品中實(shí)際的菌群結(jié)構(gòu)[25]。王朝江[32]研究表明，不同的DNA提取前處理方法獲得的樣品細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相似，但豐度上存在差異；但本研究分析的3種前處理方法，在門和科水平符合上述觀點(diǎn)，但在屬水平上，每種方法的優(yōu)勢菌屬發(fā)生了變化，與M0相比，M1增加了巨大球菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬為優(yōu)勢菌屬；M2則多了腸桿菌屬和克羅諾菌屬為優(yōu)勢菌屬，少了短桿菌屬。這種差異取決于樣品的均一程度與前處理方法的相關(guān)特點(diǎn)：M0僅將樣品切碎混勻后，直接按照試劑盒的要求提取樣品DNA。由于樣品沒有經(jīng)過緩沖液清洗，導(dǎo)致樣本中除了現(xiàn)存細(xì)菌之外，還含有死去細(xì)菌的游離DNA，這導(dǎo)致提取的DNA中，擴(kuò)大了優(yōu)勢菌群的比例及細(xì)菌多樣性。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作相對簡單、快捷，且可了解樣品在發(fā)酵過程中早期存在但后期消亡的細(xì)菌；缺點(diǎn)是使用該方法得到的不僅有細(xì)菌DNA，還包括樣本組織DNA，從而造成線粒體和葉綠體的干擾。由于線粒體和葉綠體也含有16S rDNA，使用細(xì)菌通用引物可以將線粒體和葉綠體的序列擴(kuò)增出來而被錯(cuò)誤認(rèn)定為變形菌門和藍(lán) 藻門[33]。此外，由于沒有經(jīng)過前處理，樣本中混有大量PCR抑制因子，如多糖、多肽、鹽類、脂類及亞鐵血紅素等雜質(zhì)，對DNA的純度影響很大。因此M0特別依賴后續(xù)的DNA提取方法。

M1參考傳統(tǒng)微生物檢測的操作流程，稱取25 g樣品后，加入225 mL無菌PBS，均質(zhì)機(jī)拍打混勻靜置后，吸取上清液，離心沉淀提取DNA。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于通過緩沖液洗滌及均質(zhì)器的拍打，排除了優(yōu)勢菌群的游離DNA及多糖、多肽、樣本組織等雜質(zhì)的干擾。此外此方法由于取樣量相對較多，更有代表性，可以相對客觀地體現(xiàn)出樣本的菌群結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是操作相對繁瑣復(fù)雜，處理樣品的過程中容易造成污染。

M2是將樣品切碎混勻后，稱取200 mg樣品于離心管中，加入無菌PBS中，利用3 mm碳化鎢研磨珠，在高通量組織研磨儀高速振蕩撞擊。其原理是當(dāng)研磨珠直徑大于1 mm時(shí)，beads-beating只能裂解動(dòng)植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞，而對細(xì)菌無影響[21]。因此選擇3 mm碳化鎢研磨珠，可通過振蕩撞擊，分散樣品組織，使細(xì)菌更好地分散在緩沖液中。再通過差速離心法除去樣本組織的干擾。其優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡單，且除去了優(yōu)勢菌群的游離DNA及多糖、多肽、樣本組織等雜質(zhì)的干擾。缺點(diǎn)是由于取樣量太少，不能完全的代表樣品的菌群結(jié)構(gòu)。

雖然M1與M2的取樣量及后續(xù)操作差異很大，但兩種方法均去除了游離DNA，反映了樣品取樣時(shí)的實(shí)際細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。理論上如果樣品的菌群結(jié)構(gòu)完全均勻，兩種方法的分析結(jié)果應(yīng)無顯著差異。但鑒于微生物的特殊性，其在食品中分布并不均勻。因此在食品微生物檢測中，制定具有代表性的采樣方案尤為重要。本研究依據(jù)GB/T 4789.17—2003中的采樣處理方法，將樣品研磨混勻后，再使用3種前方法對薩拉米香腸樣品進(jìn)行多樣性分析。每種方法和每個(gè)樣品均做了平行對照。如圖2A所示，每種方法的2個(gè)平行樣本中，優(yōu)勢菌群種類與豐度無顯著差異，說明方法的重復(fù)性良好，種群結(jié)構(gòu)的差異源自3種前處理方法?，F(xiàn)有的采樣方案雖然將樣品通過研磨的方式混合，但其中的細(xì)菌分布仍達(dá)不到完全均勻，取樣量依舊影響著種群結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果。當(dāng)采樣方案一致時(shí)，樣品的規(guī)格越小，采取的樣品越具有代表性，其中的菌群分布相對越均勻。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著薩拉米香腸樣品（S1、S2、S3）的規(guī)格減小時(shí)（350、100、50 g），3種方法之間的種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果發(fā)生了變化：M1和M2的分析結(jié)果隨著樣品規(guī)格減小逐漸趨于一致。如果在后續(xù)研究中，優(yōu)化采樣操作流程，使樣品在采樣時(shí)已具有一定的代表性，則 M2為更適宜的薩拉米香腸中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析的前處理方法。

綜上所述，在門和科水平分析，不同前處理方法獲得的樣品細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)相似，但豐度上存在差異；但在屬水平上，不同的前處理方法可影響后續(xù)種群結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果。M0可增大優(yōu)勢菌的豐度及多樣性，可應(yīng)用于檢測樣品在成熟過程中存在過的細(xì)菌。而M1和M2除去了游離DNA，只留下具有完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的細(xì)菌菌體，更能反映出樣品在取樣時(shí)的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。當(dāng)樣品結(jié)構(gòu)相對均一時(shí)，M1與M2的菌群結(jié)構(gòu)和豐度趨于一致。應(yīng)該盡早建立統(tǒng)一的高通量測序標(biāo)準(zhǔn)流程，以確保數(shù)據(jù)的可靠性以及不同研究之間結(jié)果的可比性。