曾令杰，豐丕雪，黃錦翔，梁大呈，佀再勇，龍秀鋒，伍時華，易 弋

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

燃料乙醇代替?zhèn)鹘y(tǒng)化石燃料可帶來許多環(huán)境和社會效益[1]。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為常用的乙醇生產(chǎn)者具有許多優(yōu)勢，例如生長周期短、發(fā)酵能力強(qiáng)以及對木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中存在的乙醇[2]有更高的抵抗力，包括滲透壓[3]和弱酸[4]等。然而，在木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理和水解過程中會產(chǎn)生對細(xì)胞有毒的化合物，根據(jù)這些有毒化合物的來源分為弱酸、呋喃衍生物和酚類化合物3 大類[5-6]，這些毒素能抑制細(xì)胞生長，并對發(fā)酵微生物的性能產(chǎn)生負(fù)面影響[7-8]。因此，研究酵母細(xì)胞對木質(zhì)纖維素水解液中各種脅迫環(huán)境的耐受性很重要。甲酸、乙酸和乙酰丙酸是木質(zhì)素纖維素水解液中一些常見的弱酸類抑制劑[9]，在這些幾種弱酸中，雖然甲酸含量較乙酸和乙酰丙酸低，通常約為乙酸（10～20 g/L）的1/10，但其對酵母細(xì)胞的毒性最強(qiáng)[10-11]。因此，研究甲酸對酵母細(xì)胞的毒性機(jī)理及其解毒機(jī)制非常重要。

近年來，關(guān)于釀酒酵母對各種應(yīng)激的研究越來越多，對酵母細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制有了更好的認(rèn)識[12-14]。 代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新學(xué)科[15]。Nugroho等[16]采用代謝組學(xué)方法研究乳酸誘導(dǎo)的脅迫對酵母代謝物庫的影響，結(jié)果表明，外源添加脯氨酸能夠抵抗乳酸誘導(dǎo)的氧化損傷，提高細(xì)胞的生長速率，保護(hù)細(xì)胞免受酸脅迫。Devantier等[17]通過代謝組學(xué)研究乙醇對釀酒酵母細(xì)胞代謝的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞能量消耗增加，細(xì)胞內(nèi)丙酮酸和相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量明顯提高。Jung等[18]利用代謝組學(xué)研究探討釀酒酵母對糠醛的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母進(jìn)行全局代謝分配以快速抵御脅迫，與能量產(chǎn)生、輔因子再生和細(xì)胞損傷恢復(fù)相關(guān)的代謝產(chǎn)物在胞內(nèi)大量積累。因此，研究釀酒酵母細(xì)胞的環(huán)境脅迫耐受性具有重要意義。本實驗采用非靶向代謝組學(xué)分析，從代謝水平系統(tǒng)分析釀酒酵母對甲酸抑制劑的耐受機(jī)理，以期為酵母耐性調(diào)節(jié)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（S. cerevisiaeGGSF16）由廣西科技大學(xué)微生物研究室保存；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基（酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L）、發(fā)酵培養(yǎng)基（酵母粉 10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖100 g/L，pH值自然，121 ℃滅菌20 min）由實驗室自制。

甲酸（分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司； 甲酸、甲醇、乙腈、2-丙醇（均為色譜純） 美國Fisher Chemical公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOF 5600三重四極桿質(zhì)譜、ExionLC AD液相色譜系統(tǒng) 美國AB SCIEX公司；HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm） 美國Waters公司；JXDC-20氮氣吹掃儀 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；LNG-T88臺式快速離心濃縮干燥器 太倉市華美生化儀器廠；Wonbio-96c高通量組織破碎儀 上海萬柏生物科技有限公司；Centrifuge 5430R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；AR224CN電子天平 奧豪斯儀器（常州） 有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甲酸脅迫對酵母細(xì)胞生長的影響

根據(jù)本課題組研究[19]的初步篩選結(jié)果，確定甲酸對釀酒酵母半致死質(zhì)量濃度為1.8 g/L。以10%接種量將活化的酵母細(xì)胞接種到200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、 150 r/min搖床中培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長中后期，此時菌液濃度約為3.68×107CFU/mL。以添加終質(zhì)量濃度1.8 g/L甲酸溶液的菌液為處理組，未添加甲酸為對照組，在搖床中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 h取樣用紫外分光光度計在600 nm波長處測定培養(yǎng)液光密度OD600nm，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2 甲酸對酵母細(xì)胞發(fā)酵能力的影響

采用二氧化碳失重法[20]，以10%接種量將酵母細(xì)胞懸液接入到200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別吸取一定體積40 g/L甲酸母液于培養(yǎng)基中，使甲酸終質(zhì)量濃度分別為1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 g/L，以未添加甲酸為對照組，30 ℃、150 r/min搖床中進(jìn)行培養(yǎng)。在發(fā)酵過程中稱量發(fā)酵瓶質(zhì)量（精確到0.01 g），稱前需搖晃發(fā)酵瓶，趕除二氧化碳。計算各取樣時間點發(fā)酵瓶質(zhì)量差值，即為二氧化碳釋放量。設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3 胞內(nèi)代謝物的制備和提取

將活化的菌種接種于新鮮YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，加入終質(zhì)量濃度1.8 g/L的甲酸溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。取發(fā)酵液3 mL，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌菌體，再于12 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄去上清液，得到新鮮菌體于離心管中，-80 ℃處理10 min。取50 mg固體酵母至2 mL加厚離心管中，加入800 μL提取液（甲醇-水（4∶1，V/V）），加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg/mL，乙腈配制），冷凍組織研磨儀（-10 ℃、50 Hz）研磨6 min，低溫超聲（5 ℃、40 Hz）提取30 min，然后放入-20 ℃冰箱中，靜置30 min后13 000 r/mim、4 ℃離心15 min，移取上清液至帶內(nèi)插管的進(jìn)樣瓶中待測。實驗設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 液相色譜-質(zhì)譜分析

采用UHPLC-Q Exactive系統(tǒng)。液相色譜條件：HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液，流動相B為含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的乙腈-異丙醇（1∶1，V/V），流速 0.40 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：信號采集采用正負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍m/z70～1 050；電噴霧電離源，正離子電壓3 500 V，負(fù)離子電壓2 800 V，鞘氣壓力40 psi，輔助加熱氣壓力10 psi，離子源加熱溫度400 ℃，循環(huán)碰撞能20～60 eV。

1.3.5 差異代謝物分析

采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型區(qū)分各組間代謝特性的總體差異，其中以變量投影重要性（variable importance projection，VIP）大于1和P值小于0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物，并通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫（https://www.kegg.jpkeggpathway.html）進(jìn)行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。使用R軟件包ropls（Version1.6.2）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），Python軟件包scipy.stats進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲酸對酵母細(xì)胞生長的影響

由圖1可知，對照組在6 h進(jìn)入對數(shù)生長中期，8 h進(jìn)入穩(wěn)定期；培養(yǎng)6 h添加1.8 g/L甲酸后，處理組酵母細(xì)胞的生長立即受到抑制，酵母細(xì)胞生長緩慢，可能在適應(yīng)新的環(huán)境。而隨著培養(yǎng)時間的延長，酵母細(xì)胞緩慢生長，最終細(xì)胞生長量明顯低于對照組。這說明甲酸對酵母細(xì)胞的生長繁殖具有一定的抑制作用。

圖1 甲酸對酵母細(xì)胞生長的影響Fig. 1 Effect of formic acid on the growth of yeast cells

2.2 甲酸對酵母細(xì)胞發(fā)酵能力的影響

釀酒酵母在乙醇發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量CO2，CO2釋放量可以直接指示酵母發(fā)酵時間和發(fā)酵活力，是評價釀酒酵母發(fā)酵能力最簡便快速的方法[21]。由圖2可知，不同質(zhì)量濃度甲酸均影響了釀酒酵母CO2釋放特性，且存在明顯的濃度依賴效應(yīng)。對照組在培養(yǎng)8 h CO2釋放量達(dá)到最大；添加1.0、1.2 g/L和1.4 g/L甲酸處理組的CO2釋放量也在8 h達(dá)到最大，但釋放量均低于對照組；添加1.6 g/L甲酸處理組的CO2最大釋放量出現(xiàn)在10 h，較對照組延長了2 h；添加1.8 g/L甲酸處理組的CO2最大釋放量出現(xiàn)在12 h，較對照組延長了4 h，說明1.8 g/L甲酸對酵母細(xì)胞的發(fā)酵能力具有一定的抑制作用。添加2.0 g/L甲酸處理CO2釋放量不到0.1 g，說明高質(zhì)量濃度甲酸對酵母細(xì)胞具有強(qiáng)烈的毒害作用。

圖2 甲酸質(zhì)量濃度對酵母細(xì)胞發(fā)酵能力的影響Fig. 2 Effects different concentrations of formic acid on carbon dioxide release during yeast fermentation

2.3 代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)質(zhì)控

質(zhì)控工作是進(jìn)行基于質(zhì)譜技術(shù)的代謝組學(xué)研究時獲得可靠且高質(zhì)量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)[22]。采用PCA對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，可用于發(fā)現(xiàn)異常樣本、評價質(zhì)控重復(fù)性。圖3A、B分別為正、負(fù)離子模式下質(zhì)控樣本的PCA得分圖，質(zhì)控樣本檢測結(jié)果較為密集的聚在一起，說明質(zhì)控重復(fù)性良好，分析系統(tǒng)穩(wěn)定，所采集的樣品數(shù)據(jù)可作進(jìn)一步差異分析。

圖3 質(zhì)控樣本PCA的得分圖Fig. 3 PCA score plots of quality control samples

2.4 代謝組學(xué)的PCA結(jié)果

為判別對照組和1.8 g/L甲酸處理組之間是否具有差異，本研究采用PCA建模方法對兩組進(jìn)行分析。PCA結(jié)果表明，在正離子模式下PC1貢獻(xiàn)率為53.10%，PC2貢獻(xiàn)率為16.00%，兩者累計貢獻(xiàn)率達(dá)到69.1%。負(fù)離子模式下PC1貢獻(xiàn)率為61.10%，PC2貢獻(xiàn)率為14.10%，兩者累計貢獻(xiàn)率達(dá)到75.2%。如圖3所示，兩組樣品基本都處于95%置信區(qū)間內(nèi)，處理組和對照組6個重復(fù)數(shù)據(jù)點檢測結(jié)果基本都能很好地集中在一起，說明在整個實驗過程中實驗操作、儀器分析穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重復(fù)性較好，可用于后續(xù)分析。

2.5 代謝組學(xué)的OPLS-DA結(jié)果

不同于PCA，OPLS-DA是一種有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法，能很好地分離樣品且更利于尋找差異代謝物。由圖4可知，兩組樣本都能聚成一類，且區(qū)分明顯，說明該實驗重復(fù)性好，結(jié)果與PCA結(jié)果類似。此外，在正離子模式下，R2X=0.79，R2Y=0.999，Q2=0.997，負(fù)離子模式下，R2X=0.846，R2Y=0.999，Q2=0.998，這3個指標(biāo)都接 近于1，表明OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠，且能較好地預(yù)測對照組和處理組酵母細(xì)胞內(nèi)差異代謝物。為防止OPLS-DA 模型的過度擬合，采用置換檢驗法對OPLS-DA模型進(jìn)行驗證，結(jié)果表明，根據(jù)正、負(fù)離子模式數(shù)據(jù)建立的 OPLS-DA模型未發(fā)生過擬合。

圖4 不同組代謝物的OPLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig. 4 OPLS-DA score plots (A) and permutation test charts (B) of differential metabolites

2.6 差異代謝物篩選

采用OPLS-DA模型的VIP＞1、P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，初步篩選出兩組的差異代謝物，共檢測出差異代謝物226種，其中有123種代謝物顯著上調(diào)，103種代謝物顯著下調(diào)，表1為甲酸處理后酵母細(xì)胞內(nèi)部分差異代謝物。

表1 甲酸處理后酵母細(xì)胞內(nèi)部分差異代謝物Table 1 Differential metabolites in yeast cells treated with formic acid

續(xù)表1

2.7 差異代謝物KEGG通路富集分析

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些差異代謝物共富集到45 條通路，共涉及55種代謝物，其中顯著富集的代謝通路有18 條。如圖5所示，有7 條氨基酸代謝通路受到顯著富集，且覆蓋差異代謝物最多的3 條氨基酸代謝通路分別為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，色氨酸代謝以及β-丙氨酸代謝通路；其余顯著富集的通路分別為泛酸和CoA生物合成，氨?；鵷RNA的生物合成，碳青霉烯生物合成，嘌呤代謝，ATP結(jié)合盒蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，嘧啶代謝，乙醛酸和二羧酸的代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷胱甘肽代謝，氧化磷酸化，氰氨基酸代謝，氮素代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝，甘油磷脂代謝和精氨酸生物合成代謝通路。KEGG通路富集表明甲酸脅迫引發(fā)了酵母細(xì)胞的代謝紊亂，特別是氨基酸代謝和核苷酸代謝受到影響最大，這些代謝通路可能在釀酒酵母耐受甲酸脅迫的研究中有重要意義。

圖5 差異代謝物KEGG富集通路圖Fig. 5 KEGG enrichment pathways of differential metabolites

2.8 代謝通路分析

將拓?fù)浞治龊透患治鼋Y(jié)合，進(jìn)一步判斷某一代謝通路是否在所研究的生物學(xué)過程中起到關(guān)鍵作用。對甲酸處理組和對照組之間有顯著差異的代謝產(chǎn)物進(jìn)行途徑富集和拓?fù)浞治?，從而識別出甲酸對酵母細(xì)胞代謝通路的潛在影響，結(jié)果如表2和圖6所示。圖6中每一個氣泡表示一種KEGG通路，氣泡大小代表重要性，氣泡越大，表示代謝物在通路中的重要性越大。在甲酸的影響下共鑒定出43 條代謝途徑，重要性得分排名前20的代謝通路中，重要性值大于0.1的潛在代謝通路有9 條，包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，泛酸和CoA生物合成，嘧啶代謝，色氨酸代謝，組氨酸代謝，酮體的合成與降解，脂肪酸降解，糖酵解/糖異生以及賴氨酸的生物合成。

表2 重要性排名前20的代謝通路Table 2 Top 20 most important metabolic pathways

圖6 顯著差異代謝物代謝通路分析Fig. 6 Metabolic pathway analysis of significantly differential metabolites

2.9 甲酸脅迫下酵母代謝物差異的分析

通過基于液相色譜-質(zhì)譜的代謝組學(xué)方法，在處理組與對照組間共檢測出226種差異代謝物，其中123種差異代謝物上調(diào)，113種差異代謝物下調(diào)，通過代謝通路分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的代謝物主要與氨基酸代謝和核苷酸代謝相關(guān)。

氨基酸是許多細(xì)胞生物合成和代謝過程中的主要代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞中通常作為前體物質(zhì)參與細(xì)胞的構(gòu)建，還可以通過形成催化酶調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝。如圖7A和圖8所示，涉及氨基酸代謝的差異代謝物中，與對照組相比，處理組中氧化型谷胱甘肽、半胱氨酰甘氨酸、檸檬酸、L-谷氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、黃嘌呤酸、2,3-吡啶二羧酸、奎寧酸、5-氨基乙酰丙酸、D-4′-磷酸泛酸、D-甘油-2-磷酸酯等顯著下調(diào)，而吲哚乙醛、5-羥基吲哚乙酸、L-谷氨酰胺、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、N-乙酰天門冬氨酸等則顯著上調(diào)。

圖7 甲酸處理后酵母細(xì)胞內(nèi)顯著差異代謝物含量聚類圖Fig. 7 Cluster analysis of significantly differential metabolite contents in yeast cells after formic acid treatment

圖8 甲酸處理后酵母細(xì)胞內(nèi)顯著差異代謝物含量箱形圖Fig. 8 Box plot of significantly differential metabolite contents in yeast cells after formic acid treatment

代謝組分析表明，在甲酸脅迫下酵母細(xì)胞內(nèi)氧化型谷胱甘肽、半胱氨酰甘氨酸、L-谷氨酸以及檸檬酸的水平明顯降低。有研究表明，谷胱甘肽能夠還原活性氧自由基，生成氧化型谷胱甘肽以發(fā)揮抗氧化功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，并作為對抗活性氧的保護(hù) 劑[23-24]。此外，L-谷氨酸和半胱氨酸也能作為活性氧清除劑對抗氧化應(yīng)激[25-26]。有研究報道，半胱氨酸的添加可以促進(jìn)谷胱甘肽的合成[27-28]，甘氨酸也直接參與谷胱甘肽的合成[29]。本研究中，在甲酸影響下，處理組氧化型谷胱甘肽和半胱氨酰甘氨酸含量較對照組顯著下降，推測甲酸脅迫導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧積累，擾亂細(xì)胞氧化還原平衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，酵母細(xì)胞為維持細(xì)胞正常生長大量消耗谷胱甘肽，以抵御活性氧，從而避免細(xì)胞受到損傷。Jozefczuk等[30]研究發(fā)現(xiàn)，高溫、低溫等環(huán)境脅迫會導(dǎo)致碳中心代謝相關(guān)物質(zhì)含量的下降，這是細(xì)胞在抵抗脅迫下為降低能量消耗所采取的自我保護(hù)。而本研究中，在甲酸影響下，三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸的含量較對照組明顯降低，這也是酵母細(xì)胞采取保存能量的措施實現(xiàn)自我保護(hù)。此外，參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的中間體L-谷氨酸水平在甲酸脅迫下顯著下調(diào)，這可能是由于三羧酸循環(huán)的抑制間接導(dǎo)致L-谷氨酸的減少。在谷氨酸脫氫酶作用下三羧酸循環(huán)中的α-酮戊二酸可轉(zhuǎn)化為谷氨酸，同時還可以使L-谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸，并生成還原型輔酶II和ATP。因此，推測酵母細(xì)胞可能通過L-谷氨酸分解代謝提供能量和還原力抵抗甲酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致L-谷氨酸的含量降低。在氨酰基tRNA的生物合成途徑中，用于tRNA連接的L-氨基酸含量普遍下降。氨?；鵷RNA合成途徑在蛋白質(zhì)合成中具有至關(guān)重要的作用，可能與細(xì)胞生長代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)。Weber等[31]研究發(fā)現(xiàn)在環(huán)境脅迫條件下，為降低能量損耗實現(xiàn)自我保護(hù)，與細(xì)胞生長、分裂以及蛋白合成相關(guān)的基因受到抑制。Dong Yachen等[32]也發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母在醋酸脅迫下其與氨基酸生物合成相關(guān)的代謝物水平均明顯下調(diào)，從而保護(hù)細(xì)胞免受醋酸損傷。由此猜測，甲酸脅迫可引起酵母細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)氨基酸匱乏，使得氨酰基tRNA生物合成底物不足，蛋白質(zhì)生物合成受阻，細(xì)胞生長受到抑制，而酵母細(xì)胞通過下調(diào)氨基酸代謝通路降低能量需求，維持碳氮代謝平衡，使其在逆境中得以存活。

此外，氨基酸的積累有利于細(xì)胞抵抗低溫、高溫和氧化脅迫[29]。代謝組分析表明，甲酸脅迫下酵母細(xì)胞中色氨酸代謝通路發(fā)生顯著改變，通路中吲哚乙醛、5-羥基吲哚乙酸、L-色氨酸代謝產(chǎn)物全部呈上調(diào)趨勢，而黃嘌呤酸、2,3-吡啶二甲酸含量呈下調(diào)趨勢，表明色氨酸代謝通路在甲酸脅迫過程中發(fā)揮重要作用。此外，處理組芳香族氨基酸L-苯丙氨酸水平較對照組也顯著上調(diào)。有研究表明，在色氨酸生物合成途徑突變體中，通過向培養(yǎng)基中添加高水平色氨酸，或者過表達(dá)Tat2p高親和力的色氨酸通透酶來抑制這種弱酸超敏性[33]。Ding Mingzhu等[34]研究表明氨基酸的積累能提高細(xì)胞的耐受性主要是因為氨基酸能穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。此外，還可能是由于甲酸脅迫導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)不正常的蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞需要自我調(diào)節(jié)以增加對這些不正常蛋白質(zhì)的降解[35]。有研究表明，芳香族氨基酸可以通過形成疏水區(qū)域保護(hù)蛋白質(zhì)免受膽汁脅迫[36]，游離芳香族氨基酸（色氨酸和苯丙氨酸）可能通過減少汞誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生促進(jìn)植物對汞脅迫的反應(yīng)[37]。因此推測，甲酸脅迫也可能通過積累活性氧誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，芳香族氨基酸通過形成疏水區(qū)域并減少活性氧的產(chǎn)生協(xié)助抵抗甲酸脅迫，從而提高甲酸的耐受性，但是具體機(jī)制尚待進(jìn)一步探索。

核苷酸是細(xì)胞生長和繁殖所必需的基本物質(zhì)，它不僅可以作為DNA和RNA合成的前體，而且在代謝中也扮演著重要角色，可作為生理、生化過程的調(diào)節(jié)物質(zhì)參與體內(nèi)物質(zhì)代謝[38]。核苷酸代謝與氨基酸代謝有著密切的聯(lián)系，共有代謝物有5′-磷酸核糖焦磷酸、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸、四氫葉酸等，甲酸影響氨基酸代謝，必然也會影響細(xì)胞內(nèi)核苷酸代謝。代謝組分析表明，在甲酸脅迫下酵母細(xì)胞內(nèi)嘌呤代謝和嘧啶代謝相關(guān)的代謝物受到嚴(yán)重抑制，其含量普遍較對照組顯著降低。如圖7B和圖8所示，鳥苷、肌苷、腺苷琥珀酸酯、腺苷琥珀酸、黃嘌呤、尿嘧啶、尿苷、胞苷-5′-磷酸、DTMP等水平顯著下調(diào)，而谷氨酰胺和5′-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰胺水平顯著上調(diào)。

嘌呤和嘧啶是細(xì)胞內(nèi)核苷酸代謝的重要組成部分，同時核苷酸的合成大多數(shù)都需要耗能，如嘌呤代謝的從頭合成途徑中合成1 分子次黃嘌呤核苷酸需要消耗5 分子ATP和6個高能磷酸鍵，合成AMP或GMP又需要消耗1 分子ATP。鳥苷、肌苷、腺苷琥珀酸酯、腺苷琥珀酸、黃嘌呤水平較對照組顯著下調(diào)，表明這些物質(zhì)參與嘌呤代謝的補(bǔ)救途徑；參與嘧啶代謝的尿嘧啶、尿苷、胞苷-5′-磷酸、DTMP水平也有所下調(diào)，這些代謝物的合成過程也需要消耗能量，而甲酸的存在造成胞內(nèi)ATP生成受損及消耗增加，可見酵母細(xì)胞選擇減少核苷酸代謝的生物合成，降低能量消耗來提高對甲酸的耐受性。此外，參與核苷酸合成途徑的相關(guān)代謝物水平普遍下調(diào)，也可能是由于甲酸抑制了酵母細(xì)胞DNA的生物合成，進(jìn)而影響了細(xì)胞的正常生長。

添加甲酸后酵母細(xì)胞內(nèi)L-谷氨酰胺和5′-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰胺含量急劇增加。已有研究報道，L-谷氨酰胺在氮的分解代謝和合成代謝過程中扮演重要角色，同時它也是細(xì)胞內(nèi)氮的主要來源[39-40]。另外，谷氨酰胺也是其他氨基酸和核苷酸生物合成的前體物質(zhì)[41]。因此推測，酵母細(xì)胞可能會通過合成更多的前體物質(zhì)保護(hù)細(xì)胞免受甲酸脅迫。5′-磷酸核糖基-N-甲酰甘氨酰是一種非常弱的堿性化合物，主要以磷酸核糖甲?；拾滨０泛厦傅牡孜铮鳛猷堰屎塑账釓念^合成過程中的中間產(chǎn)物，由甘氨酸參入5′-磷酸核糖胺而形成，在嘌呤代謝以及谷氨酰胺向谷氨酸的轉(zhuǎn)化中具有重要作用。這兩種物質(zhì)在酵母細(xì)胞內(nèi)積累可能也有助于提高細(xì)胞耐受性，但是具體機(jī)理還需要后期進(jìn)一步驗證。

3 結(jié) 論

通過基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究釀酒酵母響應(yīng)甲酸脅迫的代謝機(jī)制。研究結(jié)果表明，氨基酸，尤其是L-色氨酸、L-苯丙氨酸、谷氨酰胺、5-羥基吲哚乙酸、吲哚乙醛，以及核苷酸等代謝物在甲酸脅迫過程中發(fā)生顯著改變，可能在釀酒酵母應(yīng)對甲酸脅迫過程中起關(guān)鍵作用。甲酸脅迫可能導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)活性氧過度積累，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，擾亂酵母細(xì)胞的能量代謝和氧化還原平衡狀態(tài)，導(dǎo)致酵母細(xì)胞內(nèi)ATP合成受損及消耗增加，同時致使細(xì)胞內(nèi)氨基酸匱乏，氨酰基tRNA生物合成的底物不足，進(jìn)一步抑制蛋白質(zhì)的生物合成，影響細(xì)胞正常生長，使其存活率下降。胞內(nèi)芳香族氨基酸水平的上調(diào)以及部分氨基酸和核苷酸的合成代謝減慢可以降低能量的消耗，實現(xiàn)自我保護(hù)，從而有助于提高酵母細(xì)胞對甲酸的耐受性。本研究初步揭示了釀酒酵母響應(yīng)甲酸脅迫的分子機(jī)制，后期將進(jìn)一步驗證差異代謝物在甲酸脅迫過程中的作用。