張璐璐，范 剛*，李 曉，任婧楠，潘思軼，黃 文，何 進

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室， 湖北 武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070）

指狀青霉（Penicillium digitatum）不僅是導(dǎo)致柑橘類水果發(fā)生綠霉病的主要真菌[1]，同時也是一種具有廣闊應(yīng)用前景的微生物資源，能夠?qū)r廉而豐富的原材料轉(zhuǎn)化生成更有經(jīng)濟價值的產(chǎn)物。其中，指狀青霉DSM62840具有轉(zhuǎn)化單萜類化合物檸檬烯的能力，能夠?qū)幟氏┺D(zhuǎn)化生成香氣更濃、應(yīng)用更為廣泛、商業(yè)價值更高的香料α-松油醇[2-4]。

近些年來，有關(guān)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-松油醇的研究已經(jīng)取得了不少有意義的成果，主要集中在菌種的篩選[5-8]、轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化[9-11]及影響轉(zhuǎn)化的原因等方面[4,12]。 但是由于在轉(zhuǎn)化過程中底物對微生物的抑制作用以及產(chǎn)物的分離問題，使得檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的工業(yè)應(yīng)用仍然受到一定的限制。其中分離純化酶制劑成為一個有效的方法，不僅可以解決以上這些問題，還可以提高反應(yīng)的生物轉(zhuǎn)化率和立體選擇性，最大限度地減少產(chǎn)物異構(gòu)體和對映體的產(chǎn)生[13]。然而，目前對檸檬烯微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-松油醇過程中關(guān)鍵酶的研究還不夠深入，仍然停留在推測階段，相關(guān)的研究還非常少。因此，涉及在檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-松油醇過程中的關(guān)鍵酶仍然不清楚。

本實驗室前期對檸檬烯轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵酶的性質(zhì)進行了初步研究，結(jié)果表明CYP450抑制劑（SKF-525A）和金屬蛋白酶抑制劑（鄰二氮菲）能夠明顯抑制檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程[14]，并且檸檬烯誘導(dǎo)處理能夠顯著增加該酶的活性，說明檸檬烯轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶可 誘導(dǎo)[4,15]。此外還通過離心沉淀法分離各亞細(xì)胞組分，進行了酶的定位實驗，研究結(jié)果表明該酶存在于微粒體中，并且添加去垢劑能夠促進酶的溶解和增強酶的活性[14]。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，本實驗以指狀青霉DSM62840為研究對象，通過超速離心獲得微粒體部分，采用硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析、凝膠過濾層析和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）等方法，對指狀青霉DSM62840生物轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇過程中的關(guān)鍵酶進行分離純化和鑒定，旨在為α-松油醇類香料的合成提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指狀青霉DSM62840購自德國微生物菌種保藏中心；指狀青霉DSM62840液體培養(yǎng)基麥芽酵母肉湯（malt yeast broth，MYB）：酵母提取物3 g/L，麥芽提取物20 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖10 g/L。

R-(+)-檸檬烯 東京化工有限公司；R-(+)-α-松油醇 美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF） 上海麥克林生化科技有限公司； 40%丙烯酰胺、四甲基乙二胺（N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine，TEMED） 北京莊盟國際生物基因科技有限公司；十二烷基-β-D-麥芽糖苷（n-dodecyl-β-D-maltoside，DDM） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT） 上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；CHTTMCeramic羥基磷灰石（type I，20 μm） 美國Bio-Rad公司；SuperdexTM20010/300 GL 美國GE Healthcare公司；Q5 High-Fidelity DNA聚合酶 美國NEB 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TripleTOF 5600 LC-MS/MS聯(lián)用儀 美國SCIEX公司；凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc XR） 美國Bio-Rad 公司；AKTA pure L蛋白多糖分離純化儀 美國GE醫(yī)療集團；DYY-8C型電泳儀 北京六一儀器廠；高壓細(xì)胞破碎儀 廣州聚能納米生物科技股份有限公司；超速離心機 美國Beckman公司；6890N-5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的獲得

參照Zhang Lulu等[14]的方法。用1～2 周的指狀青霉DSM62840斜面培養(yǎng)物制取孢子懸浮液，調(diào)整孢子懸浮液的濃度為1.5×107spores/mL。取1 mL孢子懸浮液接種于100 mL MYB培養(yǎng)基中，24 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，真空抽濾得到菌體。用Buffer 1（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，含1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA）重新懸浮，然后再抽濾去除培養(yǎng)基成分，重復(fù)2 次。將洗滌好的菌體重新懸浮于Buffer 1中，約10 g菌體（濕質(zhì)量）溶解在100 mL的緩沖液中。在經(jīng)過高速分散器處理之后，4 ℃高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，次數(shù)為5 次，壓力為1 500 bar[16]。10 000×g離心20 min得到橙黃色的上清液，上清液再次重復(fù)離心得到F1組分，即去除線粒體的上清液。隨后，將獲得的F1溶液經(jīng)40 000×g離心90 min，去除上清液，沉淀則溶解在緩沖液Buffer 2（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，含1 mmol/L DTT、1 mmol/L PMSF、1 mmol/L EDTA、0.8% DDM）中，低速攪拌1 h之后，10 000×g離心40 min，上清液即為粗酶液。

1.3.2 硫酸銨沉淀

參照Mehta等[17]的方法。在粗酶液中，緩慢加入固體硫酸銨，使其飽和度為30%，充分?jǐn)嚢柚?，? ℃靜置3 h。10 000×g離心30 min，分別收集上清液和0%～30%的沉淀。然后在上清液中繼續(xù)添加固體硫酸銨，使其飽和度達到60%，充分?jǐn)嚢柚螅? ℃靜置3 h。10 000×g離心30 min，分別收集上清液和30%～60%的沉淀。然后在上清液中繼續(xù)添加固體硫酸銨，使其飽和度達到90%，充分?jǐn)嚢柚螅? ℃靜置3 h。10 000×g離心30 min，收集60%～90%的沉淀。將收集的硫酸銨飽和度為0%～30%、30%～60%和60%～90%的沉淀充分復(fù)溶于Buffer 2中，然后離心收集上清液，測定收集的每部分上清液中的酶活力。

將硫酸銨沉淀獲得的上清液裝入透析袋中，于4 ℃透析12 h除去硫酸銨，透析液使用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）8000濃縮后備用。

1.3.3 羥基磷灰石層析

將柱材料懸浮于3.5 倍體積的裝柱緩沖液（200 mmol/L的磷酸鹽）中，靜置，使封閉于填料顆粒中的空氣分離出來。先將裝柱緩沖液灌入層析柱中大約1～2 cm，然后將處理好的柱材料緩慢的裝入層析柱中，打開出口，重力下流，直至高度恒定，關(guān)閉層析柱出口。與AKTA蛋白純化儀連接，用3 倍柱體積的裝柱緩沖液平衡洗脫后備用。

用5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）洗脫平衡至UV和cond不變，取一定量經(jīng)過透析濃縮后的酶溶液上樣，然后分別用5、200 mmol/L和500 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（緩沖液中均含有0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）進行梯度洗脫，每個梯度洗脫3個柱體積，流速為1 mL/min，分管收集，每1.5 min收集1 管。測定收集的每管洗脫液中的酶活力，濃縮后備用。

在純化結(jié)束之后，柱子用500 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗3～5個柱體積進行再生處理，最后保存在0.1 mol/L NaOH溶液中。

1.3.4 凝膠過濾層析

使用SuperdexTM200 10/300 GL預(yù)裝柱進行蛋白分離純化。將層析柱連接AKTA蛋白純化儀之后，用20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）洗脫平衡至UV和cond不變，取一定量經(jīng)過透析濃縮后的酶溶液上樣，采用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（含0.1 mmol/L DTT、0.08% DDM）洗脫，洗脫流速為0.5 mL/min，分管收集，每管1 mL。測定收集的每管洗脫液中的酶活力，濃縮后備用。

1.3.5 檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-松油醇過程中關(guān)鍵酶活力的測定

參照Zhang Lulu等[14]的方法。取1 mL蛋白溶液與840 mg/L檸檬烯溶液于2 mL離心管中混合均勻，24 ℃、150 r/min反應(yīng)12 h，然后立即取出置于4 ℃終止反應(yīng)。采用固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）-GCMS測定關(guān)鍵酶活力。實驗重復(fù)3 次。

SPME-GC-MS測定：取反應(yīng)液裝入30 mL萃取瓶中，于磁力攪拌器40 ℃加熱平衡15 min后，插入己活化好的50/30 pmDVB/CAR/PDMS的SPME萃取頭（250 ℃活化15 min），推出纖維頭，頂空吸附40 min后，插入GC-MS進樣口解吸5 min。

GC條件：毛細(xì)管柱為HP-5（30 m×320 μm，0.25 μm），程序升溫，起始溫度40 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min升至220 ℃，保持3 min。進樣口溫度250 ℃，氫火焰離子檢測器溫度250 ℃。

MS條件：離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子化方式為電子電離，電子能量70 eV，質(zhì)量范圍為45～550 u/s。

使用計算機譜（NIST05/WILE7.0）和α-松油醇標(biāo)品進行定性分析。采用外標(biāo)法對α-松油醇的含量進行定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=131 423x+2×106（R2=0.999），其中x為α-松油醇質(zhì)量濃度（mg/L），y為峰面積。

酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每小時產(chǎn) 生1 mg/Lα-松油醇定義為一個酶活力單位（U）。

1.3.6 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

參照Laemmli等[18]的方法，采用12%分離膠與5%濃縮膠進行蛋白的SDS-PAGE分析，上樣量為30 μL，恒壓100 V進行電泳，當(dāng)指示劑到達距前沿1 cm時，終止電泳。電泳結(jié)束后，染色液過夜染色，然后脫色液進行脫色，每隔3 h換一次脫色液，直到蛋白條帶清晰為止。

1.3.7 LC-MS/MS分析

1.3.7.1 樣品處理

挖取SDS-PAGE中蛋白所在的區(qū)域，切成1 mm3左右的小塊；加入超純水浸沒膠塊，振蕩10 min后，吸去洗液；用50%乙腈-100 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）溶液將膠塊浸沒，振蕩10 min，吸去洗液，重復(fù)該過程共3 次；加入100%乙腈浸沒膠塊，振蕩10 min，吸去洗液，然后把膠塊在真空抽干儀中抽干；向膠塊中加入10 mmol/L DTT-50 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）溶液，56 ℃孵育1 h進行還原反應(yīng)，之后吸去浸液；隨后加入55 mmol/L碘乙酰胺-50 mmol/L NH4HCO3（pH 8.0）溶液，置于室溫、暗處反應(yīng)30 min，之后吸去浸液；加入100%乙腈，振蕩20 min，吸去浸液，抽干膠塊；向膠塊中加入適量的胰蛋白酶，并補加50 mmol/L NH4HCO3溶液以完全覆蓋膠塊，37 ℃孵育過夜進行酶切；然后加入抽提液60%乙腈-5%甲酸，超聲波振蕩10 min，離心后吸取上清液至新的離心管；重復(fù)抽提過程2 次后，合并抽提液，在離心濃縮儀中抽干；使用C18小柱進行肽段除鹽，凍存于-20 ℃等待上機檢測。

1.3.7.2 MS檢測

使用SCIEX公司的TripleTOF 5600 LC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)進行[19]。肽段樣品通過自動進樣器吸入后結(jié)合至C18捕獲柱（5 mm×0.3 mm，5 μm），接著被洗脫至分析柱（75 μm×150 mm，3 μm，100 ?）進行分離。利用2個流動相（流動相A：0.1%甲酸溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液）建立30 min的分析梯度（0～15 min，95%～65% A、5%～35% B；15～16 min，65%～20% A、 35%～80% B；16～21 min，20% A、80% B；21～21.1 min，20%～95% A、80%～5% B；21.1～30 min，95% A、5% B）。LC流速設(shè)置為 300 nL/min。MS IDA模式分析時，每個掃描循環(huán)中包含一個MS全掃描（m/z350～1 500，離子累積時間250 ms），以及隨后的40個MS/MS掃描 （m/z100～1 500，離子累積時間50 ms）。MS/MS采集的條件設(shè)置為母離子信號大于120 cps，電荷數(shù)為+2～+5。 離子重復(fù)采集的排除時間設(shè)置為18 s。

1.3.7.3 數(shù)據(jù)庫檢索

TripleTOF 5600產(chǎn)生的MS數(shù)據(jù)通過ProteinPilot（V4.5）進行檢索，采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法是Paragon[20-21]。檢索使用的數(shù)據(jù)庫是UniProt中Penicillium digitatum的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫。檢索參數(shù)如下：Sample Type選Identification；Cys Alkylation選Iodoacetamide；Digestion選Trypsin；Search Effort設(shè)置為Rapid ID。檢索結(jié)果以Unused≥1.3為標(biāo)準(zhǔn)進行篩選，刪去反庫中檢索的條目和污染蛋白，余下的鑒定信息用作后續(xù)分析[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均至少重復(fù)3 次以上，采用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)分析、Origin 8.5進行繪圖，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨沉淀

菌體經(jīng)過高壓破碎、超速離心之后，獲得的微粒體部分，即為粗酶液。將粗酶液進行硫酸銨沉淀，如圖1所示，在硫酸銨飽和度為0%～30%時，收集到的沉淀很少，復(fù)溶之后，檢測不到酶活力。在硫酸銨飽和度為30%～60%時，有大量的蛋白被沉淀，并且將沉淀復(fù)溶之后，酶活力為442.73 U/mL。在硫酸銨飽和度為60%～90%時，也有大量的蛋白被沉淀，但將沉淀復(fù)溶之后，檢測不到酶活力。因此，選擇硫酸銨的飽和度為30%～60%進行蛋白的富集。將所得到的蛋白沉淀進行復(fù)溶，離心，取上清液，透析濃縮后用于羥基磷灰石層析。

圖1 硫酸銨沉淀曲線Fig. 1 Ammonium sulfate precipitation curves

2.2 羥基磷灰石層析

如圖2所示，共有2個蛋白洗脫峰被檢出，其中第1個蛋白洗脫峰沒有檢測到酶活力，而第2個蛋白洗脫峰有較高的酶活力，說明第2個洗脫峰中含有轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇的關(guān)鍵酶，因此收集對應(yīng)的餾分用于凝膠過濾層析。

圖2 羥基磷灰石純化曲線Fig. 2 Elutions curves of hydroxyapatite chromatography

2.3 凝膠過濾層析

如圖3所示，在洗脫液中共檢測到3個蛋白洗脫峰，其中第1個蛋白洗脫峰有較高的酶活力，可以轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-松油醇，說明檸檬烯轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶是存在于這部分洗脫液中。因此，收集該部分餾分做進一步分析。

圖3 凝膠過濾純化曲線Fig. 3 Elution curves of gel filtration chromatography

2.4 SDS-PAGE分析

將通過上述一系列純化步驟收集到的洗脫液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)經(jīng)過電泳、染色、脫色等處理之后，得到SDSPAGE譜圖，結(jié)果見圖4。在泳道6中存在1 條明顯的蛋白條帶，分子質(zhì)量在45～60 kDa之間，并且該條帶在泳道2～5中也比較明顯，因此推測該條帶中蛋白可能參與調(diào)控檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程。

圖4 純化蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 4 SDS-PAGE profile of purified proteins

2.5 LC-MS/MS分析

為了進一步確定圖4泳道6中的蛋白，將泳道6中箭頭所指處的條帶挖出，通過LC-MS/MS檢測樣品中的蛋白質(zhì)組成。將樣品中提取的蛋白質(zhì)經(jīng)過還原、烷基化、酶解變?yōu)殡亩位旌衔铮缓笤俳?jīng)過電噴霧進入MS進行掃描，得到MS譜圖，最后通過相關(guān)的軟件解析這些MS圖得到樣品中蛋白質(zhì)的定性或定量信息。

2.5.1 質(zhì)量控制

如圖5A所示，橫坐標(biāo)表示各鑒定肽段質(zhì)量偏差，即MS檢測質(zhì)量與肽段理論質(zhì)量的偏差?？v坐標(biāo)表示各條形區(qū)間內(nèi)肽段總數(shù)目。結(jié)果表明各肽段質(zhì)量偏差都在2×10-5以內(nèi)，說明MS檢測精度良好。

圖5 質(zhì)量控制分析Fig. 5 Analysis of quality control

本實驗所用儀器檢測m/z范圍為350～1 350。肽段離子化后大部分電荷數(shù)為2或3。各鑒定肽段長度如圖5B所示，大部分肽段長度分布在8～20個氨基酸殘基之間，符合胰蛋白酶酶切規(guī)律，有利于MS檢測。

各肽段漏切位點如圖5C所示，結(jié)果表明大部分肽段無漏切位點，少量肽段有1個或2個漏切位點，表明酶切充分，樣品制備達標(biāo)。

2.5.2 數(shù)據(jù)總覽

通過MS鑒定和分析，從泳道6中的條帶共鑒定得到87個蛋白。基于蛋白豐度越高，采集的譜圖數(shù)越多的經(jīng)驗，可以根據(jù)譜圖數(shù)的多少大致反映蛋白在樣品中豐度高低。因此，選擇譜圖數(shù)前10的蛋白，如表1 所示。在該條帶中，蛋白豐度最高的蛋白被鑒定為PDIDSM_08010（二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase，DLD），EC 1.8.1.4），分子質(zhì)量為54.36 kDa，該蛋白對應(yīng)的二級MS圖數(shù)有204個。結(jié)合SDS-PAGE膠上條帶顯示的蛋白，推測該條帶中的蛋白可能為DLD。

表1 MS鑒定結(jié)果Table 1 Results of LC-MS/MS identification

結(jié)合實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)，進一步分析DLD在檸檬烯轉(zhuǎn)化過程中mRNA的表達量和蛋白的表達量（指狀青霉DSM62840轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)已經(jīng)被上傳至NCBI’s Sequence Read Archive，收錄號為PRJNA608617；指狀青霉DSM62840蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)已經(jīng)被上傳至iProX數(shù)據(jù)庫，收錄號為PXD017752），結(jié)果如表2所示。DLD在轉(zhuǎn)錄水平上的表達量略微下調(diào)，在蛋白水平上的表達量略微上調(diào)。DLD屬于pyridine nucleotide disulfide oxdoreductase family，該家族還包括谷胱甘肽還原酶、汞還原酶、硫氧還蛋白以及錐蟲胱甘肽還 原酶[22]。DLD通常是以二聚體的形式存在的，每個亞基上都帶有一個活性的二硫鍵和一個非共價結(jié)合的黃素輔基。DLD是一種NAD+依賴的氧化還原酶，能夠催化二氫脂酰部分發(fā)生氧化反應(yīng)。它是丙酮酸脫氫酶復(fù)合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物（ketoglutarate dehydrogenase complex，KGDC）的亞基，PDC和KGDC在生物的能量代謝途徑中起非常重要的催化作用。PDC作為代謝的看門人，決定葡萄糖的命運，而KGDC是電子傳遞鏈和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)的主要介體，在代謝過程中起主要作用[23]。此外，DLD也是甘氨酸裂解系統(tǒng)的一部分，具有黃遞酶活性。

3 討 論

近些年來，有關(guān)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-松油醇的研究已經(jīng)取得了不少有意義的成果，但是有關(guān)轉(zhuǎn)化過程中關(guān)鍵酶分離純化的研究還鮮見報道。其中，利用傳統(tǒng)的蛋白分離純化技術(shù)獲得與檸檬烯轉(zhuǎn)化相關(guān)的蛋白是一種最常用的方法。研究指出，在紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolisDCL14）中不僅存在檸檬烯C1,2位環(huán)氧化反應(yīng)，也存在C6位羥基化反應(yīng)。研究人員利用凝膠過濾層析、羥基磷灰石層析以及離子交換層析，先后從該菌株中分離純化得到檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物酶和香芹醇脫氫酶，分別能夠轉(zhuǎn)化檸檬烯生成檸檬烯-1,2-環(huán)氧化物和羥基化香芹醇生成香芹酮[24-25]。Van Beilen等[26]通過硫酸銨沉淀、疏水相互作用層析和離子交換層析等方法從分枝桿菌（Mycobacteriumsp.strain HXN-1500）中分離得到CYP153A6，該蛋白能夠催化檸檬烯生成紫蘇醇。Cadwallader等[27]通過蔗糖梯度離心和凝膠柱層析相結(jié)合的方法從唐菖蒲假單胞菌（Pseudomonas gladioli）中分離純化得到α-松油醇脫氫酶，該酶可以將檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇，但研究人員并沒有對該酶進行測序分析和MS鑒定。在本研究的前期工作中，嘗試了各種純化方法對微生物轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶進行分離純化，如蔗糖梯度離心、PEG沉淀、DEAE-Sepharose FF以及疏水相互作用層析等。其中DEAE-Sepharose FF和疏水相互作用層析均不能有效對檸檬烯轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶進行分離純化，而蔗糖梯度離心雖然能夠?qū)D(zhuǎn)化過程中的蛋白進行一定程度的分離純化，但純化效果不佳。在40 000×g離心8 h之后，蔗糖質(zhì)量濃度分別為50、45、40、35 g/100 mL和30 g/100 mL的溶液中，均能夠檢測到酶活力（數(shù)據(jù)未展示）。此外，還使用0%～7%、7%～15%、15%～20% PEG進行分級沉淀，結(jié)果顯示7%～15% PEG能夠有效對微生物轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶進行富集（數(shù)據(jù)未展示），但考慮到后續(xù)去除PEG的問題，最終選擇了硫酸銨進行初步的分離。

在實驗過程中，首先通過高壓破碎細(xì)胞，然后超速離心獲得微粒體部分，最后采用30%～60%的硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析對轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶進行分離純化。對各部分的流出液進行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約為50 kDa處有一條明顯的蛋白條帶。隨后，對該條帶進行LC-MS/MS分析，得出該條帶中的蛋白可能是DLD。推測DLD可能參與調(diào)控檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化，但在該轉(zhuǎn)化過程中，可能還有其他蛋白的參與。研究指出，在檸檬烯轉(zhuǎn)化生成α-松油醇的過程中，檸檬烯可能先發(fā)生環(huán)氧化生成檸檬烯-8,9-環(huán)氧化物，然后環(huán)裂解生成α-松油醇[28]。這說明在檸檬烯轉(zhuǎn)化的過程中，可能不止一個蛋白參與，很有可能是多個酶共同作用的結(jié)果。

DLD能夠以NAD+為輔基接受質(zhì)子和電子。DLD是PDC和KGDC產(chǎn)生線粒體活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的主要來源。在不同脅迫條件下，DLD可能誘導(dǎo)或減弱ROS的產(chǎn)生。DLD不僅參與TCA循環(huán)中的能量代謝，還與線粒體中ROS的生成和清除有關(guān)[29]。在本課題組之前的研究也發(fā)現(xiàn)，微生物轉(zhuǎn)化過程中，檸檬烯處理可能會誘導(dǎo)指狀青霉DSM62840發(fā)生嚴(yán)重的膜脂過氧化損傷，產(chǎn)生過量ROS，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的流動性和通透性，降低ATP含量，從而抑制TCA循環(huán)和指狀青霉DSM62840菌絲體的生長[14,30]。此外，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在檸檬烯轉(zhuǎn)化的過程中，DLD表達量下降。研究發(fā)現(xiàn)降低DLD的表達能夠增加ROS的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，增加NAD+/NADH比值，減少TCA循環(huán)中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致TCA循環(huán)異常和造成線粒體氧化損傷[31]。并且Midzak等[32]研究發(fā)現(xiàn)DLD能夠通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的ATP、ROS、第2信使cAMP、鈣離子水平來調(diào)節(jié)類固醇激素的合成。因此，推測DLD可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的ATP含量、ROS等調(diào)節(jié)檸檬烯的微生物轉(zhuǎn)化過程。未來需要對DLD的功能進行進一步的研究。

4 結(jié) 論

以指狀青霉DSM62840為研究對象，首先通過高壓破碎細(xì)胞，然后超速離心獲得微粒體部分，最后通過30%～60%的硫酸銨沉淀、羥基磷灰石層析和凝膠過濾層析對指狀青霉DSM62840轉(zhuǎn)化檸檬烯生產(chǎn)α-松油醇過程中的關(guān)鍵酶進行分離純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示在分子質(zhì)量約為50 kDa處有1 條明顯的蛋白條帶。通過LC-MS/MS鑒定，該蛋白可能是DLD，推測其可能參與調(diào)控檸檬烯生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-松油醇的過程。