劉冠男，胡 淼，杜曉倩，謝鳳英，齊寶坤,*，李 楊,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是植物蛋白質(zhì)的重要來(lái)源，可提供包括賴氨酸在內(nèi)的多種必需氨基酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。SPI可以經(jīng)堿溶酸沉法提取，主要成分是儲(chǔ)藏蛋白，即7S和11S球蛋白，占總蛋白的65%～80%[1]。由于SPI具有營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格低廉、加工性能好等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛用于各類(lèi)食品中，主要包括“人造肉”[2]、發(fā)酵類(lèi)食品[3]、凝膠類(lèi)食品[4]等，具有相當(dāng)高的消費(fèi)者接受度。由于SPI致密的球狀結(jié)構(gòu)、低分子柔性以及其在油水界面吸附性不良而導(dǎo)致乳化性等功能性質(zhì)不理想[1]。因此，許多方法被用來(lái)改變SPI的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象以及聚集狀態(tài)以提高其功能性。

蛋白質(zhì)化學(xué)修飾具有效率高、可控性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以改善蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和功能性質(zhì)，與物理修飾和酶修飾相比，更易于大規(guī)模生產(chǎn)[5]。琥珀?；浅Ｒ?jiàn)修飾蛋白質(zhì)的手段，通過(guò)用琥珀?；揎椀鞍踪|(zhì)的氨基（賴氨酸、精氨酸）、羥基和巰基改變蛋白質(zhì)的帶電狀態(tài)，調(diào)控蛋白質(zhì)表面電荷密度[6-7]。Mirmoghtadaie等[8]研究表明，?；档土搜帑湹鞍椎某炙芰?，提高了燕麥蛋白的乳化性和溶解性。Shilpashree等[9]報(bào)道了琥珀?；罄业鞍姿徕c的溶解度、黏度和乳化性均能得到改善。Wan Yangling等[10]研究指出琥珀?；梢蕴岣叽蠖沟鞍椎臒岱€(wěn)定性，抑制蛋白在高溫下的熱聚集。由此可見(jiàn)，?；男钥梢蕴岣叩鞍兹芙庑?、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)。蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變與功能性質(zhì)的改善息息相關(guān)[11]。然而，相關(guān)研究?jī)H停留于琥珀酰化改性對(duì)蛋白功能性質(zhì)的影響，關(guān)于琥珀酰化調(diào)控SPI表面電荷密度對(duì)其構(gòu)象影響的研究鮮有報(bào)道，且酰化SPI調(diào)控電荷密度使其構(gòu)象改變與乳化性改善的關(guān)系還有待進(jìn)一步探索。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究琥珀?；{(diào)控SPI電荷密度對(duì)其構(gòu)象以及乳化性的影響，探究?；鞍讟?gòu)象變化和乳化性改善之間的關(guān)系。利用不同濃度的琥珀酸酐對(duì)SPI改性，采用電位、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）、掃描電子顯微鏡、熒光光譜、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜等方法表征?；鞍讟?gòu)象與乳化性之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)旨在為琥珀酰化改性在蛋白修飾方面的應(yīng)用提供理論參考，并為高功能性大豆蛋白產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)-42） 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所；琥珀酸酐（丁二酸酐，色譜純≥99%）；透析袋（截流分子質(zhì)量7 kDa）；茚三酮 上海源葉生物科技有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（1-anilino-8-naphthalene sulfonate，ANS） 美國(guó)Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 江蘇金城國(guó)勝儀 器廠；Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼 公司；PHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 中國(guó)上海雷磁公司；mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國(guó)Bio-Rad-Laboratories公司；Zetasize nanozs 90型粒度電位儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；SU801場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡、RF-6000熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；UV-2600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

采用堿溶酸沉的方法[12]。選擇新鮮無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉?fàn)€、無(wú)破損的大豆破碎磨粉，過(guò)60 目篩，并用正己烷脫脂。將脫脂大豆粉分散于去離子水中并使之充分溶解，料液比為1∶10（g/mL），并用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 8.0，室溫下攪拌2 h，4 ℃、9 000×g離心30 min，收集上清液，用2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5，靜置1 h，4 ℃、6 500×g離心30 min，收集沉淀。用去離子水將沉淀水洗3 次后調(diào)pH 7.0，去除不溶物，將蛋白溶液冷凍干燥得到SPI。

1.3.2 琥珀?；男許PI

參考Wan Yangling等[10]的方法并稍作修改。準(zhǔn)確稱取一定量的SPI溶于去離子水中配制成2.5 g/100 mL SPI懸浮液，在室溫下攪拌2 h使其充分溶解，用2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH 8.0。將琥珀酸酐緩慢加入到SPI溶液中，酸酐與SPI的質(zhì)量比分別為0.02∶1、0.05∶1、0.10∶1、0.15∶1，獲得4個(gè)不同酰化程度的SPI樣品。在加入琥珀酸酐的過(guò)程中，用2 mol/L的NaOH溶液使整個(gè)反應(yīng)體系pH值穩(wěn)定在8.0±0.2。當(dāng)pH值穩(wěn)定于8.0時(shí)，將溶液在室溫下再攪拌1 h，然后將所得液體放入4 ℃冰箱透析24 h去除未反應(yīng)的小分子琥珀酸酐和鹽，冷凍干燥后得到4種不同?；鹊腟PI粉末，分別將其命名為SSPI-1、SSPI-2、SSPI-3、SSPI-4。

1.3.3 ?；鹊臏y(cè)定

根據(jù)Pan Yi等[13]的方法稍作修改。分別將1 g/100 mL的蛋白溶液和2 g/100 mL的茚三酮溶液各1 mL混合，將混合液在沸水浴中加熱10 min，然后快速冷卻至室溫。向冷卻的混合液中加入5 mL去離子水。隨后在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的吸光度。根據(jù)式（1）計(jì)算SPI的 ?；龋?/p>

式中：A0與A1分別為?；臀歹；鞍椎奈?光度。

1.3.4 Zeta電位測(cè)定

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液將SPI/SSPI溶液（10 mg/mL）調(diào)整至pH 3～7，利用Zetasize nanozs 90型粒度電位儀測(cè)定不同pH值條件下不同樣品的Zeta電位，測(cè)定溫度25 ℃、平衡時(shí)間2 min。

1.3.5 SPI/SSPI的微觀結(jié)構(gòu)觀察

使用SU8010場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)SPI/SSPI的表面形貌進(jìn)行觀察。將樣品均勻平攤在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金處理，觀察成像時(shí)加速電壓5 kV，觀測(cè)倍數(shù)為1 000。

1.3.6 SDS-PAGE分析

參考Qi Baokun等[14]的方法對(duì)SPI/SSPI進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)。分別配制12%分離膠以及5%濃縮膠，將6 mg/mL的SPI/SSPI與上樣緩沖液混合均勻后煮沸90 s，冷卻至室溫上樣。開(kāi)始電泳時(shí)電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V；電泳結(jié)束后，取出膠片加入染色液染色30 min，之后再用脫色液脫色后進(jìn)行分析。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜分析

采用RF-6000熒光分光光度計(jì)測(cè)定SPI/SSPI的內(nèi)源性熒光。將SPI和SSPI溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0），樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，掃描范圍290～400 nm。

1.3.8 紫外光譜分析

采用UV-2600型紫外分光光度計(jì)對(duì)SPI/SSPI進(jìn)行紫外吸收光譜采集。將SPI和SSPI溶解在10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0），樣品質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL，測(cè)定速率為中速，分辨率為0.5 nm，測(cè)定波長(zhǎng)范圍200～400 nm。

1.3.9 紅外光譜分析

采用IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜在室溫下記錄SPI/SSPI的紅外光譜。將樣品與溴化鉀混合，然后壓片。掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm-1。

1.3.10 表面疏水性測(cè)定

參考夏爽[15]的方法并作適當(dāng)修改。使用10 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制不同質(zhì)量濃度梯度SPI/SSPI溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）各4 mL，然后加入100 μL ANS溶液（8 mmol/L，pH 7.0），充分混合，并在黑暗條件下反應(yīng)15 min。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為470 nm，狹縫寬度均為5 nm，樣品的相對(duì)熒光強(qiáng)度值為樣品的熒光強(qiáng)度值與未加ANS溶液的樣品的熒光強(qiáng)度值之差。以樣品蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，樣品的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，計(jì)算所得曲線的初始斜率即為蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.11 分子柔性的測(cè)定

參考Pan Yi等[16]的方法并作適當(dāng)修改。將SPI和SSPI溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，配制1 mg/mL胰凝乳蛋白酶液，酶液溶于0.05 mol/L，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中。3 mL樣品與200 μL酶液混合，在38 ℃反應(yīng)10 min，然后加入3 mL質(zhì)量濃度為4 g/100 mL的三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，沉淀未消化的蛋白，4 ℃、4 000×g離心30 min，然后用紫外分光光度計(jì)在280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度表示分子柔性。

1.3.12 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參考Li Ting等[17]的方法并作適當(dāng)修改。配制5 mg/mL 的SPI/SSPI溶液，加入玉米油，油水比為1∶9，用高速剪切均質(zhì)機(jī)在12 000 r/min均質(zhì)1 min形成乳狀液，立即從距離乳狀液底部0.5 cm處取50 μL新鮮乳狀液分散于5 mL 0.1%的SDS溶液中，振蕩均勻后在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，記作A0，以相同的方法取均質(zhì)10 min后的乳狀液重復(fù)上述步驟，其吸光度記作A10。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）由式（2）、（3）計(jì)算：

式中：A0與A10分別為乳狀液在第0分鐘和第10分鐘的吸光度；DF為稀釋倍數(shù)（100）；θ為油相體積分?jǐn)?shù)0.2；L為比色皿厚度1 cm；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（5 mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果表示為±s。圖表制作采用OriginPro 8.5軟件，使用SPSS 23.0進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析和方差分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；潭燃半娢蛔兓?/h3>

酰化反應(yīng)的原理是?；噭ㄧ晁狒⒁宜狒龋┡c蛋白質(zhì)分子的游離氨基、羥基或巰基之間的親核取代反應(yīng)（圖1）[6-7]。由于賴氨酸pKa值低且位阻較弱，因此?；磻?yīng)主要發(fā)生在賴氨酸ε-氨基的位置[18]，氨基的酰化度表示為N-?；取．?dāng)大多數(shù)氨基被琥珀?；螅辶u基和巰基也開(kāi)始被琥珀?；?。

圖1 SPI與琥珀酸酐親核取代反應(yīng)基理Fig. 1 Nucleophilic substitution mechanism between SPI and succinic anhydride

不同酸酐-SPI質(zhì)量比的SPI酰化程度變化如圖2A所示，N-?；入S酸酐-SPI質(zhì)量比的增加而增加，酸酐-SPI質(zhì)量比為0.05∶1時(shí)，N-?；冗_(dá)77.82%。當(dāng)比值進(jìn)一步提高時(shí)，?；磻?yīng)的速率明顯下降。這一現(xiàn)象與Wan Yangling等[10]的發(fā)現(xiàn)一致，這可能是由于SPI的琥珀?；饔脧谋砻嬷鸩桨l(fā)生到內(nèi)部，琥珀酸酐首先與蛋白質(zhì)表面的氨基反應(yīng)，反應(yīng)速率快，當(dāng)酸酐的量進(jìn)一步增加時(shí)，蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致琥珀酸酐與蛋白質(zhì)內(nèi)部的氨基反應(yīng)，反應(yīng)速率下降。反應(yīng)速率的轉(zhuǎn)折發(fā)生在酸酐-SPI的質(zhì)量比等于0.05∶1時(shí)，此時(shí)N-?；冗_(dá)77.82%，因此推測(cè)約75%的賴氨酸殘基在SPI表面或附近，這部分基團(tuán)優(yōu)先被酰化，SPI結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致掩埋的氨基暴露和?；?/p>

琥珀?；鶊F(tuán)的引入會(huì)導(dǎo)致SPI等電點(diǎn)改變。SPI和SSPI在不同pH值條件下表面電荷的測(cè)定結(jié)果如圖2B所示。隨著pH值的提高，SPI和SSPI的Zeta電位呈下降趨勢(shì)。SPI屬于兩性電解質(zhì)，因此具有一定的pH值依賴性。當(dāng)pH值低于等電點(diǎn)時(shí)，基團(tuán)質(zhì)子化，氨基基團(tuán)使SPI帶正電。當(dāng)pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，基團(tuán)去質(zhì)子化，由于羧基基團(tuán)存在，SPI帶有負(fù)電荷[19]。隨著SPI琥珀?；潭鹊脑黾樱琒PI的等電點(diǎn)呈下降趨勢(shì)，由4.30依次下降到3.56、3.47、3.17、3.12，主要是由于琥珀?；鶊F(tuán)的引入使得帶正電荷的氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)閹ж?fù)電荷的琥珀酰基基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷密度，使得等電點(diǎn)移向更低的pH值，這與Wan Yangling[10]和Liu Guangyu[20]等的研究結(jié)果一致，從而證實(shí)了可通過(guò)引入琥珀?；鶊F(tuán)增強(qiáng)SPI的電負(fù)性。

圖2 不同酸酐-SPI比值的SPI?；潭龋ˋ）及SPI/SSPI的 Zeta電位隨pH值變化情況（B）Fig. 2 Degree of SPI succinylation as a function of acid anhydride to SPI ratio and zeta potential of SPI/SSPI as a function of pH

2.2 SPI/SSPI的微觀結(jié)構(gòu)

蛋白結(jié)構(gòu)與功能特性密切相關(guān)，研究其微觀結(jié)構(gòu)能更好地理解和闡明功能特性改善的原因。從圖3可以看出，SPI呈現(xiàn)光滑致密的無(wú)規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)[21]，SSPI仍呈現(xiàn)出無(wú)規(guī)則片狀結(jié)構(gòu)，但其光滑的表面出現(xiàn)一些小孔穴，這是因?yàn)殓晁狒cSPI發(fā)生反應(yīng)改變了SPI的微觀結(jié)構(gòu)。隨著N-?；鹊奶岣?，小孔穴的數(shù)量越來(lái)越多，這表明琥珀酸酐首先與蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基發(fā)生反應(yīng)。SSPI-3和SSPI-4表面小孔穴數(shù)量相差無(wú)幾，進(jìn)一步證明了SPI琥珀?；饔檬菑腟PI的表面到內(nèi)部逐步進(jìn)行，與2.1節(jié)結(jié)果一致。

圖3 SPI/SSPI的微觀結(jié)構(gòu)（×1 000）Fig. 3 Microstructure of SPI/SSPI (× 1 000)

2.3 SDS-PAGE分析

圖4顯示，相比較于SPI，SSPI的7Sα、α′和β亞基條帶略微上移并稍有變淺，SSPI-1和SSPI-2的泳道在75 kDa和100 kDa之間出現(xiàn)新的條帶，SSPI-3和SSPI-4的泳道在100 kDa出現(xiàn)新的條帶，這些現(xiàn)象說(shuō)明琥珀酰基基團(tuán)的加入改變了SPI的分子質(zhì)量，使得SPI中某些亞基分子質(zhì)量增加。Haug等[22]的研究也表明，琥珀?；笕芫福ㄒ环N僅含有一條肽鏈的蛋白質(zhì)）的分子質(zhì)量增加。SPI的11S中酸性多肽的條帶隨著?；潭鹊脑黾酉蛏掀疲?1S堿性多肽的條帶消失，而且在低于20 kDa的分子質(zhì)量區(qū)域，相比較于SPI，SSPI的條帶變淺，變淺程度與酰化程度呈正比，且SSPI-3和SSPI-4彌散至25 kDa處，這可能是由于琥珀?；磻?yīng)使得SPI某些結(jié)構(gòu)被分離[10]。

2.4 內(nèi)源熒光光譜

如圖5所示，SSPI的熒光強(qiáng)度均高于SPI，這是由于SSPI攜帶更多負(fù)電荷，分子間排斥力增強(qiáng)，分子結(jié)構(gòu)舒展使更多色氨酸暴露出來(lái)[23]。但隨著?；鹊脑黾?，SSPI的熒光強(qiáng)度逐漸下降，可能是由于隨著?；鹊脑黾?，鏈狀琥珀?；鶊F(tuán)逐漸增多，使得蛋白空間位阻增加，形成一個(gè)密閉蛋白鏈空間，導(dǎo)致部分色氨酸殘基被包裹在內(nèi)。除熒光強(qiáng)度變化外，峰位置的變化也值得關(guān)注。隨著?；鹊脑黾樱鞍椎摩薽ax從330 nm逐漸增加到337 nm，產(chǎn)生紅移，表明琥珀?；茐牧薙PI分子內(nèi)的疏水相互作用，且蛋白所在環(huán)境的極性增加，蛋白質(zhì)的肽鏈伸展程度增加。這可能是因?yàn)轷；蟮鞍踪|(zhì)變性引起的分子展開(kāi)和構(gòu)象變化，導(dǎo)致掩埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的色氨酸殘基暴露于更加親水以及極性更大的環(huán)境中。SSPI-3與SSPI-4的熒光強(qiáng)度曲線相差不大，曲線穩(wěn)定，這與2.1節(jié)中?；潭鹊慕Y(jié)果相吻合。即在酸酐-SPI質(zhì)量比大約為0.05∶1時(shí)，酰化反應(yīng)出現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，而當(dāng)比值進(jìn)一步提高時(shí)，N-?；葞缀鯖](méi)有變化。但仍觀察到熒光強(qiáng)度發(fā)生了細(xì)微的變化，其可能的原因是在這一階段，?；磻?yīng)已經(jīng)進(jìn)入蛋白內(nèi)部，琥珀酸酐與脂族羥基和巰基發(fā)生反應(yīng)。

圖5 SPI/SSPI的內(nèi)源熒光光譜Fig. 5 Intrinsic fluorescence spectra of SPI/SSPI

2.5 紫外-可見(jiàn)光吸收光譜

圖6顯示，SPI與SSPI的紫外光譜峰值均在260～280 nm之間。蛋白的紫外吸收光譜在250～260 nm附近產(chǎn)生的吸收譜帶主要是由苯丙氨酸殘基貢獻(xiàn)，在260～290 nm內(nèi)的吸收由酪氨酸殘基所引起，而292 nm附近的吸收則由色氨酸殘基貢獻(xiàn)[24]。因此認(rèn)為本研究的紫外光譜變化主要由酪氨酸引起，其次是色氨酸。SSPI的紫外吸收強(qiáng)度相比較于SPI均下降，并且酰化程度的變化與紫外光譜強(qiáng)度的變化呈負(fù)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)推測(cè)，隨著?；鹊奶岣?，琥珀酰基基團(tuán)越來(lái)越多，使得蛋白空間位阻增加，形成一個(gè)密閉的蛋白鏈空間，酪氨酸殘基逐漸被包裹在蛋白質(zhì)鏈的內(nèi)部。除熒光強(qiáng)度變化外，峰位置也發(fā)生了變化，由266 nm紅移到275 nm，這一現(xiàn)象表明SPI的三級(jí)結(jié)構(gòu)由于琥珀?；鶊F(tuán)的加入發(fā)生改變，影響了蛋白質(zhì)分子存在的微環(huán)境。

圖6 SPI/SSPI的紫外光譜Fig. 6 UV absorption spectra of SPI/SSPI

2.6 傅里葉變換紅外光譜測(cè)定結(jié)果

傅里葉變換紅外光譜是研究蛋白質(zhì)化學(xué)組成和構(gòu)象結(jié)構(gòu)的一種方法[25]。如圖7所示，3 400 cm-1左右的寬峰是O—H與N—H伸縮振動(dòng)重疊而成的多重吸收峰。隨著酰化程度的提高，寬帶逐漸消失，這是由于游離氨基與琥珀?；鶊F(tuán)反應(yīng)后其中N—H鍵變?yōu)镃—N鍵所致的。SSPI處于3 200～2 500 cm-1處的峰與SPI相比峰寬而散，一方面說(shuō)明—COOH的存在，且隨著?；潭鹊脑黾樱狢OOH的含量越來(lái)越多；另一方面也說(shuō)明分子內(nèi)氫鍵相互作用得到增強(qiáng)，這是由于O的電負(fù)性大于N，更容易形成氫鍵[26]。SSPI酰胺I帶與酰胺II帶的波形相比SPI沒(méi)有發(fā)生變化，強(qiáng)度變化也不明顯。SSPI圖譜在酰胺III帶1 300 cm-1處區(qū)域強(qiáng)度增加，這是由于?；?C—N鍵拉伸和N—H鍵變形導(dǎo)致。

圖7 SPI/SSPI的紅外光譜Fig. 7 Infrared spectra of SPI/SSPI

2.7 表面疏水性及分子柔性測(cè)定結(jié)果

采用ANS和蛋白質(zhì)表面疏水區(qū)域的結(jié)合所引起的熒光增強(qiáng)評(píng)估蛋白質(zhì)的表面疏水性。它可以反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，且與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)密切相關(guān)[27]。SSPI的表面疏水性變化如圖8所示。隨著酰化程度的增加，SPI的表面疏水性顯著下降。這一結(jié)果與燕麥蛋白[28]和蕓豆蛋白[29]的研究結(jié)果相似。表面疏水性的降低可能有兩個(gè)原因引起，一方面，?；餝PI三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致表面疏水區(qū)域的比例降低；另一方面，琥珀?；瘜?dǎo)致電荷密度和電負(fù)性的增加，這可以通過(guò)?；骃PI的Zeta電位的降低證明（圖2），蛋白質(zhì)的高負(fù)電荷分布或強(qiáng)電負(fù)性會(huì)引起靜電排斥，這可能會(huì)抑制ANS接近并與裸露的疏水區(qū)域結(jié)合，從而導(dǎo)致表面疏水性降低[28-29]。

蛋白質(zhì)的分子柔性被定義為蛋白質(zhì)中各個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域的相對(duì)運(yùn)動(dòng)或多肽鏈中氨基酸殘基的重排速率[30]。蛋白質(zhì)的分子柔性在蛋白表面性質(zhì)中起著十分重要的作用[31]。 SSPI的分子柔性的變化如圖8所示。相較于SPI，隨著酰化程度的增加，蛋白質(zhì)的分子柔性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。這一結(jié)果表明，隨著琥珀?；磻?yīng)進(jìn)行，?；潭忍岣?，導(dǎo)致SPI結(jié)構(gòu)展開(kāi)，蛋白質(zhì)分子柔性與?；潭瘸收?。但是，當(dāng)琥珀酸酐與蛋白比值達(dá)到0.15∶1，蛋白質(zhì)的分子柔性略有下降，這可能是琥珀酰基基團(tuán)在水溶液中存在形態(tài)是鏈狀結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，因?yàn)殚L(zhǎng)鏈的存在而導(dǎo)致SPI產(chǎn)生一定的空間位阻，分子柔性降低。

圖8 SPI/SSPI的分子柔性和表面疏水性Fig. 8 Molecular flexibility and surface hydrophobicity of SPI/SSPI

2.8 乳化活性與乳化穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

SPI成分主要包括7S與11S兩種球狀蛋白，因?yàn)榈头肿尤嵝砸约捌湓谟退缑嫖叫圆涣级鴮?dǎo)致乳化性不理想[1]。EAI和ESI分別代表蛋白質(zhì)在油/水界面形成和穩(wěn)定乳液的能力[32]。

琥珀?；男許PI會(huì)改變蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象。如圖9所示，琥珀?；梢燥@著提高SPI的EAI以及ESI，且EAI和ESI的變化趨勢(shì)一致，SPI?；潭扰cEAI/ESI的變化呈正比。在SPI中加入琥珀?；鶊F(tuán)改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象和界面行為，導(dǎo)致SPI結(jié)構(gòu)展開(kāi)（2.4節(jié)和2.5節(jié)），因此SPI乳化性提高。Lawal等[33]指出，添加琥珀酸酐增加了油滴周?chē)缑婺る婋x層的電勢(shì)，從而提高了EAI和ESI。當(dāng)酸酐與SPI比例達(dá)到0.15∶1時(shí)，EAI和ESI略有下降，但是仍比未改性的SPI高。這一現(xiàn)象可能是由于大量琥珀?；鶊F(tuán)鏈狀結(jié)構(gòu)的存在導(dǎo)致分子柔性略微降低，影響EAI和ESI，這與上述2.7節(jié)分子柔性的結(jié)果吻合。

圖9 SPI/SSPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig. 9 EAI and ESI of SPI/SSPI

3 結(jié) 論

本研究探究琥珀?；{(diào)控SPI電荷密度對(duì)其構(gòu)象和乳化性的影響，明確了酰化蛋白構(gòu)象變化和乳化性改善之間的關(guān)系。琥珀酸酐主要與SPI的氨基反應(yīng)，SPI的琥珀酰化作用從表面逐步發(fā)生到內(nèi)部。隨著?；潭鹊脑黾?，SPI的等電點(diǎn)向酸性移動(dòng)，負(fù)電荷密度也明顯增加；改性SSPI結(jié)構(gòu)展開(kāi)，色氨酸殘基暴露，酪氨酸殘基被包裹，SSPI處于更加親水的環(huán)境中，SPI游離氨基與琥珀?；鶊F(tuán)反應(yīng)使得其中N—H鍵變?yōu)镃—N鍵，導(dǎo)致酰胺III帶改變；?；揎椊档土薙PI的表面疏水性，增加SPI的分子柔性，并且由于結(jié)構(gòu)展開(kāi)導(dǎo)致其乳化活性和乳化穩(wěn)定性都得到明顯改善。該研究結(jié)論為琥珀酰化改性在蛋白化學(xué)修飾方面的應(yīng)用提供理論參考，并且拓寬了SPI在食品工業(yè)中作為乳化劑和功能活性物質(zhì)載體的應(yīng)用范圍。