王 芹, 李立恒, 王鐘華, 楊永超, 馮建梅, 胥愛文, 安 峰, 申葉春

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院口腔科, 河北 張家口 075000)

牙髓屬于牙齒中唯一的疏松結(jié)締組織,發(fā)揮感覺及外界防御作用,當(dāng)牙齒損傷導(dǎo)致牙髓感染或壞死,降低牙髓活力及牙齒壽命[1]。牙齒損傷后血運(yùn)減弱,其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)降低,VEGF具有促進(jìn)牙髓組織血管形成,提高牙髓損傷修復(fù)能力[2]。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)屬于趨化因子之一,在神經(jīng)、血管及軟骨等部分發(fā)揮修復(fù)及再生作用[3]。在牙齒脫位后牙髓無壞死時(shí)保持牙髓活力,及時(shí)進(jìn)行牙髓血運(yùn)重建至關(guān)重要。目前隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,在牙齒血運(yùn)重建過程中認(rèn)為促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對(duì)于牙齒具有保護(hù)作用[4]。相關(guān)學(xué)者證實(shí)EPO能夠通過增加VEGF水平,有助于拔牙大鼠血運(yùn)重建[5],本文以EPO對(duì)磨牙牙髓SDF-1因子的水平及炎性因子水平作為創(chuàng)新點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,為牙髓損傷的修復(fù)再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)大鼠:48只SPF級(jí)SD大鼠來自河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院,200g±25g,飼養(yǎng)于動(dòng)物房?jī)?nèi),每個(gè)籠子有4只大鼠,實(shí)驗(yàn)期間均自由飲水及攝食,喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-0016。

1.2主要試劑與儀器:EPO(西寶生物科技)；慶大霉素及生理鹽水(遼寧民康藥業(yè))；4%多聚甲醛(江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材)；SDF-1抗體(亞科因(武漢)生物)；VEGF及GAPDH抗體(羅氏公司)；HE試劑盒(康迪斯化工(湖北))；BCA蛋白試劑盒(天津金克隆生物技術(shù))；DL-S OOOB低溫離心機(jī)(上海安亭)；光學(xué)顯微鏡(舜宇光學(xué)科技(集團(tuán))。

1.3大鼠無髓根管模型建立:參考文獻(xiàn)[8],選擇牙齒完好無病癥的大鼠,選擇雙側(cè)下頜第一磨牙作為實(shí)驗(yàn)牙齒,將實(shí)驗(yàn)牙齒近中及遠(yuǎn)中根管作為實(shí)驗(yàn)根管,按照50mg/kg腹腔注射1%的戊巴比妥鈉麻醉,開髓,疏通根管后,使用NaClO溶液浸泡根管溶解牙髓并用生理鹽水沖洗；依次使用10#、15#、20#H銼拔髓,1.5%NaClO溶液和17%EDTA溶液交替沖洗,直至根管內(nèi)無明顯滲出,干燥根管后使用氫氧化鈣糊劑進(jìn)行根管封藥,MTA封閉根管口,流動(dòng)樹脂充填窩洞。

1.4分組及干預(yù)方法:將48只大鼠分為正常組、模型組、250IUEPO組及500IUEPO組,均12只,除正常組外,其余大鼠均進(jìn)行無髓根管模型建立及血運(yùn)重建,EPO-A組及EPO-B組均腹腔注射250IU/Kg的EPO及500IU/Kg的EPO,其余大鼠均腹腔注射相同體積的0.9%的生理鹽水。連續(xù)注射14d,每日一次。

1.5酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清炎性因子:各組大鼠干預(yù)14d后,次日清晨空腹?fàn)顟B(tài)下取尾部靜脈血1mL,放入抗凝離心管中分離低速離心機(jī)按照3000r/min運(yùn)轉(zhuǎn)20min,保留血清,采用ELISA法檢測(cè)檢測(cè)腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)水平。

1.6組織提取:各組大鼠干預(yù)14d后,麻醉處死大鼠(1%戊巴比妥鈉),保留下頜骨放入10%的甲醛溶液中,固定過夜,自來水沖洗,浸泡于14%的EDTA溶液中脫鈣,逐層脫水后石蠟包埋后4μm切片后村村備用。

1.7HE染色觀察根管組織病理形態(tài):各組大鼠組織切片放入37℃復(fù)溫15min,二苯甲脫蠟后按照100%-95%-85%及75%乙醇進(jìn)行逐層脫水,蘇木精染色10min,1%鹽酸酒精處理10s,放入飽和碳酸鋰中返藍(lán),加入伊紅染色液染色10s,再次逐層脫水后中性樹脂封片后顯微鏡觀察組織形態(tài)。

1.8免疫印跡檢測(cè)根管組織SDF-1及VEGF蛋白表達(dá):根管組織采用1%裂解液,離心后保留上清液采用BCA檢測(cè)蛋白,加入樣品后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)入聚偏二氟乙烯膜,封閉60min,加入SDF-1及VEGF (1∶500),內(nèi)參為GAPDH(1∶500),加入辣根氧化酶2抗(1∶2000),搖勻,采用TBST沖洗膜,最后ECI話化學(xué)發(fā)光顯色,試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.9人牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理:將購(gòu)自北京澤平公司的人牙髓干細(xì)胞放入37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng),生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代,放入15mL的離心管中1000r/min,5min后,棄去上清液放入培養(yǎng)基中2～3d傳代。將人牙髓干細(xì)胞分為正常組、EPO組、SDF-1組及VEGF組,EPO組人牙髓干細(xì)胞中加入10U/mL的EPO共培養(yǎng),SDF-1組及VEGF組則分別加入100μg/L的SDF-1及10ng/mL的VEGF培養(yǎng),正常組為人牙髓干細(xì)胞添加PBS培養(yǎng)液。

1.10CCK-8檢測(cè)各組人牙髓干細(xì)胞增殖:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第3代人人牙髓干細(xì)胞接種到96孔板中,數(shù)量5×108·L-1,沒孔體積200μL,在37℃飽和濕度下培養(yǎng)24h、36h和72h,均加入5g/L CCK-8試劑,繼續(xù)培養(yǎng)2h,全自動(dòng)酶標(biāo)儀450nm下檢測(cè)吸光度,計(jì)算增值率。公式：藥物處理組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值×100%,取3次平均值。

1.11qRT-PCR檢測(cè)各組人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞SDF-1及VEGF mRNA相對(duì)表達(dá):提取各組培養(yǎng)后的人牙髓干細(xì)胞細(xì)胞,數(shù)量為1×105個(gè)/孔,去培養(yǎng)基后,PBS沖洗,加入200μL氯仿,離心后加入乙醇,沉淀后進(jìn)行7000轉(zhuǎn)高速離心,提取RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA,以β-actin為內(nèi)參,反應(yīng)條件：98℃6min,98℃28S,75℃30S,80℃4min,總計(jì)55個(gè)循環(huán),見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較:與和正常組相比,模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高(P<0.05),與模型組相比,EPO-A組及EPO-B組大鼠血清中炎性指標(biāo)均降低(P<0.05),且EPO-B組血清中炎性指標(biāo)低于EPO-A組,組間比較有差異(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清中TNF-α IL-6及IL-1β水平比較

2.2HE觀察各組大鼠根管組織形態(tài):正常組：大鼠牙根管組織有大量的梭形成纖維細(xì)胞分布,結(jié)締組織緊致分布；模型組：根管內(nèi)部分為不規(guī)則的礦化基質(zhì),未見血管形成,根尖內(nèi)存在大量炎性細(xì)胞,并先根管內(nèi)部延申并部分進(jìn)步根管內(nèi)。EPO-A組及EPO-B組根管內(nèi)存在不規(guī)則礦化,在根尖1/3處可發(fā)現(xiàn)新生血管,有少量炎性細(xì)胞分布根尖周圍。見圖1。

圖1 各組大鼠根管組織病理形態(tài)比較(200×)

表3 各組大鼠根管組織SDF-1及VEGF蛋白水平

2.3免疫印跡檢測(cè)各組大鼠根管組織SDF-1及VEGF蛋白水平:模型組大鼠根管組織中SDF-1及VEGF蛋白表達(dá)水平低于正常組(P<0.05),EPO-A組及EPO-B組SDF-1及VEGF蛋白表達(dá)水平高于模型組(P<0.05),EPO-B組與EPO-A組比較差異顯著(P<0.05),見表3、圖2。

圖2 各組大鼠根管組織SDF-1及VEGF蛋白電泳圖

圖3 光學(xué)檢顯微鏡觀察人牙髓細(xì)胞分化(A：100×,B：200×)

2.4人牙髓細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn):人牙髓細(xì)胞克隆至第二代時(shí),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),鏡下可見,細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好,呈梭形或星形,細(xì)胞間排列緊密,胞漿豐富,胞漿的突起互相連接,細(xì)胞核呈卵圓形,位于細(xì)胞中央,有明顯的核仁。見圖3。

2.5各組人牙髓細(xì)胞相對(duì)增殖率比較:EPO組、SDF-1組及VEGF組人牙髓細(xì)胞的在24h、48h及72h的相對(duì)增殖率均高于正常組(P<0.05),EPO組、SDF-1組及VEGF組24h、48h及72h相對(duì)增殖率比較無意義(P>0.05),組內(nèi)不同時(shí)間比較,EPO組、SDF-1組及VEGF組均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而相對(duì)增值率升高(P<0.05),見表4、圖4。

表4 各組人牙髓細(xì)胞相對(duì)增殖率比較(%)

圖4 各組人牙髓細(xì)胞相對(duì)增殖率比較

表5 各組人牙髓細(xì)胞中SDF-1及VEGF mRNA表達(dá)比較

2.6各組人牙髓細(xì)胞中SDF-1及VEGF mRNA表達(dá)比較:與正常組相比,EPO組、SDF-1組及VEGF組細(xì)胞中SDF-1及VEGF mRNA表達(dá)升高(P<0.05),EPO組、SDF-1組及VEGF組SDF-1及VEGF mRNA水平無意義(P>0.05),見表5,皮爾森相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示：SDF-1mRNA與VEGF mRNA呈現(xiàn)正向相關(guān)性(r=0.576,P=0.003),見圖5。

圖5 各組人牙髓細(xì)胞中SDF-1及VEGF mRNA相關(guān)性分析

3 討 論

牙髓血運(yùn)重建術(shù)作為改善牙髓感染后壞死或根尖且未閉合的年輕恒牙的治療方案,已經(jīng)過大量動(dòng)物及臨床試驗(yàn)證實(shí)其能夠?yàn)檠栏L(zhǎng)及根管壁增厚提供理想治療效果[5,6],但是在此過程中牙新生組織多為牙骨礦化物質(zhì),而非真正的牙髓組織,從而影響恢復(fù)效果。細(xì)胞因子在機(jī)體炎癥反應(yīng)表達(dá)異常,TNF-α、IL-6及IL-1β等細(xì)胞因子在牙髓損傷及壞死時(shí)表達(dá)升高,被認(rèn)為是牙髓疾病重要炎性因子,主要原因與在牙齒損傷后激活巨噬細(xì)胞M1表達(dá)而分泌大量炎性因子,提高炎癥反應(yīng)。本文研究證實(shí),大鼠牙髓進(jìn)行血運(yùn)重建后,大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β等表達(dá)升高,采用EPO腹腔注射后可降低炎性水平,說明EPO能夠減少牙髓血運(yùn)重建后的炎性表達(dá)而降低疼痛。EPO屬于能夠通過激活紅系造血組細(xì)胞而通過加快紅細(xì)胞生成應(yīng)用于臨床多種疾病的治療,例如惡性腫瘤合并貧血等。近些年研究證實(shí),EPO對(duì)骨生成也發(fā)揮重要作用。EPO能夠通過降低細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞間粘附分子-1(VCAM-1)而抑制巨噬細(xì)胞表達(dá)[7]。Mahboubeh R[8]研究證實(shí),在口腔黏膜炎中EPO能夠同抑制TNF-α等炎性因子的表達(dá)而減少活性氧氧化應(yīng)激,改善口腔炎癥,緩解疼痛。本文與 Vajihe[9]研究相似。

本文對(duì)人牙髓細(xì)胞采用EPO、VEGF及SDF-1培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)EPO、VEGF及SDF-1均能夠刺激人牙髓細(xì)胞增殖,說明EPO、VEGF及SDF-1能夠作為牙髓再生修復(fù)因子而發(fā)揮牙髓修復(fù),促進(jìn)牙髓修復(fù)及血管再生作用。在人牙髓細(xì)胞中EPO能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)節(jié)樣細(xì)胞分化,主要是通過激活p38MAPK表達(dá)促進(jìn)人牙髓細(xì)胞增殖。高糖環(huán)境中人牙髓細(xì)胞增殖受到抑制后,外源性上調(diào)EPO后可提高人牙髓細(xì)胞在高糖環(huán)境下的成骨能量,說明EPO能夠提高牙髓細(xì)胞堿性磷酸酶活性,增加牙髓細(xì)胞增殖能力。VEGF在牙齒發(fā)育及牙髓損傷愈合修復(fù)方面具有重要作用,通過內(nèi)皮細(xì)胞分化、促進(jìn)血管再生,保護(hù)牙齒提高細(xì)胞繁育。在牙髓細(xì)胞損傷后VEGF短暫性表達(dá)上調(diào)發(fā)揮修復(fù)損傷作用。SDF-1能夠抑制人牙髓細(xì)胞成牙本質(zhì)分化,通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)表達(dá)而對(duì)人牙髓細(xì)胞發(fā)揮趨化效應(yīng)而增加活性。也有研究表明EPO能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,加強(qiáng)血管形成能力,從而抑制血管收縮,其主要通過調(diào)節(jié)磷酸化Janus激酶(JAK2)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子及轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)的表達(dá)來提高VEGF水平,參與牙髓修復(fù)作用[10]。

綜上所述：促紅細(xì)胞生成素能夠降低大鼠磨牙牙髓血運(yùn)重建術(shù)后炎癥水平,緩解疼痛,并通過提高SDF-1、VEGF表達(dá)促進(jìn)血管新生,參與血運(yùn)重建。