黃 強(qiáng)，常金霞，鄭 碩，牛少輝，曹 乾，方毅娜，曹建春，張東萍

近年來，糖尿病患者日益增多，而糖尿病并發(fā)癥也成為目前醫(yī)學(xué)攻克的重點(diǎn)。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcers, DFU)是糖尿病的常見嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，嚴(yán)重者甚至可致殘和死亡[1-3]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在難愈合的糖尿病潰瘍部位存在血管生成受損、內(nèi)皮細(xì)胞及新生血管數(shù)量減少等現(xiàn)象[4]。因此，促進(jìn)血管生成過程有利于DFU的治療[5]。血管生成是一個動態(tài)的調(diào)控過程，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和一氧化氮(NO)是重要的調(diào)控分子[6-7]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可降低DFU大鼠模型炎癥反應(yīng)，促進(jìn)新生血管生成，從而加快創(chuàng)口愈合[8]。為進(jìn)一步探究當(dāng)歸補(bǔ)血湯促進(jìn)血管生成的分子機(jī)制，本研究采用在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為研究對象，探究其對血管生成相關(guān)信號分子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和VEGF調(diào)控的影響，旨在為DFU的臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1材料 雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量180～190 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，大鼠可自由進(jìn)食和飲水。HUVECs購自上海素冉生物科技有限公司。當(dāng)歸和黃芪來自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院；NO測定試劑盒(碧云天生物)，兔抗人VEGF抗體、兔抗人iNOS抗體均購自Abcam公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清制備：黃芪30 g、當(dāng)歸6 g，研磨至細(xì)末后加1000 ml水熬制成湯劑備用。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)組(生藥含量4 g/kg當(dāng)歸補(bǔ)血湯灌胃)20只和空白對照組(生理鹽水)10只，灌胃體積2 ml/只，1/d，持續(xù)1周。最后一次灌胃1 h后，給予戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，于腹主動脈取血。室溫靜置2 h后，3500 r/min離心20 min取血清，置于56 ℃水中，水浴30 min。通過在HUVECs完全培養(yǎng)基中添加上述不同體積的血清制備0、15%、30%、60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清培養(yǎng)基。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)：為模擬糖尿病患者血糖情況，使用高糖DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)HUVECs，培養(yǎng)環(huán)境設(shè)置為37 ℃，5% CO2。

1.2.3細(xì)胞增殖檢測：MTT法測定HUVECs活力。HUVECs以2×104個/孔鋪于96孔板中。正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待生長至約80%融合，經(jīng)PBS清洗，分別添加0、15%、30%、60%(V/V)當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清培養(yǎng)24 h。待處理結(jié)束，吸出上層培養(yǎng)基每孔加入20 μl MTT染料，于37 ℃下孵育4 h，棄上清，加入150 μl DMSO，搖床震蕩15 min，檢測490 nm處吸光度。以最大細(xì)胞吸光度為100%，計算各孔相對增殖水平。

1.2.4體外創(chuàng)口愈合模型：用劃痕法評價HUVECs的遷移和創(chuàng)口閉合。2×105個/孔將細(xì)胞鋪于12孔板中，培養(yǎng)過夜后，使用無菌槍頭在細(xì)胞上劃痕，PBS洗滌去除細(xì)胞碎片，更換為0、15%、30%、60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清的培養(yǎng)基。孵育48 h后經(jīng)ImageJ測量遷移比例。遷移比例=(1-現(xiàn)有寬度/起始寬度)×100%。以最大遷移比例作為100%，比較各組間差異。

1.2.5NO水平測定：HUVECs于2×105個/孔平鋪于6孔板中；細(xì)胞貼壁后更改為含0、15%、30%、60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清培養(yǎng)基，處理48 h后，洗滌細(xì)胞，隨后根據(jù)NO檢測試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞內(nèi)NO含量。

1.2.6iNOS和VEGF蛋白含量檢測：蛋白免疫印跡試驗(yàn)檢測iNOS和VEGF蛋白表達(dá)水平。SDS-PAGE電泳提取和分離總蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5% BSA封閉1 h，然后，將膜在4 ℃與一抗孵育過夜。兔抗人iNOS和VEGF的孵育濃度為1∶2500。孵育結(jié)束后用TBST洗滌膜，用HRP結(jié)合二抗(1∶1000)孵育1 h，TBST清洗后，經(jīng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測。利用ImageJ軟件行定量統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯對HUVECs增殖的影響 30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs相對活力高于空白對照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組，60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組高于30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組(P<0.05,P<0.01)。見圖1。

圖1 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs增殖情況

2.2不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對HUVECs遷移的影響 30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs遷移比例高于空白對照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組，且60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組高于30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組(P<0.05,P<0.01)。見圖2。

圖2 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs遷移比例比較

2.3不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對NO的影響 30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs NO相對含量高于空白對照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組，60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組高于30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組(P<0.05,P<0.01)。見圖3。

圖3 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs NO相對含量比較

2.4不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清對HUVECs iNOS和VEGF表達(dá)的影響 與空白對照組比較，15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs iNOS含量升高(P<0.05)。與空白對照組和15%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組比較，30%和60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs VEGF和iNOS含量顯著升高(P<0.01)。與30%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組比較，60%當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清組HUVECs VEGF和iNOS含量升高(P<0.05)。見圖4、5。

圖4 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs中VEGF蛋白相對表達(dá)水平

圖5 不同濃度當(dāng)歸補(bǔ)血湯含藥血清處理HUVECs iNOS相對表達(dá)水平

3 討論

DFU為常見嚴(yán)重的糖尿病并發(fā)癥之一[9]。研究表明，血管再生和順暢的血液流動性是組織修復(fù)必要環(huán)節(jié)，但是通常DFU血管生成受到抑制，血液流動性較差[10]。在本研究中，我們驗(yàn)證了當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過促進(jìn)NO和VEGF的合成，促進(jìn)HUVECs的增殖，加快DFU體外模型創(chuàng)口的愈合。

當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有保護(hù)血管內(nèi)皮、提高機(jī)體免疫、增強(qiáng)心肌收縮力、益氣生血的功效，對潰瘍、潰后膿血等具有良好的治療效果。目前，當(dāng)歸補(bǔ)血湯已被用于臨床糖尿病足患者的治療中，但其在DFU中的作用機(jī)制尚不清楚[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在DFU患者中VEGF含量減少，血管豐度降低[9,12]。有研究表明，在病毒性心肌炎模型中，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可顯著升高VEGF表達(dá)量，促進(jìn)血管再生，改善心肌缺血[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可增加HUVECs VEGF的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞遷移及體外創(chuàng)口的愈合。NO是由iNOS催化合成的血管生成物質(zhì)之一，NOS活性的增高與血管生成密切相關(guān)[14]。在炎癥狀態(tài)下iNOS高表達(dá)，而使用競爭性抑制劑抑制iNOS可減少膠原沉積，阻礙創(chuàng)口愈合過程[15]。在心肌梗死模型中，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可促進(jìn)冠狀動脈新血管形成，其作用機(jī)制與提高VEGF和NO的含量有關(guān)[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯在體外創(chuàng)口愈合模型中可提高HUVECs的iNOS活性，增加NO的產(chǎn)生。綜合既往研究和本研究結(jié)果，推測當(dāng)歸補(bǔ)血湯作用靶點(diǎn)與血管生成有密切關(guān)系。但本研究僅從動物體外模型中探究了當(dāng)歸補(bǔ)血湯對血管生成的影響。因此，當(dāng)歸補(bǔ)血湯在分子作用機(jī)制及動物乃至人體體內(nèi)的藥效研究還有待更進(jìn)一步地深入研究。

綜上所述，在DFU體外創(chuàng)口愈合模型中，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過增加VEGF的表達(dá)，促進(jìn)iNOS合成從而上調(diào)NO血管調(diào)控分子的表達(dá)，加速創(chuàng)口的愈合。本研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療DFU的作用機(jī)制。