倪建秀 陳琳琳 李文杰 陳 濤 陳桂芳

（南京市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測院，南京 210036）

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量保持穩(wěn)定增長，2020年全國水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量為5 224.20萬t，同比增長2.86%[1]。由于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中不可避免需要使用農(nóng)藥進(jìn)行除雜和防治病害，農(nóng)藥對環(huán)境造成的污染也成了我國影響范圍最大的一種有機(jī)污染[2]。農(nóng)藥在田間使用后，部分經(jīng)雨水的沖刷、河流的搬運(yùn)等進(jìn)入環(huán)境中[3]，進(jìn)而污染養(yǎng)殖水體，因此，農(nóng)藥殘留是水產(chǎn)品質(zhì)量安全的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)之一，研究建立水產(chǎn)品和養(yǎng)殖水體中農(nóng)藥殘留檢測方法具有重要的意義。

雙唑草腈是雙吡唑類除草劑。2018年湖北相和精密化學(xué)有限公司開發(fā)的97%雙唑草腈原藥和2%雙唑草腈顆粒劑在我國首先獲得登記，制劑登記用于防除水稻移栽田一年生雜草[4]，以雙唑草腈為代表的PPO抑制劑類除草劑成為解決對磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗性的雜草的非常有潛力的品種[5]。目前，國內(nèi)外對雙唑草腈殘留檢測方法研究較少，有液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（LC—MS/MS）法測定環(huán)境[6～7]、水稻[8～10]中雙唑草腈殘留，氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（GC—MS/MS）法測定豇豆[11]中雙唑草腈殘留等，而對水產(chǎn)品中雙唑草腈殘留的檢測研究尚未見報(bào)道。本文以克氏原螯蝦和養(yǎng)殖水體為代表，利用超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC—MS/MS）建立克氏原螯蝦和養(yǎng)殖水體中雙唑草腈殘留檢測方法。

一、 材料與方法

（一）試劑與材料雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)品購自德國DR.E公司，純度99.8%；乙腈、正己烷為色譜純（TEDIA公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli—Q超純水；克氏原螯蝦和養(yǎng)殖水體為南京市地產(chǎn)水產(chǎn)品和養(yǎng)殖水體。

（二）儀器與設(shè)備6460C超高效液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有ESI離子源，Agilent公司）；SQPQ65—1CN電子天平，感量0.000 01g（賽多利斯公司）；KS 501振蕩器（IKA公司）；Avanti J—E高速冷凍離心機(jī)（貝克曼公司）；MS3渦旋混合器（IKA公司）；MV5全自動平行濃縮儀（萊伯泰科公司）；0.45μm GHP萬用膜針式過濾器（美國Pall公司）。

（三）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱取適量的雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，再用流動相稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.樣品前處理。（1）采樣和試樣制備：抽取有代表性克氏原螯蝦，至少取10只清洗后，去蝦頭、蝦皮、腸腺得到整條蝦肉，進(jìn)行絞碎混合均勻后（不少于200 g）備用。采集的養(yǎng)殖水樣經(jīng)0.45μm混合纖維素濾膜過濾。如水樣較渾濁，可更換濾膜或過濾2次。過濾后的水樣4℃密封保存，并盡快檢測。（2）克氏原螯蝦樣品提取和凈化：稱取5.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL乙腈，于渦旋混合器上混合1 min后振蕩10 min，再在4℃條件下以10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液加到15 mL離心管中，上清液在40℃水浴中氮吹至近干。用1 mL流動相溶解，加入2 mL正己烷，于渦旋混合器上混合1 min后，4 000 r/min離心10 min，取下層溶液過0.45μm濾膜，供UPLC—MS/MS測定。（3）水樣提取和凈化：準(zhǔn)確量取已制備的水樣5 mL于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL乙腈，于渦旋混合器上混合1 min后振蕩10 min，再加入1 g NaCl，于渦旋混合器上混合1 min，之后在4℃條件下以10 000 r/min離心5 min。取5 mL上清液加入含有4 g Na2SO4的15 mL離心管中，于渦旋混合器上混合1 min后振蕩10 min，再以4 000 r/min離心5 min。將上清液于40℃水浴中氮吹至近干，用1 mL流動相溶解，過0.45μm濾膜，供UPLC—MS/MS測定。

3.色譜條件。色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8μm）；流動相為乙腈—0.1%甲酸水溶液（55/45，V/V）；進(jìn)樣體積10μL；流速0.4 mL/min；柱溫為30℃。

4.質(zhì)譜條件。電噴霧離子源ESI；霧化氣：氮?dú)?；離子噴霧電壓：4 000 V；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化氣壓力：45 psi；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM。其他參數(shù)見表1。

表1 雙唑草腈色譜保留時(shí)間和MRM質(zhì)譜參數(shù)

二、結(jié)果與討論

（一）色譜條件的優(yōu)化在流動相中添加甲酸或乙酸，可以提高雙唑草腈的離子化效率，提高正離子模式掃描下的響應(yīng)強(qiáng)度。參考張?jiān)碌鹊腫9]方法，以雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)溶液為對象，分別考察乙腈—水、乙腈—0.1%甲酸水溶液和乙腈—0.2%甲酸水溶液作為流動相，對目標(biāo)分析物色譜分離效果的影響。結(jié)果表明，采用3種流動相均能得到良好的峰形，響應(yīng)強(qiáng)度差異不顯著（p＞0.05）。當(dāng)乙腈中加入0.1%甲酸水溶液后，重復(fù)性更好，本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈—0.1%甲酸水溶液作為流動相。在此條件下，目標(biāo)物在5 min前出峰，有效控制分析時(shí)間，節(jié)約流動相使用量。0.5 ng/mL雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖1所示。

圖1 0.5 ng/mL雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

（二）質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化選擇scan模式，采用ESI離子源正離子模式對濃度1 mg/L的雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描，確定其分子離子峰為m/z315.1。然后以此分子離子作為母離子，在相對分子質(zhì)量70～350范圍內(nèi)進(jìn)行子離子全掃描，選擇其中響應(yīng)水平較高且干擾較小的2個子離子分別作為定量離子和定性離子。最后對離子碰撞能量等參數(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，最終確定的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

（三）提取條件的優(yōu)化常用的提取劑有乙腈—水—緩沖液、乙腈—水—酸、甲醇—水—酸等溶劑。甲醇提取時(shí)會帶入更多的極性基質(zhì)干擾物，且蛋白沉淀松散，增加后續(xù)凈化難度[12～13]。雙唑草腈為弱酸性化合物，在酸性條件下可保持分子形態(tài)，因此本研究選擇乙腈、0.1%酸化乙腈、0.2%酸化乙腈溶液作為提取液，在空白基質(zhì)中添加2.5 μg/kg雙唑草腈后分析。結(jié)果顯示，3種提取劑均取得良好的結(jié)果，可能由于雙唑草腈結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，對微弱酸堿環(huán)境不敏感，導(dǎo)致對最終提取效率影響不大?？紤]到乙腈作為提取劑試劑種類更少，最終確定乙腈為提取劑。但需注意，因乙腈有快速蛋白沉淀效果，向樣品中加入乙腈后會使樣品表面變性結(jié)塊，導(dǎo)致樣品無法被乙腈充分分散和振蕩提取，因此樣品加入提取劑乙腈后應(yīng)盡快劇烈振蕩。

（四）凈化條件的優(yōu)化因養(yǎng)殖水體基質(zhì)相對簡單，不用凈化，本研究重點(diǎn)對基質(zhì)相對復(fù)雜的克氏原螯蝦提取液進(jìn)行了凈化條件的優(yōu)化。目前，分散固相萃取（DSPE）凈化[14]是常用的凈化方法之一，其中氨基型吸附劑（如—NH2、PSA）具有弱陰離子交換能力，通過氫鍵和化合物作用，可除去碳水化合物、脂肪酸、有機(jī)酸、酚類和少量色素。C18吸附劑作為凈化劑，是在硅膠基質(zhì)上接有十八烷基，具有較高的相覆蓋率和碳含量，可去除脂肪和脂類等非極性干擾物。MgSO4和Na2SO4為常用吸水劑，因Mg的螯合性，MgSO4的使用對許多化合物的回收率有負(fù)面影響，用Na2SO4替代MgSO4可以有效地吸收水分[15～16]。本研究在空白克氏原螯蝦提取液中添加2.5μg/kg雙唑草腈，分別考察了50 mg PSA+150 mg C18+900 mg Na2SO4作為凈化劑凈化，和正己烷液液分配法凈化，對目標(biāo)分析物回收率的影響。結(jié)果表明，兩種凈化方法回收率均在80%～100%范圍內(nèi)，因此選擇在流動相溶解殘?jiān)?，加? mL正己烷混勻，以4 000 r/min離心10 min，取下層溶液過0.45μm濾膜，供UPLC—MS/MS測定。

（五）基質(zhì)效應(yīng)的考察未被去除的基質(zhì)共提取物對分析物的干擾，會影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要考察基質(zhì)效應(yīng)。本研究基質(zhì)效應(yīng)ME采用“（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率／溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率—1）×100%”進(jìn)行評價(jià)，負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng)，正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，當(dāng)—20%＜ME＜20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)—50%＜ME≤—20%或20%≤ME＜50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME≤—50%或ME≥50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[17]?；|(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)，會降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性，甚至使檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的誤差。本研究中，分別用克氏原螯蝦樣品、水樣空白上機(jī)液和流動相，配制0.5、1、5、10和50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行上機(jī)測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，克氏原螯蝦樣品和水樣的基質(zhì)效應(yīng)ME分別為—15.0%和—6.4%，為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，因此，采用流動相配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可滿足定量檢測要求。

（六）方法的線性范圍、線性關(guān)系和定量限精密量取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)工作液，用流動相定容，配制質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10和50μg/L的雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上文檢測方法進(jìn)行分析，以色譜峰面積（y）對其質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示，在0.5～50μg/L范圍內(nèi)，雙唑草腈線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.999 8，線性方程為y＝2 165.077 9x—136.272 6。

方法定量限（LOQ）通過在空白基質(zhì)中添加一定標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上文選擇的前處理方法和條件進(jìn)行分析，以10倍信噪比作為定量限。該方法測定克氏原螯蝦中雙唑草腈的定量限為0.5μg/kg，測定水體中雙唑草腈定量限為0.5μg/L。

（七）方法的正確度和精密度向空白試樣中添加質(zhì)量濃度是定量限1倍、5倍、20倍的雙唑草腈標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個添加濃度重復(fù)6次，計(jì)算添加回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，克氏原螯蝦中雙唑草腈在0.5、2.5、10 μg/kg 3個加標(biāo)水平上回收率為83.6%～92.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.6%～11.4%；水樣在0.5、2.5、10μg/L 3個加標(biāo)水平上回收率為96.4%～101.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～2.8%。結(jié)果符合GB/T 32465—2015《化學(xué)分析方法驗(yàn)證確認(rèn)和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》中對正確度和精密度的要求[18]。

表2 克氏原螯蝦和水體中雙唑草腈的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝6）

（八）實(shí)際樣品的檢測應(yīng)用本文所建立的方法對本地抽取的30份克氏原螯蝦和20份養(yǎng)殖水體中的雙唑草腈進(jìn)行檢測，并同時(shí)由質(zhì)控人員向空白基質(zhì)中添加目標(biāo)分析物進(jìn)行盲樣添加試驗(yàn)。最終結(jié)果顯示，所有樣品均未檢出雙唑草腈，盲樣檢測回收率與正確度試驗(yàn)結(jié)果相符合，說明該方法適用于克氏原螯蝦和養(yǎng)殖水體中雙唑草腈檢測。

三、結(jié)論

本研究建立了UPLC—MS/MS測定克氏原螯蝦和養(yǎng)殖水體中雙唑草腈殘留的快速檢測方法?？耸显r樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷去脂后進(jìn)行儀器檢測；水樣經(jīng)乙腈提取后進(jìn)行儀器檢測。該方法操作簡便、快速，結(jié)果穩(wěn)定，可用于克氏原螯蝦和養(yǎng)殖水體中雙唑草腈殘留的快速篩查與定量檢測。