劉建秀 袁曉斌

(1濟南市第三人民醫(yī)院麻醉科，山東 濟南 250101；2青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院)疾控科)

膀胱癌是臨床常見惡性腫瘤之一，其具有極強的侵襲性及轉移能力〔1〕，目前關于膀胱癌發(fā)病機制尚未闡明。研究表明部分抗腫瘤藥物可用于治療膀胱癌，但患者易產生耐藥性而降低治療效果〔2〕。因而需深入探究膀胱癌發(fā)病機制并尋求安全高效的治療藥物從而提高膀胱癌治療效果。研究表明部分麻醉相關藥物對腫瘤細胞生長及轉移過程發(fā)揮重要調控作用〔3〕。右美托咪定(Dex)屬于選擇性α2-腎上腺受體激動劑，其具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用，研究表明Dex可抑制卵巢癌生長〔4,5〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，研究報道指出長鏈非編碼RNA HOXA11-AS(LncRNA HOXA11-AS)在非小細胞肺癌中呈高表達，可調控細胞增殖、侵襲、凋亡〔6,7〕。但HOXA11-AS在膀胱癌發(fā)生過程中的作用機制尚未闡明。starbase預測HOXA11-AS與微小RNA-515-5p(miR-515-5p)可能存在結合位點，研究表明miR-515-5p在前列腺癌中的具有抗癌作用〔8〕。本研究主要探討Dex對膀胱癌細胞增殖、凋亡及HOXA11-AS/miR-515-5p的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Dex購自湖北金梭生物；膀胱癌T24細胞購自上海晶抗生物；si-HOXA11-AS、si-NC、miR-515-5p mimics、miR-NC購自上海GenePharma；pcDNA3.1購自上?？吕咨?；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二抗購自北京百奧萊博；凋亡試劑盒購自上海美吉生物；Trizol、反轉錄及SYBR熒光染料試劑盒均購自日本TaKaRa；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen。

1.2方法

1.2.1Dex處理與實驗分組 膀胱癌T24細胞用不同濃度(25、50、100、200 ng/ml)的Dex處理T24細胞24 h，分別記作25 ng/ml Dex組、50 ng/ml Dex組、100 ng/ml Dex組、200 ng/ml Dex組〔9〕。未進行藥物處理的T24細胞作為NC組。觀察HOXA11-AS低表達與miR-515-5p高表達對T24細胞增殖和凋亡的影響，取對數(shù)期T24細胞，分別將si-NC、si-HOXA11-AS、miR-NC、miR-515-5p mimics轉染至T24細胞，分別記為si-NC組、si-HOXA11-AS組、miR-NC組、miR-515-5p組。轉染時嚴格按照Lipofectamine2000說明書進行操作。分別將pcDNA-NC、pcDNA-HOXA11-AS、pcDNA-HOXA11-AS與miR-NC、pcDNA-HOXA11-AS與miR-515-5p mimics轉染至T24細胞后加入含有100 ng/ml Dex的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記為Dex+pcDNA-NC組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-515-5p組。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測細胞中HOXA11-AS、miR-515-5p的表達水平 收集si-NC組、si-HOXA11-AS組、miR-NC組、miR-515-5p組、Dex+pcDNA-NC組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS組、Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組、Dex+pcDNA-HOX A11-AS+miR-515-5p組細胞，采用Trizol法提取T24細胞總RNA，利用反轉錄試劑盒進行RNA的反轉錄，制備cDNA。qRT-PCR反應體系及反應程序均按照SYBR熒光染料試劑盒說明書進行操作，應用美國ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測HOXA11-AS、miR-515-5p相對表達量。

1.2.3MTT檢測細胞存活率 收集NC組、25 ng/ml Dex組、50 ng/ml Dex組、100 ng/ml Dex組、200 ng/ml Dex組T24細胞接種至96孔板(5×103個/孔)，加入 MTT試劑(20 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后將上清替換為150 μl DMSO，檢測490 nm處T24細胞的相對吸光度值(OD)。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組對數(shù)生長期T24細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，按照凋亡檢測試劑說明書操作并檢測細胞凋亡率。

1.2.5熒光素酶報告基因檢測HOXA11-AS與miR-515-5p的靶向關系 starbase預測顯示HOXA11-AS與miR-515-5p存在互補配對結合位點。將野生型WT-HOXA11-AS載體、突變型MUT-HOXA11-AS載體分別與miR-NC、miR-515-5p mimics嚴格按照Lipofectamine2000說明書，共轉染T24細胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，檢測T24細胞熒光素酶活性。

1.2.6Western印跡檢測細胞周期蛋白(Cyclin)D1、活化的含半胱氨酸的天科氨酸蛋白水解酶(C-caspase)-3蛋白表達 各組膀胱癌T24細胞加入RIPA裂解液獲得總蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜，封閉，4℃加入CyclinD1(1∶1 000)、C-caspase-3(1∶800)一抗稀釋液(美國CST)孵育12 h，室溫加入二抗(1∶3 000)孵育1 h，滴加ECL發(fā)光劑后，于避光環(huán)境曝光顯影，應用ImageJ軟件分析CyclinD1、C-caspase-3條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1Dex對T24細胞增殖的影響 25、50、100、200 ng/ml Dex處理后，膀胱癌T24細胞存活率〔(88.27±8.82)%、(72.11±7.21)%、(54.28±5.43)%、(52.11±5.21)%〕相較于NC組〔(100.96±10.11%)〕明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(均P<0.005)，100 ng/ml Dex組與200 ng/ml Dex組T24細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，因而選用100 ng/ml Dex進行后續(xù)實驗研究。

2.2Dex對T24細胞凋亡的影響 相較于NC組，100 ng/ml Dex組膀胱癌T24細胞凋亡率和C-caspase-3蛋白相對表達量均顯著升高(P<0.05)，見圖1、圖2、表1。

圖1 流式細胞儀檢測100 ng/ml Dex處理的T24細胞凋亡

圖2 Western印跡檢測100 ng/ml Dex處理的T24細胞中C-caspase-3蛋白表達

表1 100 ng/ml Dex對T24細胞凋亡及HOXA11-AS表達的影響

2.3Dex對HOXA11-AS和miR-515-5p表達的影響 與NC組比較，100 ng/ml Dex組膀胱癌T24細胞中HOXA11-AS表達水平顯著降低(P<0.05)，miR-515-5p表達水平顯著升高(P<0.05)，見表1。

2.4HOXA11-AS低表達對T24細胞增殖和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-HOXA11-AS組HOXA11-AS的表達水平、細胞存活率顯著降低(P<0.05)。si-HOXA11-AS組T24細胞凋亡率顯著高于si-NC組(P<0.05)。與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組T24細胞中CyclinD1蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，見圖3、表2、圖4。

圖3 流式細胞儀檢測HOXA11-AS低表達后的T24細胞凋亡

圖4 Western印跡檢測CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.5miR-515-5p高表達對T24細胞增殖和凋亡的影響 miR-515-5p組T24細胞中miR-515-5p的表達水平顯著高于miR-NC組(P<0.05)。miR-515-5p組T24細胞存活率較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率較miR-NC組顯著升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白相對表達量較miR-NC組顯著降低(P<0.05)，C-caspase-3蛋白相對表達量較miR-NC組顯著升高(P<0.05)，見圖5、圖6、表3。

圖5 流式細胞儀檢測miR-515-5p高表達后T24細胞凋亡

圖6 各組CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.6HOXA11-AS靶向調控miR-515-5p的表達 HOXA11-AS與miR-515-5p的靶向結合通過StarBase預測，見圖7。miR-515-5p mimics與野生型載體WT-HOXA11-AS共轉染T24細胞的熒光素酶活性相較于miR-NC與野生型載體WT-HOXA11-AS共轉染T24細胞顯著降低(P<0.05)；miR-515-5p mimics與突變型載體MUT-HOXA11-AS共轉染T24細胞的熒光素酶活性相比于miR-NC與突變型載體MUT-HOXA11-AS共轉染T24細胞差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。si-HOXA11-AS組膀胱癌T24細胞中miR-515-5p的表達水平(2.86±0.28)顯著高于si-NC組(1.02±0.12，P<0.05)；pcDNA-HOXA11-AS組膀胱癌T24細胞中miR-515-5p的表達水平(0.40±0.04)顯著低于pcDNA-NC組(1.00±0.11，P<0.05)。

圖7 StarBase對HOXA11-AS和miR-515-5p結合進行預測示意

表4 miR-NC或miR-515-5p與報告質粒共轉染T24細胞后雙熒光素酶活性檢測

2.7HOXA11-AS高表達可以逆轉Dex對T24細胞增殖和凋亡的影響 與Dex+pcDNA-NC組比較，Dex+pcDNA-HOXA11-AS組T24細胞中HOXA11-AS的表達水平、細胞存活率及CyclinD1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，凋亡率及C-caspase-3蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖8、圖9、表5。

圖8 流式細胞儀檢測HOXA11-AS高表達和Dex作用的T24細胞凋亡

1，2：Dex-pcDNA-NC組,Dex+pcDNA-HOXA11-AS組圖9 Western印跡檢測各組CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

2.8高表達miR-515-5p可以逆轉HOXA11-AS高表達對Dex處理的T24細胞增殖和凋亡的影響 與Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組比較，Dex+pcDNA-HOXA11-AS+miR-515-5p組細胞存活率及CyclinD1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率及C-caspase-3蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見表6、圖10、圖11。

1，2：Dex-pcDNA-HOXA11-AS+miR-NC組,Dex-pcDNA-HOXA11-AS+miR-515-5p組；下圖同圖10 流式細胞儀檢測高表達miR-515-5p、HOXA11-AS高表達和Dex作用的T24細胞凋亡

圖11 Western印跡檢測CyclinD1、C-caspase-3蛋白表達

3 討 論

研究表明LncRNA在膀胱癌中異常表達并可參與腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲等過程，進一步研究顯示LncRNA可能通過調控下游miRNA表達從而發(fā)揮作用〔10,11〕。Dex可誘導卵巢癌細胞凋亡及抑制細胞增殖、遷移及侵襲能力〔12〕。研究表明Dex在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要調控作用〔13〕。相關報道指出Dex可抑制宮頸癌細胞增殖及遷移〔14〕。本研究結果提示Dex可抑制膀胱癌細胞增殖、誘導凋亡。

HOXA11-AS在胃癌細胞中呈高表達，并可促進胃癌細胞增殖及侵襲〔15〕。研究表明HOXA11-AS通過充當miR-125a-5p的海綿分子促進骨肉瘤轉移〔16〕。本研究結果提示Dex可能通過下調HOXA11-AS的表達而發(fā)揮作用。本研究證實HOXA11-AS能夠靶向調控miR-515-5p的表達。miR-515-5p在乳腺癌、非小細胞肺癌中呈低表達并可促進細胞增殖〔17,18〕。