從琳 楊秀娟 王栩 楊元慶 張智龍

(1天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院針灸科)

血管性癡呆(VD)可由腦血管病危險(xiǎn)因素、顯性腦血管病及非顯性腦血管病引起，是血管性認(rèn)知障礙(VCI)發(fā)展至重度的表現(xiàn)〔1〕，以記憶的缺失和高級(jí)認(rèn)知功能障礙為主要臨床表現(xiàn)〔2〕。楊元慶等〔3〕以自擬驗(yàn)方定志益聰湯(DZYC)治療VD，臨床效果顯著，研究表明，此方可改善VD患者的智能狀態(tài)、認(rèn)知功能和日常生活功能，但作用機(jī)制尚不明確。

近年發(fā)現(xiàn)，雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性閉塞致慢性腦低灌注可引起β-淀粉樣肽(Aβ)的沉積〔4,5〕，Aβ又協(xié)同增強(qiáng)腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的tau蛋白磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，加重認(rèn)知障礙〔6〕。糖原合成酶激酶(GSK)-3β可調(diào)節(jié)Aβ產(chǎn)生；細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(CDK)5與GSK-3β又同為tau蛋白磷酸化的重要蛋白激酶〔7〕。本實(shí)驗(yàn)探討DZYC對(duì)VD的治療是否為通過下調(diào)GSK-3β和CDK5的表達(dá)，進(jìn)而減少了Aβ1～42和磷酸化tau蛋白的沉積。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠62只，體質(zhì)量(240±10)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXK(津)2019-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)TCM-LAEC2019017。飼養(yǎng)環(huán)境12 h自然晝夜節(jié)律，溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(55±15)%。予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，自由進(jìn)食/水。

1.2藥物 DZYC組成：黨參15 g、茯苓20 g、石菖蒲20 g、遠(yuǎn)志20 g、女貞子15 g、枸杞子15 g、益智仁30 g、熟地黃20 g、當(dāng)歸20 g、赤芍15 g、川芎15 g、桃仁10 g、紅花10 g。上述藥物購(gòu)于天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，由天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所制劑中心制備為顆粒劑，每1 g顆粒相當(dāng)于2.31 g生藥。鹽酸多奈哌齊(規(guī)格5 mg/片，衛(wèi)材中國(guó)藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20050978)。

1.3主要試劑 放射性免疫沉淀法(RIPA)裂解液(P0013B)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0010S)購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；孔徑0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜(ISEQ15150)、孔徑0.45 μm PVDF膜(IPVH00010)購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；5 mg/ml牛血清白蛋白(BSA)(G3522)購(gòu)于廣州捷倍斯生物科技有限公司；小鼠抗Gsk-3β抗體(ab93926)、兔抗CDK5抗體(ab40773)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；兔抗Aβ1～42抗體(bs-0107R)購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗P-tauS202抗體(BA1759)、兔抗P-tauS396抗體(BM4496)、兔抗P-tauT231抗體(BM4464)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體(BA1050)、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(BA1054)購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；免疫顯色試劑(Dako-K5007)購(gòu)于美國(guó)Agilent Technologies公司。

1.4主要儀器設(shè)備 ZS-001型Morris水迷宮(MWM)視頻分析系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；BX53型生物顯微鏡(日本Olympus)；Legend Micro21R型冷凍高速離心機(jī)，vario skan LUX型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher)；DYY-7C型電泳儀電源，DYCZ-24DN型垂直電泳槽，DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀(北京六一儀器廠)；JT-12J型電腦生物組織脫水機(jī)，JK-6型生物組織攤烤片機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)等。

1.5模型制作 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，以MWM定位航行試驗(yàn)剔除逃避潛伏期數(shù)值極值大鼠2只，保證實(shí)驗(yàn)大鼠智能無(wú)明顯差異。參考Wakita等〔8〕方法，通過雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性閉塞法制作VD模型40只。大鼠術(shù)前12 h禁食，麻醉后于頸部正中取縱向長(zhǎng)約1.5 cm切口，鈍性游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎；假手術(shù)方法同造模方法，但只分離頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎。術(shù)后以硫酸慶大霉素局部滴注抗感染3 d。造模后第50～55天以MWM定位航行試驗(yàn)篩選成模大鼠，以假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期均值為參考值，計(jì)算各造模大鼠的平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠平均逃避潛伏期的比例，該值>20%者判定為造模成功〔9〕。術(shù)后死亡大鼠9只，未成模大鼠1只。

1.6分組與給藥 隨機(jī)將大鼠分為正常組10只，假手術(shù)組10只；30只成模大鼠分為模型組、多奈哌齊組、DZYC組各10只。DZYC組劑量5 g/kg；多奈哌齊組劑量2.6×10-4g/kg(相當(dāng)于人體用量5 mg/d)；正常組、假手術(shù)組、模型組予等量生理鹽水。自造模后第56天灌胃給藥，1次/d，連續(xù)30 d。

1.7MWM行為學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)認(rèn)知功能 干預(yù)結(jié)束后，次日開始MWM行為學(xué)測(cè)試，共計(jì)7 d。前6 d為定位航行試驗(yàn)，考察大鼠的空間學(xué)習(xí)能力；第7天為空間探索試驗(yàn)，考察大鼠的空間記憶能力。將一金屬圓柱體設(shè)于水下約1.5 cm，置于第Ⅰ象限作為隱蔽平臺(tái)。設(shè)逃避潛伏期為90 s，若90 s內(nèi)大鼠搜索到平臺(tái)并停留5 s，則生成逃避潛伏期；若90 s內(nèi)大鼠未搜索到平臺(tái)，則逃避潛伏期為90 s，此時(shí)需人為將大鼠引至平臺(tái)停留10 s，以助其記憶平臺(tái)位置。前6 d大鼠每日分別從水迷宮兩對(duì)角象限的缸邊入水，行定位航行試驗(yàn)2次；第7天撤掉隱蔽平臺(tái)，從水迷宮第Ⅲ象限的缸邊入水，行空間探索試驗(yàn)，記錄90 s內(nèi)經(jīng)過隱蔽平臺(tái)的次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間、第Ⅰ象限路程。

1.8IHC法檢測(cè)海馬CA1區(qū)GSK-3β、CDK5的陽(yáng)性表達(dá) MWM行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，次日各組隨機(jī)選5只大鼠麻醉后以4%多聚甲醛(PFA)灌注處死，取腦組織浸泡于4%PFA固定液24 h后，脫水透明、浸蠟包埋，切片備用。切片脫蠟復(fù)水后，經(jīng)抗原修復(fù)，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，羊血清室溫封閉30 min，加入一抗4℃孵育過夜(GSK-3β為1∶200，CDK5為1∶100)。次日復(fù)溫后漂洗一抗，加入HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育20 min，漂洗后滴加新鮮配制的DAB顯色液，經(jīng)蘇木素復(fù)染、脫水透明封片。于400倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組5只大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3β、CDK5的陽(yáng)性表達(dá)。每張切片于海馬CA1區(qū)取3個(gè)不同視野攝片，統(tǒng)計(jì)各圖片平均光密度(AOD)值，以Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9Western印跡法檢測(cè)海馬組織GSK-3β、CDK5、Aβ1～42、P-tauS202、P-tauS396、P-tauT231的表達(dá)量 各組另5只大鼠經(jīng)頸椎脫臼處死，冰盒上鈍性分離海馬組織，液氮凍存。組織以0.1 g/ml加入RIPA裂解液〔內(nèi)含1%苯甲基磺酰氟(PMSF)、1%磷酸酯酶抑制劑〕充分裂解40 min，4℃離心5 min(12 000 r/min)，取蛋白上清定量，加蛋白上樣緩沖液，100 ℃變性10 min，-20℃凍存。配置十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Aβ1～42用15%分離膠，其余指標(biāo)用12%分離膠)，各泳道蛋白上樣40 μg，電泳分離后，電轉(zhuǎn)(電轉(zhuǎn)液不含SDS)至PVDF膜(Aβ1～42用孔徑0.22 μm，其余指標(biāo)用孔徑0.45 μm)，室溫封閉2 h(P-tauS202、P-tauS396、P-tauT231用1% BSA，其余指標(biāo)用5%脫脂奶粉)，加入一抗(GSK-3β為1∶1 000，CDK5為1∶2 000，Aβ1～42、P-tauT231為1∶500，P-tauS202、P-tauS396為1∶300)，4℃孵育過夜。次日復(fù)溫后漂洗一抗，加入HRP標(biāo)記二抗，37℃孵育2 h后漂洗，曝光顯色。以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值測(cè)定目的蛋白在各樣品的相對(duì)含量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行方差分析、Kruskal-WallisH秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠MWM行為學(xué)測(cè)試結(jié)果 在6 d的定位航行試驗(yàn)中，各組大鼠的平均速度，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在第1、2天的定位航行試驗(yàn)中，各組大鼠的逃避潛伏期，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在隨后4 d的定位航行試驗(yàn)中，各組大鼠的逃避潛伏期均呈逐漸下降趨勢(shì)。經(jīng)repeated measure ANOVA檢驗(yàn)，逃避潛伏期與時(shí)間有交互。簡(jiǎn)單效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠與空白組、假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；多奈哌齊組、DZYC組大鼠與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在第5、6天的定位航行試驗(yàn)中，多奈哌齊組、DZYC組大鼠的逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)，DZYC組與多奈哌齊組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？臻g探索試驗(yàn)中的經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間、第Ⅰ象限路程，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001)。與正常組、假手術(shù)組大鼠比較，模型組的經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間、第Ⅰ象限路程減少(P<0.05)；與模型組大鼠比較，多奈哌齊組、DZYC組的經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)、第Ⅰ象限停留時(shí)間、第Ⅰ象限路程增加(P<0.05)；DZYC組與多奈哌齊組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3β、CDK5的陽(yáng)性表達(dá) 與正常組、假手術(shù)組大鼠比較，模型組海馬CA1區(qū)GSK-3β的陽(yáng)性表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與模型組大鼠比較，多奈哌齊組、DZYC組的GSK-3β陽(yáng)性表達(dá)減少(P<0.05)；DZYC組與多奈哌齊組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而各組大鼠海馬CA1區(qū)CDK5陽(yáng)性表達(dá)，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖1、圖2。

表2 各組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3β、CDK5的陽(yáng)性表達(dá)

圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)GSK-3β的陽(yáng)性表達(dá)(IHC,×400)

2.3各組大鼠海馬組織GSK-3β、CDK5、Aβ1～42及磷酸化tau蛋白的表達(dá)量 與正常組、假手術(shù)組大鼠比較，模型組海馬組織GSK-3β、Aβ1～42、P-tauS 396、P-tauT231的表達(dá)量明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，多奈哌齊組、DZYC組GSK-3β、Aβ1～42、P-tauT231的表達(dá)量明顯降低，多奈哌齊組P-tauS396的表達(dá)量明顯降低(均P<0.05)。DZYC組與多奈哌齊組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而各組大鼠海馬組織CDK5、P-tauS202的表達(dá)量，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3。

1～5:正常組，假手術(shù)組，模型組，多奈哌齊組，DZYC組

3 討 論

作為繼阿爾茨海默病(AD)之后的第二大癡呆類型〔10～14〕，VD現(xiàn)今患病人數(shù)已占癡呆總患者的15%～20%〔15〕，其治療形勢(shì)嚴(yán)峻，不容小覷。

迄今為止，VD的發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。目前發(fā)現(xiàn)其可能的發(fā)病機(jī)制〔16～18〕主要為膽堿能系統(tǒng)損傷、興奮性氨基酸毒性作用、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、Aβ和tau蛋白沉積、遺傳機(jī)制等。臨床藥物治療主要為膽堿酯酶抑制劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑等〔19〕，但存在一定的不良反應(yīng)〔20,21〕。近年發(fā)現(xiàn)，某些中藥單藥與復(fù)方制劑可通過靶向VD的可能發(fā)病機(jī)制而改善血管性認(rèn)知功能〔22〕，中草藥或?yàn)橹委烿D的潛在藥物〔23〕。如細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷可上調(diào)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)〔24〕；當(dāng)歸小分子多糖能夠抑制Tau蛋白的表達(dá)〔25〕；黃芩苷可以抑制腦組織中Aβ的形成和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化〔26〕等。

Aβ的沉積和tau蛋白過度磷酸化是VD和AD的共性病理機(jī)制之一〔27〕。GSK-3β和CDK5在生成Aβ和磷酸化tau蛋白的過程中具有重要作用，二者既有共性，又有不同。GSK3和CDK5是腦內(nèi)調(diào)節(jié)tau蛋白磷酸化的最重要的蛋白激酶〔28〕。研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β和CDK5可磷酸化相同位點(diǎn)的tau蛋白〔29〕，如本實(shí)驗(yàn)中的Ser396、Thr231位點(diǎn)。此外，GSK-3β參與β-淀粉樣前體蛋白的代謝、調(diào)節(jié)產(chǎn)生Aβ〔30〕。Aβ1～42是Aβ中最常見的單異構(gòu)體亞型之一，由于其疏水性較強(qiáng)，能夠形成不溶性的聚集體，故因難以清除而更易聚集沉積〔31〕。CDK5可使tau蛋白在Ser202位點(diǎn)發(fā)生磷酸化〔32〕，但其基礎(chǔ)活性較低，需要被激活以磷酸化tau蛋白〔33〕。異常磷酸化的tau蛋白可促進(jìn)Aβ的沉積，同時(shí)Aβ又可活化GSK-3β、CDK5而誘導(dǎo)tau蛋白的異常磷酸化〔34〕，如此往復(fù)而成惡性循環(huán)。最終，Aβ在神經(jīng)細(xì)胞外沉積形成老年斑，過度磷酸化的tau蛋白在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，二者共同參與缺血后海馬神經(jīng)元的損害，并導(dǎo)致認(rèn)知功能的障礙。

VD屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”“呆病”范疇。張智龍〔35〕善于治療腦血管疾病，認(rèn)為：腦為髓之海，非養(yǎng)不滿，腦病易虛，非養(yǎng)不實(shí)；腦為元神之府，非清不靜，腦病易閉，非清不開。故腦病易虛易閉，治療需牢記“清”“養(yǎng)”二字。根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)治療VD的理法方藥：VD病位在腦，與腎密切相關(guān)。臨床以虛實(shí)夾雜者為多見，虛者因腎精不足，腦髓空虛；實(shí)者由痰濁蒙竅，瘀阻腦絡(luò)；以本虛標(biāo)實(shí)、腦髓空虛、痰瘀閉阻、神機(jī)失用為病機(jī)關(guān)鍵。治療需養(yǎng)精益髓、清濁開閉以達(dá)調(diào)理神機(jī)之功，自擬DZYC為治療VD的基礎(chǔ)方。方中黨參、茯苓，性平味甘，健脾補(bǔ)中而寧心安神。菖蒲、遠(yuǎn)志，苦、辛而溫，善治痰濁蒙竅之證。女貞子甘涼、枸杞子甘平、益智仁辛溫，三味兼顧腎陰腎陽(yáng)，補(bǔ)腎而養(yǎng)精益髓。熟地黃甘而微溫，補(bǔ)肝腎而生精補(bǔ)髓；當(dāng)歸辛甘、苦溫，善治一切血虛血滯之證；赤芍苦而微寒，善治血分有熱有瘀之證；川芎辛溫，行氣以活血；桃仁甘平、質(zhì)潤(rùn)，破血逐瘀；紅花辛散、溫通，活血通經(jīng)，六藥合用為桃紅四物湯，重在活血化瘀，養(yǎng)血生精。全方攻補(bǔ)兼施、升降相因、寒溫并用，藥性平和，符合方劑三要素；同時(shí)直應(yīng)VD之關(guān)鍵病機(jī)。

海馬是大腦中負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶的主要區(qū)域，與記憶和空間導(dǎo)航密切相關(guān)〔36〕，海馬CA1區(qū)在空間導(dǎo)航和記憶鞏固方面具有重要作用〔37〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠在MWM行為學(xué)檢測(cè)中表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)、記憶能力的損傷，而DZYC可提高VD大鼠的空間學(xué)習(xí)、記憶能力，其療效與多奈哌齊基本相當(dāng)。說(shuō)明DZYC可能通過下調(diào)海馬組織GSK-3β的表達(dá)，進(jìn)而減少VD大鼠海馬組織Aβ1～42、P-tauT231的表達(dá)。但本實(shí)驗(yàn)中，CDK5、P-tauS202的表達(dá)在各組大鼠并無(wú)差異，與以往報(bào)道〔38,39〕不相一致，考慮或?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的鼠種、鼠齡及實(shí)驗(yàn)造模方法不盡相同的原因。Aβ的沉積是Aβ的生成和降解清除共同作用的結(jié)果；而Tau蛋白的磷酸化程度又取決于蛋白激酶的磷酸化和蛋白磷酸酯酶的去磷酸化。本實(shí)驗(yàn)僅為對(duì)DZYC治療VD作用機(jī)制的初步探索，今后的實(shí)驗(yàn)研究中，將嘗試從Aβ清除的相關(guān)因子和蛋白磷酸酯酶的角度共同探索；并擴(kuò)大樣本量，設(shè)計(jì)回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以明確DZYC治療VD的作用機(jī)制。

綜上，DZYC可能通過下調(diào)海馬組織GSK-3β的表達(dá)，進(jìn)而減少了海馬組織Aβ1～42和P-tauT231的沉積，改善了VD大鼠的認(rèn)知功能。