張森 王建鋒 厲冰

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院胃腸外科，河南 南陽(yáng) 473009)

結(jié)直腸癌是全球常見的第三大惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因；近年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)有明顯升高的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量〔1，2〕。目前，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥等是制約結(jié)直腸癌治療效果的重要原因〔3〕。因此，深入研究結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找確定有效抑制結(jié)直腸癌惡性增殖和轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)是十分必要的。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類不具有編碼蛋白質(zhì)功能的長(zhǎng)鏈RNA，被證實(shí)其異常表達(dá)可通過不同方式影響細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和分化等，與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔4～6〕。研究〔7～9〕顯示，肝癌微血管浸潤(rùn)相關(guān)的lncRNA(lncRNA MVIH)在胃癌、乳腺癌和肝癌等腫瘤中異常高表達(dá)，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)，且可通過影響增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)揮致癌作用。有學(xué)者〔10〕指出，lncRNA MVIH在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且其高表達(dá)水平與患者轉(zhuǎn)移、生存期短有關(guān)；然而lncRNA MVIH在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)及作用未見報(bào)道。故本研究設(shè)計(jì)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察lncRNA MVIH在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及干擾其表達(dá)對(duì)癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞株FHC(廣州吉妮歐生物科技公司)；人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480、HT29、LOVO和SW620(中科院上海細(xì)胞庫(kù))；RPMI1640培養(yǎng)基和0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone公司)；胎牛血清和青鏈霉素混合液(美國(guó)Gibco公司)；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液(ECL)、CCK-8試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒(上海碧云天公司)；實(shí)時(shí)定量-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司);轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000和Trizol RNA提取試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒和全蛋白提取試劑盒(南京凱基生物科技公司)；兔抗人E-鈣黏附蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、N-cadherin抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 向解凍復(fù)蘇后的FHC、SW480、HT29、LOVO和SW620細(xì)胞中加入含10%胎牛血清和100 U/ml青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基，置于飽和濕度、5%CO2的37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁80%左右時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化，并以1∶2比例傳代。選取長(zhǎng)勢(shì)良好的第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 采用Trizol法提取FHC、SW480、HT29、LOVO和SW620細(xì)胞的總RNA后，參照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說(shuō)明書步驟，采用2-△△Ct法檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MVIH的表達(dá)水平。其中，由上海生工生物合成的PCR引物如下：LncRNA MVIH上游引物序列為5′-AATTTTGCACATCTGAACAGCC-3′，下游引物序列為5′-TTCAAAATCCCA-CTACGCCCA-3′；GAPDH上游引物序列為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物序列為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞分組和轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為:①對(duì)照組：正常培養(yǎng)；②陰性組：轉(zhuǎn)染lncRNA MVIH干擾序列的陰性對(duì)照si-NC；③干擾組：轉(zhuǎn)染lncRNA MVIH干擾序列si-MVIH，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620以每孔3×104個(gè)接種至6孔細(xì)胞板上后，在飽和濕度、5%CO2、37℃條件下常規(guī)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞達(dá)75%匯合度時(shí)，參照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000說(shuō)明書，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組將si-NC和si-MVIH分別轉(zhuǎn)染至SW620細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染5 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化收集各組細(xì)胞，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MVIH的表達(dá)水平以評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效果。

1.5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞以每孔100 μl(含103個(gè)細(xì)胞)接種至96孔細(xì)胞板上，另將不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為調(diào)零孔。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72和96 h時(shí)取樣，參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)各組細(xì)胞在450 nm處的光密度(OD)值。重復(fù)檢測(cè)3次。

1.6平板克隆實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞以每孔100 μl(含103個(gè)細(xì)胞)接種至6孔細(xì)胞板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)12～15 d，當(dāng)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng)。以甲醛固定細(xì)胞20 min后，使用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。洗去染液后，自然晾干。將超過50個(gè)細(xì)胞的集落作為1個(gè)有效克隆數(shù)，在倒置顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)各組克隆細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7Transwell小室檢測(cè) 采用無(wú)血清培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3組細(xì)胞制成濃度為3×105個(gè)/ml單細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液200 μl接種于人工基底膜包被(侵襲實(shí)驗(yàn))或者未包被(遷移實(shí)驗(yàn))的Transwell小室上室中，并在下室中加入600 μl含血清的培養(yǎng)基。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)過夜后，將小室取出，使用棉簽小心擦去上室內(nèi)殘留的細(xì)胞，以4%多聚甲醛固定和0.1%結(jié)晶紫染色。洗去染液后，自然干燥，在倒置顯微鏡下每個(gè)樣品隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察各組的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8Western印跡 測(cè)參照全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書步驟，提取轉(zhuǎn)染48 h后的3組細(xì)胞的總蛋白，并采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書定量總蛋白的濃度。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混勻后，在沸水浴中煮沸變性5 min。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說(shuō)明書制備SDS-PAGE凝膠，按照每孔60 μg樣品上樣行電泳分離。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜。經(jīng)5%脫脂奶粉封膜2 h后，浸入E-cadherin(1∶800)、Vimentin(1∶800)、N-cadherin(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗工作液4℃下孵育24 h。次日，再以辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶200)室溫孵育1.5 h后，滴加ECL顯色劑暗室內(nèi)顯影曝光。以GAPDH為內(nèi)參，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各組細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白的表達(dá)水平。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA MVIH在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) FHC、SW480、HT29、LOVO、SW620細(xì)胞lncRNA MVIH的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.72±0.13、1.58±0.10、1.85±0.16和2.38±0.21，5種細(xì)胞株lncRNA MVIH表達(dá)水平差異顯著(F=76.826，P=0.000)。與FHC細(xì)胞相比，SW480、HT29、LOVO和SW620細(xì)胞lncRNA MVIH表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)，且SW620細(xì)胞lncRNA MVIH表達(dá)水平最高(P<0.05)。故選用SW620細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2轉(zhuǎn)染后結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞lncRNA MVIH的表達(dá) 與對(duì)照組相比，陰性組lncRNA MVIH表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，干擾組lncRNA MVIH表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.3下調(diào)lncRNA MVIH對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞增殖 與對(duì)照組相比，陰性組24 h后增殖能力、克隆細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，干擾組48 h后增殖能力、克隆細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 下調(diào)lncRNA MVIH對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞克隆增殖能力的影響

2.4下調(diào)lncRNA MVIH對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞侵襲遷移的影響 與對(duì)照組相比，陰性組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)，干擾組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 下調(diào)lncRNA MVIH對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞侵襲、遷移的影響(結(jié)晶紫，×200)

表2 各組侵襲、遷移細(xì)胞數(shù)比較個(gè))

2.5下調(diào)lncRNA MVIH對(duì)結(jié)直腸癌SW620細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 與對(duì)照組相比，陰性組E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白無(wú)顯著差異(P>0.05)，干擾組E-cadherin蛋白顯著升高，而N-cadherin和Vimentin蛋白顯著降低(P<0.05)。見圖3和表3。

圖3 Western印跡檢測(cè)Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達(dá)

表3 各組Vimentin、E-cadherin和N-cadherin蛋白表達(dá)水平比較

3 討 論

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，我國(guó)每年結(jié)直腸癌的新發(fā)病例和死亡病例約有25萬(wàn)和14萬(wàn)〔11〕。由于結(jié)直腸癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已為晚期，發(fā)生局部轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失手術(shù)治療的最佳時(shí)期，而針對(duì)晚期常用的化療會(huì)引起一定的副作用，且癌細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥使患者5年生存率不高〔12〕。異常表達(dá)的lncRNA如lncRNA-MALAT1、ZFAS1等在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著抑癌或致癌的重要作用，被認(rèn)為是結(jié)直腸癌潛在的治療靶點(diǎn)〔13～15〕。研究顯示，lncRNA MVIH與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔16〕。Nie等〔17〕指出，lncRNA MVIH在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)升高，且其表達(dá)水平與患者預(yù)后、腫瘤的TNM分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)；敲低lncRNA MVIH表達(dá)可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2/9抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲。Zhuang等〔18〕報(bào)道，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和組織中l(wèi)ncRNA MVIH表達(dá)上調(diào)，lncRNA MVIH表達(dá)的改變與患者總生存率低有關(guān)；體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)得出lncRNA MVIH表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，反之，下調(diào)lncRNA MVIH表達(dá)則抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移；lncRNA MVIH被認(rèn)為是一種膠質(zhì)瘤潛在的治療靶點(diǎn)。盡管唐曦等〔10〕指出lncRNA MVIH高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良、生存時(shí)間短和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但lncRNA MVIH在結(jié)直腸癌中的作用并不清楚。本研究結(jié)果提示lncRNA MVIH可能在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮著重要作用；下調(diào)lncRNA MVIH表達(dá)可抑制SW620細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型的生物過程，可賦予細(xì)胞轉(zhuǎn)移和入侵的能力，是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵；上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)減少及間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin等表達(dá)增多是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要特征〔19，20〕。耿宣等〔21〕研究指出，E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)減少，N-cadherin和Vimentin表達(dá)增多，與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，被認(rèn)為與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示lncRNA MVIH可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。