◎ 胡同靜，劉艷容，劉 敏，嚴(yán) 婷

（1.江蘇蘇測檢測認(rèn)證有限公司，江蘇 南京 210019；2.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，江蘇 南京 210019）

為了保證日常飲用水的質(zhì)量安全，有關(guān)部門通過如《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2016）等國家標(biāo)準(zhǔn)對礦泉水中可能存在銅綠假單胞菌的檢測限值提供了規(guī)范[1]。有關(guān)部門在市面上發(fā)現(xiàn)礦泉水可能存在銅綠假單胞菌污染風(fēng)險時，應(yīng)督促生產(chǎn)廠家立即停止銷售。生產(chǎn)廠家也必須要嚴(yán)格控制生產(chǎn)過程中的各道生產(chǎn)工序，防止水污染，確保飲用水安全[2]。為了測試實驗室對于飲用天然礦泉水的微生物檢測能力、考核技術(shù)人員工作水平、提高實驗室檢測水平、增強(qiáng)實驗室競爭力，實驗室參加了本次能力驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基：CN瓊脂平板、金氏B培養(yǎng)基、綠膿菌素測定培養(yǎng)基，均采購自北京陸橋微生物制劑有限公司，配制后使用；乙酰胺肉湯、氧化酶試劑，均采購自北京陸橋微生物制劑有限公司，直接使用成品。

標(biāo)準(zhǔn)菌株：按照國標(biāo)要求，試驗中使用銅綠假單胞菌ATCC27853作為陽性對照，熒光假單胞菌ATCC13525作為陰性對照。

1.2 儀器與設(shè)備

微孔濾膜過濾器及配套一次性無菌塑料濾杯；微生物培養(yǎng)箱；365 nm紫外分析儀；VITEK全自動微生物檢測系統(tǒng)。

1.3 試驗方法

本次試驗中的所有操作應(yīng)在100級或以上的潔凈工作臺進(jìn)行，尤其是過濾操作。

1.3.1 樣品處理

將固體樣品用520 mL無菌水再水化，制成受試物原液待用。

1.3.2 樣品稀釋

取30 mL受試物原液，加入270 mL無菌水做10倍梯度稀釋，即為受試物10-1稀釋液。依次再取30 mL受試物10-1稀釋液加入270 mL無菌水制成受試物10-2稀釋液，取30 mL受試物10-2稀釋液加入270 mL無菌水制成受試物10-3稀釋液待用。

1.3.3 樣品過濾

（1）安裝無菌濾膜、濾杯。用無菌水將0.45 μm濾膜潤濕，取無菌鑷子夾取濾膜平鋪于微孔濾膜過濾器的濾頭，完全貼合不留縫隙。將一次性塑料濾杯安裝于微孔濾膜過濾器上。

（2）取樣。將受試物原液和各梯度稀釋液分別加入微孔濾膜過濾器的濾杯中至250 mL刻度線，啟動微孔濾膜過濾裝置。待其過濾結(jié)束后，用無菌鑷子將過濾后的濾膜轉(zhuǎn)移平鋪于CN瓊脂平板上。將平板倒置，于（36±1）℃培養(yǎng)24～48 h，觀察濾膜上菌落的生長情況并計數(shù)。

（3）挑取典型菌落通過氧化酶試驗、金氏B培養(yǎng)基、綠膿菌素試驗、乙酰胺肉湯進(jìn)行后續(xù)驗證。最終的銅綠假單胞菌菌落計數(shù)按公式進(jìn)行計數(shù)。

1.3.4 確定性試驗

（1）營養(yǎng)瓊脂。將受試物經(jīng)濾膜過濾后于（36±1）℃培養(yǎng)20～24 h，選取需要驗證的可疑菌落通過劃線的方式接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，于（36±1）℃培養(yǎng)20～24 h進(jìn)行純化。檢查再次純化后的菌落，并對最初顯紅褐色的菌落進(jìn)行氧化酶試驗驗證。

（2）氧化酶試驗。取2～3滴新配制的氧化酶試劑滴到置于平皿里的潔凈濾紙上，用接種環(huán)或玻璃棒將適量的營養(yǎng)瓊脂中疑似菌落純種培養(yǎng)物涂布在預(yù)備好的濾紙上，在10 s內(nèi)顯深藍(lán)紫色的記錄為陽性。如果使用氧化酶試紙一類的測試產(chǎn)品可按照使用說明書進(jìn)行本項測試。

（3）金氏B培養(yǎng)基。將上述菌落呈紅褐色且氧化酶試驗結(jié)果呈陽性的培養(yǎng)物接種于金氏B培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)24 h～5 d（視情況而定）。需每天取出在365 nm波長的紫外燈下檢查其是否產(chǎn)生熒光性，將5 d內(nèi)產(chǎn)生熒光的菌落記錄為陽性。

（4）綠膿菌素試驗。取可疑菌落2～3個，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h，加入三氯甲烷3～5 mL，充分振蕩培養(yǎng)基使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內(nèi)，待三氯甲烷提取液呈藍(lán)色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中并加入1 mol·L-1的鹽酸1 mL左右，振蕩后靜置片刻。若上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時表示受試物中有綠膿菌素存在，記錄為陽性。該實驗過程中三氯甲烷為有機(jī)溶劑，移取過程中應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，注意不要沾至皮膚上。

（5）乙酰胺液體培養(yǎng)基。將純種培養(yǎng)物接種到裝有乙酰胺液體培養(yǎng)基的若干試管中，于（36±1）℃培養(yǎng)20～24 h。然后向每支試管受試物中分別加入1～2滴鈉氏試劑后檢查產(chǎn)氨情況，若出現(xiàn)從深黃色到磚紅色的明顯顏色變化則記錄為陽性，如沒有變化則記為陰性。

（6）在國標(biāo)要求的相關(guān)驗證試驗之外，可以對疑似菌落提取物進(jìn)行VITEK全自動微生物檢測系統(tǒng)分析作為補(bǔ)充驗證，以確定是否為銅綠假單胞菌。

1.3.5 計數(shù)方法

將產(chǎn)生綠膿色（藍(lán)色/綠色）或氧化酶反應(yīng)呈陽性、在365 nm波長紫外燈下產(chǎn)生熒光，且在乙酰胺肉湯中產(chǎn)氨的所有菌落證實為銅綠假單胞菌，對其進(jìn)行計數(shù)。通過計數(shù)培養(yǎng)后濾膜上的菌落以獲得銅綠假單胞菌的數(shù)量，其他呈紅褐色的菌落視情況進(jìn)行進(jìn)一步驗證。

濾膜上的特征菌落可證實為銅綠假單胞菌的菌落。計算菌落數(shù)時應(yīng)考慮到驗證試驗的比例及特定的水量，過濾的水樣的體積應(yīng)為250 mL。菌落計數(shù)按式（1）計算：

式中：P為呈藍(lán)/綠色的菌落數(shù)；F為顯熒光的菌落數(shù)；cF為產(chǎn)氨陽性的顯熒光菌落數(shù)；nF為進(jìn)行產(chǎn)氨測試的顯熒光菌落數(shù)；R為呈紅褐色的菌落數(shù)；cR為產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試均呈陽性的紅褐色菌落數(shù)；nR為進(jìn)行產(chǎn)氨、氧化酶、金氏B培養(yǎng)基上顯熒光測試的紅褐色菌落數(shù)。

根據(jù)藍(lán)色或綠色菌落的計數(shù)和確證性試驗的結(jié)果，計算每250 mL水樣中的銅綠假單胞菌數(shù)量，結(jié)果以CFU/250 mL計算。在整個實驗過程中應(yīng)注意生物安全防護(hù)，避免樣品間交叉污染；實驗結(jié)束后應(yīng)盡快對所有受試物進(jìn)行無害化處理，避免污染環(huán)境[3-5]

2 結(jié)果與分析

由表1、表2可知，實驗室對樣品21-M873的鑒定結(jié)果為銅綠假單胞菌陽性，計數(shù)結(jié)果為8.7×103CFU/250 mL；樣品21-Q877的鑒定結(jié)果為銅綠假單胞菌陽性，計數(shù)結(jié)果為3.8×103CFU/250 mL。

表1 樣品21-M873菌落計數(shù)表

表2 樣品21-Q877菌落計數(shù)表

3 結(jié)論

本次能力驗證實驗對所有疑似菌落都進(jìn)行了完整的基礎(chǔ)性驗證和VITEK分析。通過試驗結(jié)果是否一致，評估實驗人員的實驗準(zhǔn)備、實驗操作、實驗結(jié)果計數(shù)等方面的能力。通過本次能力驗證既考核了技術(shù)人員的工作水平，又提高了實驗室檢測水平，增強(qiáng)實驗室外部競爭力，為實驗室迎接CNAS檢查積累經(jīng)驗，也是實驗室內(nèi)部質(zhì)量的有效補(bǔ)充。本次能力驗證活動取得了滿意的結(jié)果，達(dá)到了實驗室內(nèi)部質(zhì)控、人員考核、水平驗證的預(yù)期目的，為日常檢測工作積累了寶貴的經(jīng)驗。