◎ 陳琳琳，王連鳳，王丹慧，李 慧，郭曉梅，孟慶紅

（1.蒙牛乳業(yè)泰安有限責(zé)任公司，山東 泰安 271000；2.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團(tuán)）有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500）

山梨酸又稱為清涼茶酸、2，4-己二烯酸、2-丙烯基丙烯酸，分子式C6H8O2，是一種食品添加劑，對酵母、霉菌等許多真菌都具有抑制作用，是國際上應(yīng)用最廣的防腐劑，具有較高的抗菌性能，常被用作食品和藥物制劑的防腐劑，還用于動物飼料、藥品、包裝材料等，盡管這些成分的添加對食物起到了防腐保質(zhì)的作用，但對人體健康會造成一定的危害[1]。目前檢測食品中山梨酸含量的方法是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016），因方法同時適用于全系食品的苯甲酸和糖精鈉，對于牛奶山梨酸檢測回收率雖能符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的要求[2-3]，但較苯甲酸、糖精鈉回收率偏低。我國對食品添加劑的檢測準(zhǔn)確性及速度還有很大的成長空間，而高效液相色譜法具有分離效率高、快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏度高、樣品前處理簡單等特點(diǎn)[4-6]。本文通過對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）前處理和儀器分析步驟進(jìn)行梳理研究，通過單因子實(shí)驗(yàn)確定高效液色譜法檢測牛奶中山梨酸的過程優(yōu)化參數(shù)，優(yōu)化分析操作步驟，提升牛奶中山梨酸檢測準(zhǔn)確性，減少檢測操作用時。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水為GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水。亞鐵氰化鉀 [K4Fe（CN）6·3H2O]、乙酸鋅 [Zn（CH3COO）2·2H2O]、乙酸鉛，分析純；甲醇（CH3OH）、乙酸銨（CH3COONH4），色譜純。山梨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)國家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書。水相微孔濾膜，0.22 μm；塑料離心管50 mL；50 mL容量瓶。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，配紫外檢測器；電子天平，感量為0.001 g和0.000 1 g；渦旋振蕩器；離心機(jī)，轉(zhuǎn)速＞ 8 000 r·min-1；超聲波發(fā)生器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：1 000 mg·L-1；標(biāo)準(zhǔn)中間液 1：200 mg·L-1；標(biāo)準(zhǔn)中間液 2：10 mg·L-1，配制成濃度為 0 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.8 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1和 3.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱C18；流動相：甲醇+乙酸銨（20 mmol·L-1），3+97；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.3 樣品沉淀劑優(yōu)化

（1）優(yōu)化前。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL具塞離心管中加水25 mL渦旋混勻，50 ℃水浴超聲20 min冷卻后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)铀?0 mL渦旋混勻后超聲5 min，8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混勻，取適量上清液過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

（2）優(yōu)化后。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL具塞離心管中加水25 mL渦旋混勻，50 ℃水浴超聲20 min冷卻后加2 mL乙酸鉛（2%），混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)铀?0 mL渦旋混勻后超聲5 min，8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至同一50 mL容量瓶，并用水定容至刻度，混勻，取適量上清液過0.22 μm濾膜上機(jī)檢測。

1.3.4 檢測器波長優(yōu)化

山梨酸的最大紫外吸收波長為254 nm[7]，為獲得最大的靈敏度，在1.3.3優(yōu)化后的方法基礎(chǔ)上，將檢測波長從230 nm改變?yōu)?54 nm進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.3.5 操作流程優(yōu)化

（1）方法1。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL具塞離心管中，加水約25 mL，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液2 mL和乙酸鋅溶液2 mL，混勻，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，于殘?jiān)屑铀?0 mL，渦旋混勻后超聲5 min，于8 000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)移到同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混勻。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

（2）方法2。準(zhǔn)確稱取約2 g（精確到0.001 g）試樣于50 mL容量中，加水約25 mL，2%乙酸鉛溶液2 mL，混勻，于50 ℃水浴超聲20 min，冷卻至室溫后用一級水定容，充分混勻后，然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，于8 000 r·min-1離心5 min。取適量上清液過0.22 μm濾膜，待液相色譜測定。

1.3.6 加標(biāo)方式

采用外加標(biāo)的方法，即吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到已稱量好的純牛奶中（純牛奶經(jīng)檢測不含山梨酸），混勻，按試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理、上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品沉淀劑優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 9。通過表1、表2數(shù)據(jù)分析可以看出，更換沉淀劑前，回收率明顯偏低，更換沉淀劑后，各個濃度加標(biāo)點(diǎn)的回收率前明顯提升且大于98 %，而且精密度均小于10%。

表1 未改變沉淀劑各加標(biāo)點(diǎn)回收率表

表2 更換沉淀劑后各加標(biāo)點(diǎn)回收率表

2.2 檢測器波長優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999 9。波長為254 nm時，通過表2與表3數(shù)據(jù)比較可以看出，波長改變后各加標(biāo)點(diǎn)回收率沒有明顯變化，所以改變波長對山梨酸回收率影響不大。

表3 波長為254 nm時各加標(biāo)點(diǎn)回收率表

2.3 操作流程優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.999。通過優(yōu)化前處理操作流程，得出數(shù)據(jù)見表4，通過表2和表4對比可以得出，檢測流程優(yōu)化后，回收率效果略有提升，但提升幅度不大，精密度小于10%；方法1和方法2過程比較可以看出，方法2更加簡便易操作，而且避免了前處理煩瑣等容易引入誤差的弊端。

表4 改變流程后各加標(biāo)濃度點(diǎn)回收率表

3 結(jié)論

通過對《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）牛奶中山梨酸加標(biāo)檢測的前處理和儀器分析步驟進(jìn)行梳理研究，并通過單因子實(shí)驗(yàn)確定過程優(yōu)化參數(shù)得出使用2%乙酸鉛較亞鐵氰化鉀和乙酸鋅組合作為蛋白沉淀劑時回收率明顯提高；在230 nm與245 nm波長條件下檢測牛奶中山梨酸回收率結(jié)果差異不大；優(yōu)化操作步驟，使前處理更加簡便易操作，且回收率結(jié)果依然較好，比優(yōu)化前略有提升，但提升幅度不大。所以經(jīng)過一系列的改進(jìn)優(yōu)化，得出方法2對提高牛奶中山梨酸回收率的效果更好，而且對準(zhǔn)確性提高更加有優(yōu)勢。