陳百勝，李 平，周 影，吳杏榆，陳巍峰，周平紅，鞏堯瑤，林生力*

1.復旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院內(nèi)鏡中心，廈門 361000

2.復旦大學附屬中山醫(yī)院內(nèi)鏡中心，上海 200032

3.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南京 210029

約80%的結(jié)直腸癌形成經(jīng)歷“腺瘤-癌”的演變過程［1］。目前我國內(nèi)鏡檢查的普及率仍較低，尋找結(jié)直腸癌變的早期分子標志物可為結(jié)直腸癌的早期診斷提供新的分子靶標。早幼粒細胞白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein，PML）基因被發(fā)現(xiàn)于急性早幼粒細胞白血病患者。既往研 究［2-3］表明，PML是腫瘤抑制因子，參與調(diào)控腫瘤細胞的生長、衰老及凋亡；其表達不僅局限于血液腫瘤，在前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等實體腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中也起作用。本課題組前期研究［4］發(fā)現(xiàn)，PML在結(jié)直腸正常組織中的表達明顯高于腸癌組織，且PML的表達與血管表皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、表 皮 生 長 因 子 受 體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表達存在相關性。

本研究通過檢測PML在腸癌、結(jié)直腸腺瘤及正常結(jié)直腸黏膜臨床標本中的表達情況，分析PML表達與腸癌細胞增殖、侵襲力的關系，并檢測PML與VEGF、EGFR表達之間的關系，進而探討PML在結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料選擇 2016至2018年在復旦大學附屬中山醫(yī)院就診的120例結(jié)直腸癌合并結(jié)直腸腺瘤的患者，術前進行腸鏡檢查時采用一次性活檢鉗取腸癌組織、腺瘤組織及正常部位腸黏膜組織各兩份，一份液氮凍存、一份用4%多聚甲醛固定。液氮凍存組織于－80℃保存，4%多聚甲醛固定的組織用于制作石蠟切片。本研究獲復旦大學附屬中山醫(yī)院倫理委員會批準（B2012-098），納入研究的患者均簽署了生物樣本及健康信息捐贈知情同意書。

1.2 細 胞 與 試 劑HT-29、HCT-15、LoVo、SW620、SW1116、HCT-8、HCT-116、COLO205、COLO320、SW480細胞株購自中國科學院上海細胞 庫；McCoy’s 5A、RPMI-1640、L-15、胎 牛 血清均為Gibco公司產(chǎn)品。Homo-PML干擾載體及過表達載體購自GeneCopoeia公司。

1.3 免疫組化120例患者的正常結(jié)直腸黏膜組織、腺瘤組織、腸癌組織的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，采用微波爐法進行抗原修復。5%山羊血清封閉后，用兔抗人PML多克隆抗體（1∶100，ab53773，Abcam）4℃孵育過夜；PBS清洗后，用生物素標記抗兔二抗 （1∶1 000，Dako Denmark A/S） 37℃孵育 30 min；PBS清洗后，DAB溶液顯色，鏡下控制染色時間，蘇木精復染10 min，蒸餾水沖洗。

封片后，鏡下觀察組織細胞中蛋白的表達情況，采用二級計分法評價 。根據(jù)陽性細胞所占比例（觀察5個以上高倍鏡視野）計分：0%～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2 分，50%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色強度計分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃或深黃色為2分，褐或棕褐色為3分。總分為2項評分結(jié)果相乘。

1.4 Western 印跡提取細胞和組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以每泳道90 μg蛋白，進行12% SDS-PAGE電泳；電流300 mA轉(zhuǎn)膜90 min ；5%脫脂奶粉封閉1.5 h。加入兔抗人PML多克隆抗體（1∶100，Abcam）4℃孵育過夜；TBST洗膜3次，辣根過氧化酶標記的二抗（1∶1 000，Dako Denmark A/S）室溫孵育1.5 h；TBST 洗膜 3次，ECL顯色3～5 min。使用G:BOX Chemi XR5成像，Gel-Pro 32軟件進行灰度分析。

1.5 細胞培養(yǎng)和干預HT-29、HCT-15、LoVo、 SW620、SW1116、HCT-8、HCT-116、COLO205、COLO320、SW480腸 癌 細 胞 株培 養(yǎng)：HT-29、HCT-116細胞在含10% FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)；LoVo細胞在含10%FBS的 Ham’s F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SW480、SW620、SW1116細胞在含10% FBS的L-15培養(yǎng)基中培養(yǎng)；HCT-15、HCT-8、COLO205、COLO320細胞在含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有細胞在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育。

綠色熒光蛋白（GFP）標記的PML靶向短發(fā)夾RNA（shRNA-PML）、陰性對照（sh-NC）、過表達PML、過表達對照（PML-NC）均由慢病毒包裹，所有病毒載體由上海吉瑪制藥技術有限公司合成，相應載體分別轉(zhuǎn)染到 各 細 胞 系 中。shRNA-PML靶 序 列1為5′- GTGTACCGGCAGATTGTGGAT-3′，靶 序 列2為5′-GTGTACGCCTTCTCCATCAAA-3′，靶 序 列3為5′-CAATACAACGACAGCCCAGAA-3′，靶 序列4為5′-GCCAGTGTACGCCTTCTCCAT-3′。將各shRNA雙鏈與慢病毒shRNA表達載體Lenti-U6-shRNA-GFP制備shRNA-PML載體（sh-NC為空載體）。從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取PML（NM_033238.2）編碼序列、進行全基因合成，并在目的基因的C端添加GFP片段，與慢病毒過表達載體Lenti-CMVpuro制備PML過表達載體（PML-NC為空載體）。1.6 qPCR檢測 用TRIzol提取總RNA，檢測RNA濃度，按Bio-KT cDNA Cirst Strand Cynthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，檢測cDNA含量。按Promega GoTaq qPCR Master Mix Kit試劑盒說明書，于ABI7700熒光定量PCR儀進行反應。反 應條件：預變性95℃ 5 min；95℃ 15 s、60℃ 20 s、 72℃ 40 s，反應40個循環(huán)。GAPDH上游引物為5′-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3′，下 游 引 物為5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′；PML上游引 物 為5′-CAGCATCTACTCCAAGGCCG-3′，下游引物為5′-GTAGCAGGCCAAGATAGGGC-3′；VEGF上游引物為5′-CTGTCTAATGCCCTGGAGCC-3′，下游引物為5′-ACGCGAGTCTGTGTTTTTGC-3′；EGFR上游引物為5′-GCCTCCAGAGGATGTTCAAT-3′，下游引物為5′-GACATAACCAGCCACCTCCT-3′。

1.7 Transwell檢測細胞侵襲細胞饑餓24 h后，用無血清培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至 2×105/mL；transwell小室包被Matrigel膠，放入24孔板；取細胞懸液100 μL加入小室，24孔板每孔中加入 600 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去Matrigel膠和上室的細胞，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS 清洗，顯微鏡下攝片（×200）并計數(shù)。

1.8 劃痕法檢測細胞遷移在6孔板背面標記水平線，將處于對數(shù)生長期的細胞消化并接種至6孔板中；待細胞密度為80%～90%時，用無菌槍頭在6孔板中均勻劃線，劃線垂直于背面水平線；用PBS洗去漂浮細胞，靜止2 h后拍照；更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后拍照（×100）。用ImageJ軟件測量細胞遷移距離。細胞遷移率= （0 h劃痕寬度－培養(yǎng)24 h后劃痕寬度）/ 0 h劃痕寬度×100%。

1.9 PI法檢測細胞周期胰酶消化后收集單細胞懸液（6孔板），PBS洗滌并離心，70%預冷乙醇4℃固定過夜；用PBS洗去固定液，細胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾，離心去上清，加100 μL RNase A，37℃水浴 30 min，400 μL PI避光染色30 min，上機檢測。

1.10 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡胰酶消化收集單細胞懸液， PBS 洗滌并離心；加入Annexin V-FITC結(jié)合液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫下避光孵育15 min，加入5 μL PI染色，上機檢測。

1.11 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗或方差分析，檢驗水準（α）為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 組織中PML表達情況免疫組化結(jié)果（圖1）顯示：PML在正常結(jié)腸組織中的陽 性 率 為（60.25±10.35）%、在 腺 瘤 組 織中 為（45.33±6.92）%、在 腸 癌 組 織 中 為（37.21±12.60）%。與正常組織相比，PML在腺瘤、腸癌組織中表達均下降（P＜0.05）；而且腸癌組織中PML較腺瘤組織表達進一步下降 （P＜0.05）。Western 印跡結(jié)果（圖2）也顯示：與正常組織相比，腺瘤、腸癌組織中的PML表達下降（P＜0.05）；且腸癌組織中PML較腺瘤組織表達進一步下降（P＜0.05）。

圖1 免疫組化顯示PML在不同結(jié)直腸組織中的表達

圖2 Western印跡檢測PML在不同結(jié)直腸組織中的表達

2.2 腸癌細胞株PML表達及侵襲情況Western 印跡（圖3A）及qPCR（圖3B）顯示：不同腸癌細胞株PML表達水平從高到低依次為：SW1116、HT-29、SW620、COLO205、COLO320、LoVo、HCT-8、SW480、HCT-116、HCT-15。分 別 從PML高表達和低表達的細胞株中選取SW1116、HT-29、SW620、HCT-116、HCT-15細胞株，進一步行細胞transwell試驗，結(jié)果（圖3C）示：PML表達較低的細胞株（HCT-116、HCT-15）較PML表達較高的細胞株（SW1116、HT-29、SW620）侵襲能力強；每孔遷移細胞數(shù)分別為：HCT-116（92.67±2.52）個、HCT-15（91.67±2.08）個、SW1116（38.33±1.53）個、SW620（53.33±4.16）個、HT-29（51.00±3.61）個。

圖3 不同腸癌細胞株PML的表達及侵襲情況

2.3 PML對腸癌細胞遷移、侵襲、增殖、凋亡的影響選擇HT-29、SW620、SW1116細胞株進行細胞遷移、侵襲、周期和凋亡試驗。

2.3.1 細胞遷移結(jié)果（圖4）顯示：各細胞株PML沉默組遷移率均較正常、沉默（shRNA-NC組）對照組升高（P＜0.05）；各細胞株PML高表達組遷移率較正常、過表達（PML-NC組）對照組下降（P＜0.05）。

圖4 沉默、過表達PML對不同腸癌細胞株遷移的影響

2.3.2 細胞侵襲Transwell實驗結(jié)果（圖5）顯示：PML高表達組的侵襲力較正常對照組、過表達對照組均下降（P＜0.05）；PML沉默組的侵襲力較正常對照組、沉默對照組均增強（P＜0.05）。

圖5 Transwell法檢測沉默、過表達PML對不同腸癌細胞株侵襲力的影響

2.3.3 細胞周期結(jié)果（圖6A～6B）示：與對照組相比，HT-29、SW620、SW1116細胞株PML過表達組G0/G1期細胞比例均升高（P＜0.05），PML沉默組G0/G1期細胞比例均降低（P＜0.05）。與對照組相比，HT-29、SW1116細胞株PML過表達組S期細胞比例均降低（P＜0.05），SW620細胞株PML過表達組S期細胞比例無明顯改變；3種細胞株PML沉默組S期細胞比例均升高（P＜0.05）。

2.3.4 細胞凋亡結(jié)果（圖6C）顯示：HT-29、SW620、SW1116細胞株PML過表達組凋亡率均升高（P＜0.05），PML沉默組凋亡率降低（P＜0.05）。

圖6 PML對不同腸癌細胞株的增殖、凋亡的影響

2.4 腸癌細胞中PML表達對VEGF、EGFR表達的影響PCR結(jié)果（圖7）顯示：過表達PML后，HT-29、SW620、SW1116細胞株中VEGF、EGFR表達均降低（P＜0.05）；沉默PML后，HT-29、SW620、SW1116細胞株中VEGF、EGFR的表達均升高（P＜0.05）。

圖7 PML對VEGF、EGFR mRNA表達的影響

3 討 論

PML是一種重要的抑癌蛋白，參與調(diào)控 DNA復制、轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳沉默等功能［5］。正常細胞中，PML是早幼粒細胞白血病蛋白核體（promyelocytic leukemia nuclear bodies， PMLNBs）的組成成分，可以招募包括小分子泛素相關 修 飾 物 蛋 白（small ubiquitin-related modifier protein，SUMO）在內(nèi)的30 多種不同的蛋白到 PML-NBs區(qū)域，并通過 SUMO修飾等參與調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、DNA損傷、凋亡和衰老等生命活動［6-7］。

本研究首先在結(jié)直腸癌合并結(jié)直腸腺瘤的臨床標本中證實，腺瘤組織的PML表達較正常組織減少，而腸癌組織較腺瘤組織中進一步減少，提示PML可能在“腺瘤-腸癌”發(fā)展過程中起一定作用；在通過篩選獲得的PML表達較高的3種細胞株（HT-29、SW620、SW1116）及表達較低的2種細胞株（HCT-116、HCT-15）中發(fā)現(xiàn)，PML表達較低的細胞株侵襲力較強；在HT-29、SW620、SW1116細胞株中發(fā)現(xiàn)，PML過表達組細胞遷移率、侵襲力下降，細胞周期呈現(xiàn)G0/G1期細胞比例升高、S期細胞比例降低，凋亡率升高，PML沉默組相反。

既往研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，多種實體腫瘤中EGFR高表達或異常表達，其與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移有關，而VEGF誘導腫瘤血管形成作用強、特異性高。Bernardi等［10-11］報道，在缺氧環(huán)境下，PML可通過抑制mTOR/HIF-1α/VEGF信號通路而發(fā)揮抑制腫瘤進展的作用。本研究中，PML沉默后，VEGF、EGFR的表達升高；而PML過表達后VEGF、EGFR的表達下降，提示PML可能通過負調(diào)控VEGF、EGFR而發(fā)揮抑制腸癌細胞遷移、侵襲的作用。

綜上所述，本研究表明，PML在結(jié)直腸腺瘤、腸癌組織中均呈低表達，且PML表達較低的腸癌細胞株侵襲力更強；沉默PML可促進腸癌細胞的遷移、侵襲、增殖，抑制其凋亡，而過表達PML可抑制腸癌細胞的侵襲、遷移、增殖，促進其凋亡。PML在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用可能與其對VEGF、EGFR的負調(diào)控有關，具體分子機制有待進一步研究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。