董寶霞，楊玉瑩，荊海霞，張勤文，魏 青 (青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

牦牛(yak)是世界最著名的牛種之一，分布在青藏高原及其毗鄰的周邊地區(qū)[1]，可穩(wěn)定適應(yīng)高原低氧、低壓、高寒的惡劣環(huán)境，其可利用的有乳、肉、皮毛和皮革、糞便等，也可生產(chǎn)一些文化或醫(yī)藥意義上的副產(chǎn)品[2]，不僅具有極為重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還表現(xiàn)了特殊的生態(tài)和社會(huì)地位，被譽(yù)為“高原珍寶”[3]。其中，牦牛乳是最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一種天然資源，綠色、高品質(zhì)、高營(yíng)養(yǎng)為其優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)[4]。牦牛乳乳香濃郁，味道微甜，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的特種乳[5]，具有抗炎癥、抗氧化、抗缺氧及抗疲勞等特殊生理功能[6-7]。但牦牛飼養(yǎng)分散，且由于放牧環(huán)境、飼養(yǎng)方式、品種特性等原因[8-10]，牦牛乳產(chǎn)量相對(duì)較低[4,11]，不僅極大限制牦牛乳及其制品在市場(chǎng)上的經(jīng)濟(jì)地位，也在一定程度上造成了優(yōu)質(zhì)資源浪費(fèi)，因此深入探討影響牦牛乳腺上皮生長(zhǎng)及蛋白合成的相關(guān)因子、提高牦牛的產(chǎn)奶量以及牦牛乳的品質(zhì)顯得尤其重要。

瘦素(leptin,LEP)主要由脂肪細(xì)胞合成并分泌，LEP及其受體在乳腺的腺泡上皮細(xì)胞中特異表達(dá)，可作為乳腺代謝的自分泌和旁分泌介質(zhì)，維持哺乳期間乳腺腺泡上皮細(xì)胞活性[12]，支持LEP在乳腺中的生物學(xué)重要性[13]。LEP在乳腺泌乳期主要激活JAK-STAT5/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[14]，它的激活與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化有關(guān)，也參與乳腺上皮細(xì)胞(MECs)的凋亡和退化[15]。

LEP通過(guò)與其分布廣泛的受體(leptin receptor，LEPR)結(jié)合而發(fā)揮多樣功能性，而LEPR不具有內(nèi)在酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，需與細(xì)胞質(zhì)激酶結(jié)合，在乳腺泌乳期通過(guò)激活JAK/STAT5信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺乳酪蛋白基因表達(dá)和乳蛋白的合成[15-16]。目前關(guān)于乳腺LEP的研究相對(duì)豐富，但大部分還是集中在組織分布上[17]，關(guān)于外源性LEP作用MECs并深入探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子機(jī)制的研究數(shù)據(jù)相對(duì)薄弱，尤其以牦牛MECs為載體的探究更為少見。故本研究以無(wú)催乳素(prolactin,PRL)和有催乳素添加(500 μg/L)為前提，擬通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度LEP對(duì)牦牛MECs STAT5a mRNA表達(dá)水平的影響，Western blot技術(shù)檢測(cè)STAT5a及LEPR蛋白水平表達(dá)特點(diǎn)，探討不同質(zhì)量濃度LEP對(duì)STAT5a和LEPR表達(dá)規(guī)律的影響，旨在分析LEP對(duì)牦牛乳蛋白合成相關(guān)因子的影響，也為L(zhǎng)EP提高牦牛乳品質(zhì)等方面的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源和試劑實(shí)驗(yàn)室分離純化后的第5代牦牛MECs；DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液(01-172-1ACS)；胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(41400-045)、氫化可的松(H0135)、表皮生長(zhǎng)因子(E4127)、催乳素(peprotech-100-07)、0.25% 胰蛋白酶/0.05% EDTA(03-052)；總RNA提取試劑盒(離心柱型)(DP419)、核酸染料(RT210)、一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(KR118-02)、Super Real熒光定量預(yù)混試劑-增強(qiáng)版試劑盒(FP205)；全蛋白提取試劑盒(KGP250)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PC0020)、4×蛋白上樣緩沖液(P1016)、凝膠制備試劑盒(P1200)、LEPR兔抗多克隆抗體(bs-0961R)、STAT5a兔抗多克隆抗體(bs-1142R)、HRP-羊抗兔IgG(BA1054)、β-actin鼠抗單克隆抗體(BM0627)、HRP-羊抗鼠IgG(BA1050)、脫脂奶粉(232100)、ECL Plus超敏發(fā)光液試劑盒(PE0010)。

1.2 試劑配制傳代培養(yǎng)液：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液+2% 雙抗+15% FBS+1 mg/L胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒+200 μg/L氫化可的松+10 μg/L表皮生長(zhǎng)因子；LEP/PRL(-)培養(yǎng)液：LEP(0,50，100，200，400，800 μg/L)+傳代培養(yǎng)液；LEP/PRL(+)培養(yǎng)液：LEP(0，50，100，200，400，800 μg/L)+傳代培養(yǎng)液+PRL(500 μg/L)。

1.3 樣品處理選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第4代牦牛MECs，經(jīng)0.25%胰酶/0.05% EDTA消化、收集并離心，利用傳代培養(yǎng)液統(tǒng)一細(xì)胞濃度，等量接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并作好標(biāo)記。每個(gè)LEP處理質(zhì)量濃度均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，其中以0 μg/L處理組作為對(duì)照。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至培養(yǎng)瓶底壁約80% 時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入2～3 mL PBS將細(xì)胞表面潤(rùn)洗2～3遍，在各培養(yǎng)瓶中加入對(duì)應(yīng)處理組的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.4 總RNA提取及cDNA合成根據(jù)總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取處理后細(xì)胞的總RNA，利用蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度及純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后按一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行cDNA第1鏈合成，產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)根據(jù)NCBI公布的牦牛STAT5a(XM_005899207.2)及內(nèi)參β-actin(XM_005887322.2)的基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并應(yīng)用NCBI的BLAST功能對(duì)序列進(jìn)行同源性分析以保證引物專一性，引物序列見表1，送由華大基因合成；STAT5a和β-actin基因在61℃退火溫度下進(jìn)行普通 PCR 擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一，產(chǎn)物大小與預(yù)期相符。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)STAT5a在mRNA水平上的相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系為20 μL，其中10 μL 2×SuperRealPreMixPlux，上、下游引物各0.6 μL，1 μL cDNA，7.8 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 s；94℃變性5 s，61℃退火30 s；72℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)，各處理組樣品均做3次組內(nèi)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后觀察溶解曲線，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列及參數(shù)

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)試驗(yàn)根據(jù)全蛋白提取試劑盒及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞全蛋白的提取及濃度測(cè)定，統(tǒng)一蛋白濃度后，以細(xì)胞全蛋白∶4×蛋白上樣緩沖液=3∶1制備預(yù)混液，100℃處理5 min進(jìn)行蛋白變性；根據(jù)內(nèi)參β-actin和STAT5a、LEPR相對(duì)分子質(zhì)量分別為42，90，28 kDa，選擇制備12%和8%的分離膠及5%的濃縮膠。電泳條件：濃縮膠恒壓80 V 30 min；分離膠恒壓120 V 80 min，轉(zhuǎn)膜前將PVDF膜于甲醇內(nèi)浸泡3 min，于轉(zhuǎn)膜液中平衡10 min。轉(zhuǎn)膜條件：200 mA 120 min，1×TBST洗膜15 min，換液2次；將PVDF膜放入1×TBST配制的5%脫脂乳中，37℃搖床內(nèi)(80 r/min)封閉120 min；于一抗(1∶1 000稀釋)內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；1×TBST洗膜90 min，換液6～9次，于25℃搖床內(nèi)(90 r/min)孵育二抗(1∶5 000稀釋)120 min；1×TBST洗膜90 min，換液6～9次，ECL試劑曝光，利用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄；用AIC.AlphaView軟件檢測(cè)目的蛋白及β-actin蛋白條帶的灰度值。

1.7 數(shù)據(jù)處理以β-actin為內(nèi)參，0 μg/L LEP處理組為對(duì)照，利用Excel 2010、IBM SPSS Statistics 23.0和Origin 8.0進(jìn)行LEPR以及STAT5a蛋白的相對(duì)表達(dá)水平(n=3)的單因素方差分析及結(jié)果圖形的繪制。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量濃度LEP下牦牛MECs STAT5a mRNA表達(dá)水平經(jīng)檢測(cè)，不同質(zhì)量濃度LEP作用下的細(xì)胞總RNA純度均較高，D260/D280值為1.9～2.1 ，電泳后清晰可見3條帶，且28S條帶亮度約為18S的2倍(圖1)，說(shuō)明所提取的RNA可用于后續(xù)操作。溶解曲線顯示：STAT5a和β-actin的Tm值均一且無(wú)雜峰，說(shuō)明引物特異性良好，所收集的熒光強(qiáng)度均來(lái)自特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。

RT-qPCR結(jié)果顯示，培養(yǎng)液內(nèi)有無(wú)PRL對(duì)STAT5a mRNA在不同質(zhì)量濃度LEP作用下的相對(duì)表達(dá)量影響較大：無(wú)PRL時(shí)，不同質(zhì)量濃度LEP對(duì)STAT5a mRNA表達(dá)均具有一定的抑制作用，基因表達(dá)量均相對(duì)較低(P<0.05)，且隨LEP質(zhì)量濃度的升高，抑制效果未發(fā)生明顯變化(P>0.05)。當(dāng)添加500 μg/L PRL時(shí)，LEP對(duì)STAT5a的影響效果發(fā)生較大改變：總體來(lái)說(shuō)，隨LEP質(zhì)量濃度升高，STAT5a mRNA相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后降低變化趨勢(shì)，當(dāng)LEP為200 μg/L時(shí)，其相對(duì)表達(dá)水平最高(P<0.05)，50，800 μg/L LEP對(duì)STAT5a的表達(dá)幾乎無(wú)顯著性影響(P>0.05)(圖3)。

1～12.分別代表無(wú)PRL和有PRL時(shí)0，50，100，200，400，800 μg/L LEP下細(xì)胞總RNA;M.DL2000 DNA Marker

2.2 不同質(zhì)量濃度LEP作用下 LEPR和STAT5a蛋白表達(dá)水平變化分析Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，有PRL刺激時(shí)，隨LEP質(zhì)量濃度的增大，蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)為先升高后降低趨勢(shì)，且均在 200 μg/L LEP時(shí)，表現(xiàn)出最高水平的相對(duì)表達(dá)。

圖2 STAT5a與β-actin溶解曲線

注：組間字母相同表示差異不顯著(P>0.05)；不同表示差異顯著(P<0.05)

在本試驗(yàn)培養(yǎng)體系中，無(wú)PRL存在時(shí)，LEPR蛋白水平隨LEP質(zhì)量濃度的增大逐漸降低，而有PRL時(shí)，LEPR和STAT5a相對(duì)表達(dá)量逐漸升高，200 μg/L LEP時(shí)，相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高水平，后又有所降低(圖4B、圖5B)。

無(wú)PRL作用時(shí)，100，200 μg/L LEP對(duì)乳蛋白合成信號(hào)通路關(guān)鍵因子STAT5a的蛋白水平表現(xiàn)出顯著地抑制作用(P<0.05)，當(dāng)PRL為100和200 μg/L 時(shí)表達(dá)水平升高(P>0.05)。高質(zhì)量濃度LEP均抑制STAT5a蛋白的相對(duì)表達(dá)量(圖4C、圖5C)。

3 討論

LEPR與其他Ⅰ類細(xì)胞因子受體(如IL-6受體家族的gp130亞單位)的同源性表明其與LEP結(jié)合可能介導(dǎo)細(xì)胞因子受體樣信號(hào)，包括Janus激酶(JAKs)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(STATs)的激活，因此，作為細(xì)胞因子受體超家族成員的LEPR的早期識(shí)別導(dǎo)致JAK/STAT通路激活，其是LEP激活的主要信號(hào)級(jí)聯(lián)之一[18]。

許多細(xì)胞因子如PRL、生長(zhǎng)激素、LEP等的刺激時(shí)均可導(dǎo)致STAT5激活[19]。RNA-Seq數(shù)據(jù)分析表明，STAT5a在乳腺組織中的表達(dá)與其他組織相比差異顯著，提示STAT5a在乳腺內(nèi)具有重要生物學(xué)功能[20]。本試驗(yàn)利用不同質(zhì)量濃度LEP作用牦牛MECs，發(fā)現(xiàn)在無(wú)PRL時(shí)，STAT5a mRNA的表達(dá)被抑制，但在50 μg/L LEP作用下，STAT5a的蛋白水平相對(duì)表達(dá)較高，與之前的報(bào)道一致[21]。當(dāng)PRL存在時(shí)，隨著LEP作用質(zhì)量濃度的升高，表現(xiàn)出對(duì)STAT5a mRNA先促進(jìn)后抑制的作用特點(diǎn)，其中100,200 μg/LLEP顯著促進(jìn)STAT5a mRNA水平表達(dá)，并與STAT5a在蛋白水平表達(dá)的趨勢(shì)一致，可能因?yàn)镻RL通過(guò)激活JAK2/STAT5通路介導(dǎo)泌乳水平的生物作用[22]，LEP可協(xié)同促進(jìn)PRL對(duì)乳蛋白基因表達(dá)[23]。高濃度時(shí)，細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子(SOCSs)負(fù)反饋?zhàn)饔迷鰪?qiáng)，利用SH2結(jié)構(gòu)域與JAK2結(jié)合，抑制其磷酸化，阻止JAK2與底物結(jié)合，另一方面誘導(dǎo)JAK2/STAT3信號(hào)通路啟動(dòng)乳腺細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而降低對(duì)STAT5a的轉(zhuǎn)導(dǎo)[24]。

A.LEPR、STAT5a蛋白條帶圖(1～6.分別代表LEP質(zhì)量濃度為0，50，100，200，400，800 μg/L)；B.LEPR蛋白相對(duì)表達(dá)量;C.STAT5a蛋白相對(duì)表達(dá)量。組間字母相同表示差異不顯著(P>0.05);不同表示差異顯著(P<0.05)。下同

LEP對(duì)LEPR基因有下調(diào)作用，其機(jī)制除配體誘導(dǎo)的受體下調(diào)外，還可能是SOCS3對(duì)LEP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮負(fù)反饋抑制作用。LEP受體被激活后可誘導(dǎo)SOCS3[25]，通過(guò)抑制JAK的酪氨酸磷酸化及活化后的JAK所誘導(dǎo)的LEPR的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而阻斷LEP信號(hào)產(chǎn)生LEP抵抗[26]。本研究中無(wú)PRL時(shí)，LEP以劑量依賴性方式抑制LEPR蛋白水平表達(dá)。SZYSZKA等[27]在DU145和PREC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)LEP抑制LEPR亞型的表達(dá)，HepG2(人肝癌細(xì)胞)中LEPRb mRNA水平也隨LEP作用濃度的增大而降低[28]，與HIKITA等[29]利用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的研究結(jié)果一致，猜測(cè)LEP對(duì)牦牛MEC的作用過(guò)程中發(fā)生LEP抵抗。

圖5 有PRL時(shí)不同質(zhì)量濃度LEP下牦牛MECs中LEPR、STAT5a蛋白表達(dá)

乳蛋白的合成受基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯和代謝水平等多層次影響，因尚未涉及不同質(zhì)量濃度LEP下信號(hào)通路相關(guān)因子的磷酸化研究，故LEP對(duì)相關(guān)因子的表達(dá)影響機(jī)制及與乳蛋白合成的機(jī)理還需進(jìn)一步的探討。本試驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同質(zhì)量濃度LEP對(duì)牦牛MECs乳蛋白合成的相關(guān)因子的作用及表達(dá)規(guī)律，為L(zhǎng)EP對(duì)乳腺或其他組織的相關(guān)性研究提供一定的理論基礎(chǔ)。