陳美君 左海根 劉小玉 張德繼 王和雨 杜永琴 黃英杰

摘要 [目的]建立一種能同時(shí)檢測(cè)雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的測(cè)定方法。[方法]雞胗試樣與無(wú)水硫酸鈉混合后充分研磨，乙腈提取，濃縮定容后采用液相色譜儀測(cè)定。[結(jié)果]百菌清及其代謝物4-羥基百菌清在該色譜條件下得到很好的分離，百菌清和4-羥基百菌清濃度在0.05～1.00 mg/L呈較好的線性（R2>0.999）。添加水平為0.02～0.08 mg/kg時(shí)添加回收率為74%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～16.3%，方法定量限均為0.02 mg/kg。[結(jié)論]該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單快速、靈敏度高、檢測(cè)成本低的特點(diǎn)，可應(yīng)用于雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 百菌清;4-羥基百菌清;代謝物;殘留;液相色譜儀

中圖分類號(hào) TS 207.5+3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）03-0201-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.053

Detection of Chlorothalonil and Its Metabolite Residues in Gizzards

CHEN Mei-jun， ZUO Hai-gen， LIU Xiao-yu et al

（School of Chemistry and Food Science， Nanchang Normal University， Nanchang，Jiangxi 330032）

Abstract [Objective]To establish a method for the determination of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil residues in gizzards.[Method]The gizzards sample was grinded with anhydrous sodium sulfate， extracted with acetonitrile， and detected by high performance liquid chromatography with UV detector.[Result] Chlorothalonil and 4-hydroxychlorothalonil were good in linear relationship between 0.05 -1.00 mg/L（R2>0.999）. When the addition levels were 0.02-0.08 mg/kg， the recovery rates were 74%-106%， the relative standard deviations were 1.6%-16.3%， and the method quantification limits were 0.02 mg/kg.[Conclusion]The method has the characteristics of simple and rapid sample pretreatment， high sensitivity and low detection cost， and can be applied to the detection of the residual amount of chlorothalonil and its metabolite 4-hydroxychlorothalonil in gizzards.

Key words Chlorothalonil;4-hydroxychlorothalonil;Metabolites;Residues;Liquid chromatography

基金項(xiàng)目 南昌師范學(xué)院2019年學(xué)生科研項(xiàng)目（19XSKY44）;南昌師范學(xué)院2021年學(xué)生科研項(xiàng)目（21XSKY47）;南昌師范學(xué)院博士基金項(xiàng)目（NSBSJJ2019001）。

作者簡(jiǎn)介 陳美君（2001—），女，四川威遠(yuǎn)人，從事食品安全研究。通信作者，副教授，博士，從事食品安全檢測(cè)研究。

收稿日期 2021-09-13

隨著人民物質(zhì)生活的不斷提高，食品安全問(wèn)題備受關(guān)注。雞胗因肉質(zhì)厚實(shí)，深受人們的喜愛(ài)。雞胗是雞的砂囊，主要功能是儲(chǔ)存和磨碎食物，極易吸收食物中的藥物殘留，因而監(jiān)測(cè)雞胗中藥物殘留量顯得十分必要。

百菌清是一種非內(nèi)吸性廣譜殺菌劑，對(duì)多種作物的真菌病害具有防治作用，主要通過(guò)與真菌細(xì)胞中的3-磷酸甘油醛脫氫酶發(fā)生反應(yīng)，酶體中含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)被結(jié)合，喪失酶的活性，使真菌細(xì)胞的新陳代謝遭到破壞而失去生命力[1]。百菌清對(duì)生物具有一定的毒性[2-4]。尤其是百菌清在環(huán)境中易被代謝為4-羥基百菌清，其毒性約為百菌清母體的30倍[3]。另外，4-羥基百菌清的遷移性、持久性較母體也有明顯增加[5-6]?；诎倬鍖?duì)環(huán)境構(gòu)成的潛在威脅，被美國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)總署列為可能使人類致癌的物質(zhì)之一[7-8]。我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)食品中百菌清和4-羥基百菌清的最大允許殘留限量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定，禽類內(nèi)臟中百菌清（以4-羥基百菌清計(jì)）的最大殘留限量為0.07 mg/kg。

當(dāng)前人們對(duì)百菌清殘留量的分析技術(shù)開展了較深入的研究，但主要集中于百菌清母體的檢測(cè)[9-14]。對(duì)于百菌清及其代謝物殘留檢測(cè)技術(shù)的報(bào)道較少，主要包括免疫分析法[15-16]、高效液相色譜法（HPLC）[17]、氣相色譜法（GC）[18]、氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）[19]和液相色譜質(zhì)譜法 （HPLC-MS）[19-21]。當(dāng)前百菌清及其代謝物殘留量檢測(cè)還主要集中在環(huán)境及植物源食品中檢測(cè)[15-21]，但應(yīng)用于禽類內(nèi)臟的檢測(cè)方法以及百菌清在動(dòng)物體內(nèi)代謝規(guī)律研究鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者將建立同時(shí)檢測(cè)家禽中百菌清及4-羥基百菌清殘留量的檢測(cè)方法，為后續(xù)開展百菌清在家禽體內(nèi)代謝規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)，也為保障家禽產(chǎn)品的安全提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試材

乙腈（液相色譜級(jí)，美國(guó)TEDIA公司）;無(wú)水硫酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;百菌清標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L，中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè)站）;4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.7%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）;針孔濾膜（有機(jī)相0.45 μm）;試驗(yàn)用水為超純水。雞胗試樣（購(gòu)于南昌某超市）。

4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（100 mg/L）：準(zhǔn)確稱取10 mg 4-羥基百菌清標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100 mL，冰箱中避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/L）：分別移取1 mL百菌清標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）和4-羥基百菌清（100 mg/L）于100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容，冰箱中避光保存。

1.2 儀器

Waters 1525-2489液相色譜儀，包括四元泵、在線真空脫氣機(jī)、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和紫外檢測(cè)器（UV）;QL-902漩渦混合器;HY-8調(diào)速振蕩器;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;移液槍;NC-BY20超純水裝置。

1.3 色譜條件

安捷倫公司TC C18色譜柱（150 mm×4.8 mm，5 μm）;柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL;紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)243 nm;流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

1.4 試驗(yàn)方法

將雞胗剪成小塊，用刀式研磨儀攪碎混勻。準(zhǔn)確稱取雞胗試樣5.0 g于研缽中，加入30 g無(wú)水硫酸鈉，研磨至干粉狀。將研磨好的試樣轉(zhuǎn)移至250 mL錐形瓶中，加入40 mL乙腈溶液，在振蕩儀上振蕩15 min后，靜置分層，將上層液過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱后收集于250 mL濃縮瓶中。殘?jiān)性偌尤?0 mL乙腈重復(fù)提取2次，合并上清液后在40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至干。準(zhǔn)確移取2 mL乙腈于濃縮瓶中，渦旋溶解后過(guò)有機(jī)相針孔濾膜，供液相色譜儀測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件選擇

為了比較不同的提取溶劑對(duì)雞胗中百菌清、4-羥基百菌清的提取效率的影響，采用比較不同提取溶劑（乙腈、乙酸乙酯、正己烷）對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率。研究表明，乙腈提取效率最佳，這是由于4-羥基百菌清具有一定的極性，更適合用乙腈提取。另外乙腈具有穿透性強(qiáng)、提取雜質(zhì)少的特點(diǎn)，該研究選擇乙腈作為提取溶劑，這與相關(guān)的報(bào)道一致[22]。

為了進(jìn)一步提高4-羥基百菌清的提取效率，對(duì)提取方式進(jìn)行了選擇和優(yōu)化，結(jié)果表明，樣品與無(wú)水硫酸鈉混合研磨除水后，再采用乙腈提取，4-羥基百菌清和百菌清具有較好的提取效率。這是因?yàn)閯×业难心ミ^(guò)程能進(jìn)一步破壞雞胗的組織結(jié)構(gòu)，有助于乙腈的提取，而且能有效除去組織中的水分。

2.2 檢測(cè)條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇。

為了選擇較佳的色譜柱，對(duì)不同的色譜柱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，根據(jù)目標(biāo)化合物的峰形和響應(yīng)值選擇最佳的色譜柱。百菌清及其代謝物屬于極性較小的化合物，因此采用弱極性色譜柱進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同型號(hào)的色譜柱對(duì)分離存在一定的差異。該研究分別采用色譜柱1（Agilent TC C18，150 mm×4.8 mm，5 μm）和色譜柱2（Kromasil NH2，250 mm×4.8 mm，5μm）進(jìn)行分離，結(jié)果表明，色譜柱1能將百菌清及其代謝物4-羥基百菌清有效分離，峰形好，靈敏度高;而色譜柱2不能有效分離，不適合作為分離色譜柱。因而選擇色譜柱1作為分離柱。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇。

考察了乙腈-水、甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)百菌清及其代謝物色譜行為的影響，結(jié)果表明，乙腈-水作為流動(dòng)相的響應(yīng)值較高，故選用乙腈-水作為流動(dòng)相。另外，流動(dòng)相的比例對(duì)目標(biāo)物的分離也有較大的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以得出，當(dāng)采用等比例的流動(dòng)相洗脫時(shí)，當(dāng)乙腈的初始含量為70%，目標(biāo)物雖然能達(dá)到基線分離，峰形較好，但保留時(shí)間較小。隨著乙腈含量的進(jìn)一步增加，色譜峰型變差。因而該研究采用梯度洗脫方式，得到較好的峰型和較高的靈敏度（圖1e）。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。

首先研究了百菌清和4-羥基百菌清的最大吸收波長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)這2種化合物的最大吸收波長(zhǎng)不一致，分別為243和233 nm，綜合考慮，選擇243 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系及定量限。

配制0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照“1.3”色譜條件進(jìn)行測(cè)定后，得到百菌清和4-羥基百菌清均呈現(xiàn)較好的線性，線性決定系數(shù)（R2）分別為0.999 9和0.999 8。試驗(yàn)以10倍信噪比計(jì)算定量限，得到雞胗樣品中百菌清和4-羥基百菌清的定量限均為0.02 mg/kg。

2.3.2 回收率和精密度。

在陰性雞胗樣品中分別添加0.02、0.04和0.08 mg/kg，百菌清的回收率為74%～84%，精密度為3.0%～10.5%;4-羥基百菌清的回收率為86%～106%，精密度為1.6%～16.3%。雞胗樣品測(cè)定對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品、空白、樣品和樣品添加的液相色譜圖見(jiàn)圖2。

3 結(jié)論

該研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的測(cè)定方法，該方法前處理簡(jiǎn)便、回收率穩(wěn)定、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、成本低廉，可用于雞胗中百菌清及其代謝物4-羥基百菌清殘留量的檢測(cè)，為雞胗中百菌清及其代謝物殘留量監(jiān)測(cè)提供一定的技術(shù)支持。

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