張婭俐 洪晶 曹竑 田曉靜 王婷婷 張福梅 柏家林 丁功濤 馬忠仁 宋禮

摘要 為進(jìn)一步利用血液資源，以藏羊血清為原料，采用胃蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解。以水解度為指標(biāo)，研究pH、溫度、加酶量3個(gè)因素對(duì)藏羊血清水解度的影響規(guī)律;在此基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白工藝條件。結(jié)果表明：底物濃度為5%、加酶量為6 200 U時(shí)，最佳水解條件：溫度為46 ℃、pH為2.25、酶解時(shí)間2 h，水解度為（23.41±0.23）%。

關(guān)鍵詞 胃蛋白酶;水解;羊血清蛋白;響應(yīng)面

中圖分類號(hào) TS 251.9? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）03-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.047

Study on the Process of Gastric Protease Hydrolysis and Serum Protein in Sheep

ZHANG Ya-li， HONG Jing， CAO Hong et al

（School of Life Sciences and Engineering， Northwestern University of Nationalities， Lanzhou， Gansu 730124）

Abstract In order to make further use of blood resources， the serum of sheep was used as raw material and hydrolyzed by gastric protease. Taking hydrolysis as the index， the effect law of pH， temperature and enzyme addition on serum hydrolysis of Tibetan sheep was studied， and on this basis， the gastric protease hydrolysis process conditions of sheep serum protein were optimized by Box-Benhnken response surface test. The results showed that when the substrate concentration was 5% and the enzyme amount was 6 200 U， the optimal hydrolytic conditions were as follows： temperature 46 ℃， pH 2.25， enzymatic hydrolysis time 2 h， and the degree of hydrolysis was （23.41 ± 0.23）%.

Key words Gastric protease;Hydrolysis;Ovine serum protein;Response surface

基金項(xiàng)目 中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（31920200115）;科技部援助項(xiàng)目（KY201501005）;甘肅省自然科學(xué)基金資助（18JR3RA371）。

作者簡(jiǎn)介 張婭俐（1996—），女，重慶人，碩士研究生，研究方向：特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)。通信作者，教授，從事食品生物技術(shù)及安全控制研究。

收稿日期 2021-05-18

血液一般占畜禽活體重4.0%～9.8%[1]。羊血是肉類加工業(yè)的主要副產(chǎn)物之一，羊血液中幾乎含有人體所需的全部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括大部分的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及鉀、鈉、鈣、鐵等微量元素[2]。它還可作為醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中細(xì)菌培養(yǎng)、細(xì)菌鑒別及免疫學(xué)檢測(cè)的重要試驗(yàn)材料，是動(dòng)物血液中適合作培養(yǎng)基的物資，此外羊血中還含有專一性很強(qiáng)的凝血酶和超氧化物歧化酶等對(duì)人體有益的物質(zhì)[3]。但由于許多原因，我國(guó)羊血資源利用率很低，多數(shù)屠宰企業(yè)將血液直接排放，造成寶貴的蛋白質(zhì)資源浪費(fèi)[3]。目前國(guó)內(nèi)外將動(dòng)物血液用于林化工業(yè)、制藥、肥料、葡萄酒等工業(yè)[4]。

胃蛋白酶是一種消化性酸性蛋白酶，在適宜的環(huán)境中可將蛋白質(zhì)分解為肽片段和酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。不同的蛋白酶水解羊血清蛋白速率、水解產(chǎn)物都有很大差異。近年來，對(duì)其的研究引起了食品學(xué)界的廣泛關(guān)注[5-6]。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外有關(guān)利用植物蛋白[7-8]和動(dòng)物蛋白[9-10]進(jìn)行蛋白酶水解生產(chǎn)多肽的研究很多，利用動(dòng)物血液開發(fā)功能性成分已成為研究熱點(diǎn)，但研究多局限于豬血，關(guān)于羊血的研究鮮見報(bào)道。

筆者以胃蛋白酶對(duì)藏羊血清蛋白進(jìn)行水解，測(cè)定其水解度，通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化其酶解條件，以期為藏羊血資源和藏羊血清功能多肽的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍干燥處理的藏系綿羊血清，簡(jiǎn)稱“藏羊血清”（青海省海西州天峻縣）;胰蛋白酶（北京中生瑞泰發(fā)展有限公司，3 000 U/mg）;三氯乙酸、茚三酮、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722E型可見光分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）;HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海-恒科技有限公司，上海-恒科學(xué)儀器有限公司）;GL-3250B控溫磁力攪拌器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）;TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）;LabconcoFreezoneil臺(tái)式凍干系統(tǒng)（上海比朗儀器有限公司）;DHP-9272型恒溫干燥箱（上海一恒科技有限公司）;JA2003N型電子天平（上海精密科技儀器有限公司）;PB-10型精密pH計(jì)（Sartorius公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藏羊血清蛋白酶解液的制備。

準(zhǔn)確稱取5.0 g藏羊血清蛋白，加入100 mL超純水溶解，調(diào)節(jié)pH，加入適量胃蛋白酶，在特定的溫度下進(jìn)行水解。水解后于95 ℃滅酶15 min，加入一定量10%三氯乙酸后，于8 000 r/min離心15 min，取上清液分析。

1.3.2 水解度的測(cè)定方法。

采用茚三酮比色法[11]測(cè)定樣品中氨基酸含量，并以式（1）計(jì)算水解度（degree of hydrolysis，DH）。為消除不同氨基酸因呈色不同而對(duì)測(cè)定造成的誤差[12-13]，式中采用待水解原料的完全水解液作為標(biāo)準(zhǔn)。

水解度的計(jì)算公式如下：

DH=（Ah-A0）/（A1-A0）×100%（1）

式中：Ah為酶解液中總游離氨基數(shù)，mmol;

A1為原料蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離氨基數(shù)，mmol;

A0為原料蛋白中固有的游離氨基數(shù)，mmol。

以甘氨酸含量（mg）為x軸，吸光值為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的回歸方程為y=0.008 0x+0.043 5，R2=0.992 8。從圖1可見，在甘氨酸含量0～200 mg呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 胃蛋白酶活力的測(cè)定。

采用福林法測(cè)定胃蛋白酶活力[5]。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

為優(yōu)化藏羊血清蛋白水解效果，在底物濃度為5%的條件下，研究pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）、加酶量（3 000、4 500、6 000、7 500、9 000 U）和酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）對(duì)胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白效果的影響。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)見表1。采用F檢驗(yàn)對(duì)胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，評(píng)價(jià)模型的統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)水解度的影響。

酶蛋白分子的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，在反應(yīng)溫度超某一極限值時(shí)，易引起肽鍵的斷裂，從而導(dǎo)致酶活性降低[14];但如果反應(yīng)溫度過低，蛋白分子體系內(nèi)運(yùn)動(dòng)的激烈程度會(huì)大大降低，導(dǎo)致酶與底物碰撞幾率的降低[15]。

在底物濃度為5%、加酶量6 000 U、pH為3.0的條件下酶解2 h，研究酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）對(duì)胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白效果的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可知，酶解溫度在20～50 ℃時(shí)，水解度隨溫度的升高而增大;酶解溫度超過50 ℃后，水解度迅速下降。故選擇較佳的酶解溫度為50 ℃。

2.1.2 加酶量對(duì)水解度的影響。

在蛋白質(zhì)的水解過程中，隨著加酶量的增大，溶液中水解的初速度增大，當(dāng)原有的蛋白質(zhì)減少到一定程度以后，增加溶液中胃蛋白酶的濃度，其能夠與大分子蛋白質(zhì)產(chǎn)生作用的幾率比之前大大降低，因此并不是酶添加量越高其作用效果越大。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)可知，酶的用量過少難以得到最大的水解度，過多會(huì)造成資源浪費(fèi)[16]。

在底物濃度為5%、酶解溫度為50 ℃、pH為3.0的條件下酶解2 h，研究加酶量（3 000、4 500、6 000、7 500、9 000 U）對(duì)胃蛋白酶水解效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，藏羊血清蛋白水解度隨著加酶量的增加不斷升高，當(dāng)加酶量超過6 000 U后水解度增加緩慢。故選擇較佳的加酶量為6 000 U。

2.1.3 酶解pH對(duì)水解度的影響。

pH對(duì)水解度的影響主要表現(xiàn)于對(duì)酶活性的影響，因?yàn)槲傅鞍酌傅幕钚苑秶鸀閜H在1～5，在偏中性尤其是堿性環(huán)境中胃蛋白酶就會(huì)發(fā)生解鏈而失去活性[17]。pH對(duì)水解度的影響不僅要考慮酶本身所產(chǎn)生的生物水解作用，更重要的是要考慮低pH環(huán)境對(duì)藏羊血清蛋白所產(chǎn)生的化學(xué)水解對(duì)生物水解作用的影響。

在底物濃度為5%、酶解溫度為50 ℃、加酶量為6 000 U的條件下酶解2 h，研究酶解pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）對(duì)胃蛋白酶水解效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在pH小于3.0時(shí)，藏羊血清蛋白水解度隨著酶解pH的升高不斷增大;當(dāng)酶解pH超過3.0后，其水解度逐漸下降。故選擇較佳的酶解pH為3.0。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 建立回歸模型及方差分析。

Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。采用Design-Expert進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以水解度為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合得到胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白關(guān)于3因素的回歸方程為

Y=19.81+0.18A+0.41B+1.97C-2.73A2-3.27B2-1.12C2-0.66AB-0.85AC+0.20BC

二次多項(xiàng)方差分析結(jié)果見表3，由表3可知，回歸模型 F=17.29，P<0.01，說明三元二次回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)不顯著（P>0.05）;總回歸模型R2=0.957 0，調(diào)整后模型相關(guān)系數(shù)Radj2=0.901 6，說明該回歸方程的擬合度較好，實(shí)際值與

預(yù)測(cè)值有較好的擬合相關(guān)性，試驗(yàn)方法可靠，可以用來預(yù)測(cè)

試驗(yàn)結(jié)果。通過回歸系數(shù)絕對(duì)值對(duì)各因素變化與

水解度高低之間的分析，結(jié)果顯示，影響胃蛋白酶水解效果的各因素由大到小為C>B>A，即3個(gè)因素對(duì)水解度的影響表現(xiàn)為加酶量>pH>溫度。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析。

為了更直觀地反映兩兩因素交互作用對(duì)胃蛋白酶水解效果的影響，根據(jù)回歸方程繪制出其響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖5。

各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值影響程度的強(qiáng)弱與響應(yīng)面坡度和等高線密集度有關(guān)。響應(yīng)面曲面坡度越陡峭，表示二者交互作用越顯著[18-19]，等高線圓形時(shí)交互作用較弱[20]。由圖5可以看出，加酶量與pH交互作用的響應(yīng)曲面坡度最陡峭，且其等高線圖橢圓率高，pH和加酶量的交互作用對(duì)胃蛋白酶水解效果影響最顯著;溫度和pH等高線圖形狀較圓，表示因素交互作用較弱，即溫度和pH的交互作用對(duì)胃蛋白酶水解效果影響不顯著。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)。

根據(jù)所建立的二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行最優(yōu)化分析，胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白最佳條件為：溫度（A）為46 ℃，pH為2.25，加酶量（C）為6 200 U，水解時(shí)間2 h，在該條件下，所建立模型預(yù)測(cè)的水解度最高可達(dá)（23.60±0.27）%。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，在該條件下重復(fù)試驗(yàn)3次得到的水解度平均值為（23.41±0.23）%，與模型的預(yù)測(cè)值接近，表明模型擬合良好，方法具有可行性。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白的條件，最后建立了水解度與酶解溫度、pH、加酶量3個(gè)因素的二次多項(xiàng)式回歸模型，驗(yàn)證試驗(yàn)證明了該模型的可靠性。優(yōu)化獲得胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白的最佳酶解條件：底物濃度為5%，溫度為46 ℃，pH為2.25，加酶量為6 200 U，水解時(shí)間2 h。在該工藝條件下，藏羊血清蛋白的水解度為（23.41±0.23）%。

水解藏羊血清蛋白是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的熱門方向，各種藏羊血清蛋白的酶解方法、檢測(cè)手段也越來越受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。該研究結(jié)果為藏羊血清的利用提供了又一種思路，也為今后關(guān)于藏羊血清蛋白水解物的利用與開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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