張佳蕊 郝娟 張喜春

摘要 MYB102 轉(zhuǎn)錄因子在番茄響應(yīng)低溫脅迫中起著重要作用，為了進(jìn)一步探究番茄轉(zhuǎn)錄因子MYB102的分子作用機(jī)理，篩選其蛋白，以“Bolgogragsky”為材料，從番茄的根、莖、葉、花、果以及萼片組織中提取總RNA，以其為模板合成雙鏈cDNA，純化后與載體pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)化入酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。經(jīng)測(cè)定，文庫(kù)容量為2.31×107 CFU，cDNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率為7.02×106 CFU/μg，文庫(kù)滴度為2.5×108 CFU/mL，重組率為97%，插入的cDNA片段長(zhǎng)度主要分布在250～2 000 bp。結(jié)果表明，構(gòu)建的番茄cDNA文庫(kù)符合酵母雙雜交文庫(kù)要求，可用于篩選MYB102的互作蛋白。

關(guān)鍵詞 番茄;酵母雙雜交;cDNA文庫(kù);SMART技術(shù)

中圖分類號(hào) S 641.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）03-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.024

The Construction and Quality Evaluation of “Bolgogragsky” Tomato cDNA Library

ZHANG Jia-rui， HAO Juan， ZHANG Xi-chun

（College of Plant Science and Technology， Beijing Agricultural University， Beijing 102206）

Abstract MYB102 transcription factor plays an important role in tomato response to low temperature stress. In order to further explore the molecular mechanism of tomato transcription factor MYB102 and screen the protein interacting with it， a tomato yeast two-hybrid cDNA library was constructed in yeast Y187 by SMART technology. The Russian tomato variety Bolgogragsky was used to construct the yeast two-hybrid cDNA library. The total RNA was extracted from tomato root， stem， leaf， flower， fruit and sepal tissue， and was used as template to synthesize double stranded cDNA. After purification， it was transformed into yeast Y187 receptive cells together with vector pGADT7-Rec to construct yeast two-hybrid cDNA library. The test showed that the library capacity was 2.31×107 CFU， the cDNA library conversion efficiency was 7.02×106 CFU/μg， and the library titer was 2.5×108 CFU/mL. The recombination rate was 97%， and the length of the inserted double stranded cDNA fragments was mainly distributed in 250-2 000 bp. The results showed that the constructed tomato cDNA library met the requirements of yeast two-hybrid library and could be used to screen MYB102 interaction proteins.

Key words Tomato;Yeast two-hybrid;cDNA library;SMART technology

基金項(xiàng)目 科技合作項(xiàng)目“中俄主要蔬菜基因資源多樣化比較研究”（2011DFR31180-3）。

作者簡(jiǎn)介 張佳蕊（1996—），女，河北保定人，碩士研究生，研究方向：蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種。郝娟（1994—），女，山西臨汾人，碩士研究生，研究方向：蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種。張佳蕊和郝娟為共同第一作者。 通信作者，教授，從事蔬菜生物技術(shù)與遺傳育種研究。

收稿日期 2021-09-27

番茄（Solanum lycopersicum L.）是茄科番茄屬的喜溫性蔬菜，在我國(guó)南北方廣泛種植[1]，因其營(yíng)養(yǎng)豐富，深受各地人們喜愛。低溫是制約植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量的重要逆境因子，低溫脅迫會(huì)發(fā)生在番茄生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期，對(duì)番茄種子萌發(fā)、苗期葉片和根系發(fā)育、花芽發(fā)育及開花坐果等方面均有影響[2]。因此，關(guān)于番茄抗寒方面的研究一直備受關(guān)注。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是一類具有高保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，通過與基因啟動(dòng)子區(qū)域特異性結(jié)合來激活基因表達(dá)[3]，其功能多樣，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答過程[4]。MYB102是一個(gè)R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明番茄MYB102轉(zhuǎn)錄因子參與低溫脅迫的響應(yīng)和調(diào)節(jié)，瞬時(shí)沉默MYB102基因，沉默組番茄耐寒性與對(duì)照組相比明顯降低[5]。但MYB102轉(zhuǎn)錄因子如何實(shí)現(xiàn)調(diào)控，其具體的作用機(jī)制尚不清楚。

酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song建立，是目前常用的蛋白互作研究方法[6]，可以檢驗(yàn)已知蛋白間的相互作用，也可用于發(fā)現(xiàn)新蛋白或蛋白新功能[7]。目前，這種方法已應(yīng)用于多種作物的質(zhì)量性狀及病害領(lǐng)域研究。趙光耀[8]構(gòu)建小麥全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，謝卡斌[9]構(gòu)建水稻全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，趙懷印等[10]構(gòu)建成熟期的番茄果實(shí)cDNA文庫(kù)，韋淑亞[11]構(gòu)建油菜菌核病相關(guān)cDNA文庫(kù)等。為了篩選出與MYB102互作的蛋白，進(jìn)而探究該轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制，筆者以俄羅斯番茄品種“Bolgogragsky”番茄根、莖、葉、花、果等不同組織為材料，采用SMART技術(shù)構(gòu)建番茄酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試番茄品種為實(shí)驗(yàn)室自存俄羅斯番茄品種“Bolgogragsky”（編號(hào)為25），來自北京農(nóng)學(xué)院蔬菜育種與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室。酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞，酵母cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Make Your Own “Mate&PlateTM” Library System）和SD-Leu培養(yǎng)基購(gòu)自Clontech公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及取樣。

“Bolgogragsky”番茄種子置于濕潤(rùn)濾紙上25 ℃暗培養(yǎng)催芽，發(fā)芽種子播種到穴盤并于20～25 ℃（16/8 h，day/night，濕度60%）條件下培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí)定植到日光溫室自然低溫生長(zhǎng)。開花期取番茄植株的根、莖、葉、花、萼片等組織樣品，果實(shí)成熟期取成熟果實(shí)、果肉，分別用錫箔紙包好，置于液氮中速凍，然后于-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 番茄總RNA的提取。

用Trizol法提取番茄各組織的總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度與質(zhì)量，以確保初始RNA質(zhì)量滿足建庫(kù)的要求。各組織提取的總RNA按濃度稀釋成1 000 ng/μL，將稀釋好的各組織RNA各取1 μL混勻，組成混合總RNA。

1.2.3 雙鏈cDNA的合成與純化。

參考Make Your Own “Mate & Plate TM” Library System User Manual說明書，引用姜赟等[12]的試驗(yàn)方法，稍作改動(dòng)。按說明書操作向2 μL混合后的總RNA中加入以下試劑：①CDS Ⅲ Primer 1 μL;②去離子水1 μL，72 ℃ 2 min，冰上冷卻2 min，14 000 g瞬時(shí)離心10 s。然后依次加入：①5×First-Strand Buffer 2 μL;②DTT 1 μL;③dNTP Mix 1 μL;④SMART MMLV Reverse Transcriptase 1 μL，瞬時(shí)離心，42 ℃下溫浴10 min后加入SMART Ⅲ-modified oligo 1 μL，42 ℃ 1 h，75 ℃ 10 min。待冷卻至室溫，加入RNaseH 1 μL，37 ℃溫浴20 min，得到合成的第1鏈cDNA 產(chǎn)物。

通過LD-PCR進(jìn)行第2鏈cDNA合成，PCR體系100 μL，依次加入去離子水、單鏈cDNA、10×Advantage 2 PCR Buffer、50×dNTP Mix、5′和3′PCR引物、10×Melting Solution、50×Advantage 2 PolymeraseMix。擴(kuò)增程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，68 ℃ 6 min，20個(gè)循環(huán)，68 ℃ 5 min，得到產(chǎn)物為雙鏈cDNA。

雙鏈cDNA的純化，按照CHROMA SPINTM+TE-400說明書進(jìn)行操作。純化后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)雙鏈純化結(jié)果。

1.2.4 番茄酵母雙雜cDNA文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)。

將純化的雙鏈cDNA轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞，引用姜赟等[12]的試驗(yàn)方法，略作改動(dòng)。

參考 Make Your Own “Mate & Plate TM” Library System User Manual說明書用凍存液收集保存酵母文庫(kù)菌液。將轉(zhuǎn)化液涂于150 mm SD-Leu平板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，待大部分長(zhǎng)出菌斑后，置于4 ℃冰箱中預(yù)冷4 h，每個(gè)平板加入5 mL凍存液，用無(wú)菌槍頭刮取所有菌落，收集于無(wú)菌三角瓶，混勻，無(wú)菌1.5 mL離心管分裝，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

取100 μL酵母菌轉(zhuǎn)化液分別按1/10、1/100、1/1 000、1/10 000稀釋，分別取100 μL稀釋液涂布SD-Leu平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，統(tǒng)計(jì)酵母菌落數(shù)，計(jì)算文庫(kù)容量和文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率。計(jì)算公式：文庫(kù)容量（CFU）=單菌落數(shù)量×溶液總體積×稀釋倍數(shù)/涂板體積;文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg）=單菌落數(shù)量×溶液總體積×稀釋倍數(shù)/涂板體積×DNA 總質(zhì)量（μg）。取50 μL凍存液收集的酵母文庫(kù)菌液，按上述比例稀釋，分別涂布SD-Leu平板，30 ℃條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌落，統(tǒng)計(jì)酵母菌落數(shù)，計(jì)算cDNA文庫(kù)滴度，文庫(kù)滴度（CFU/mL）=單克隆數(shù)量×稀釋倍數(shù)/涂板體積（mL）。隨機(jī)挑取平板上的單菌落，進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增及1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)cDNA文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度與重組率，重組率=重組片段PCR的條帶數(shù)/挑取單菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄不同組織總RNA的提取

提取的番茄各組織總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可清晰觀察到28、18和5 s 3條條帶，且28 s條帶亮度最高，18 s條帶亮度次之，說明提取的RNA完整性較好（圖1），個(gè)別條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，可能原因是RNA有少量降解。

檢測(cè)RNA純度和濃度，結(jié)果顯示，花和葉片組織中RNA濃度較高，莖、萼片和果次之，根組織中RNA濃度最低，各組織RNA吸光度值OD260/OD280在1.88～2.00，表明RNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)（表1）。

2.2 雙鏈cDNA的合成與純化

將各組織RNA等量混勻，以2 μL混合后的總RNA為模板合成雙鏈cDNA，純化后得到5.08 μg ds cDNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純化后的雙鏈DNA，結(jié)果可見條帶呈彌散狀分布，分布范圍在250 bp以上，純化后250 bp以下片段基本去除（圖2）。

2.3 番茄cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量評(píng)價(jià)

純化后的ds cDNA與pGADT-Rec載體重組后共轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中。在100個(gè)缺少亮氨酸的培養(yǎng)基（SD-Leu）中培養(yǎng)，約5 d長(zhǎng)出菌落（圖3A）。用凍存液收集cDNA 文庫(kù)酵母菌落，獲得約450 mL菌懸液，分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

取100 μL轉(zhuǎn)化液稀釋100倍，涂50 μL稀釋后的轉(zhuǎn)化液至100 mm SD-Leu平板，30 ℃條件下培養(yǎng)，計(jì)算得該文庫(kù)容量為 2.31×107 CFU，文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率7.02×106 CFU/μg（圖3B）。在SD-Leu平板中培養(yǎng)并收集cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化液，取凍存液收集的酵母文庫(kù)菌液50 μL稀釋10 000倍，在SD-Leu平板上涂布并培養(yǎng)4 d，長(zhǎng)出1 438個(gè)單菌落（圖3C），按公式計(jì)算文庫(kù)滴度為2.5×108 CFU/mL。

隨機(jī)挑取36個(gè)平板上的單菌落，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)35個(gè)明顯條帶，根據(jù)公式計(jì)算，重組率為97%，插入的片段主要分布在250～2 000 bp（圖4）。綜上所述，該酵母雙雜交cDNA文庫(kù)滿足建庫(kù)要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

3 討論

酵母雙雜交是研究基因功能及探究驗(yàn)證互作蛋白的常用方法。構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的方法有很多，常見方法主要有Gateway技術(shù)、SMART技術(shù)等。李穎波等[13-14]采用Gateway技術(shù)分別構(gòu)建了大麥和葡萄葉片cDNA文庫(kù)，用于篩選鹽脅迫下和霜霉菌侵染下的互作蛋白。SMART技術(shù)具有操作步驟簡(jiǎn)單，起始RNA用量少的優(yōu)點(diǎn)，只需要微量總RNA即可得到高質(zhì)量cDNA庫(kù)，無(wú)需額外抽提或酶反應(yīng)，在構(gòu)建金柑花蕾[15]、花生[16]、不結(jié)球白菜[17]、芝麻[18]等植物酵母雙雜交cDNA文庫(kù)時(shí)被廣泛應(yīng)用。因此，該試驗(yàn)以番茄不同組織為樣本，提取總RNA后用SMART技術(shù)合成全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建文庫(kù)。

構(gòu)建具有高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)為后續(xù)篩選互作蛋白奠定基礎(chǔ)[19]。通常從兩個(gè)方面來評(píng)價(jià)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)質(zhì)量[20]：①用文庫(kù)容量來衡量cDNA文庫(kù)的代表性，文庫(kù)滴度高于1×106 CFU/mL時(shí)滿足要求;②用插入片段大小和重組率描述重組序列完整性[11]。在該試驗(yàn)中，文庫(kù)容量為2.31×107 CFU，文庫(kù)滴度為2.5×108 CFU/mL，表明文庫(kù)中cDNA的種類豐富，具有較高的完整性，滿足建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。文庫(kù)插入片段大小200～2 000 bp，重組率為97%，證明cDNA序列較完整，可用于下一步篩選與轉(zhuǎn)錄因子MYB102相互作用的蛋白。

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