鄧茗芝，許原原，呂亮東

復旦大學上海醫(yī)學院基礎醫(yī)學院教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，上海 200032

結核病(tuberculosis)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的傳染性疾病，為全球十大死因之一[1]。近年來，隨著耐藥結核病患者的不斷增多，結核病的防治形勢越發(fā)嚴峻。現有研究表明，結核分枝桿菌不存在基因間水平轉移，其耐藥性的產生均由基因組突變所致[2]。因此，闡明結核分枝桿菌DNA復制與修復的機制對于深入認識結核分枝桿菌的致病機理和耐藥性形成具有重要意義。Rv2191基因及其同源基因廣泛存在于分枝桿菌屬中，而大腸埃希菌中不存在該同源基因。由于Rv2191蛋白包含DEDDh核酸外切酶結構域，曾被認為是DNA復制體校正亞基DnaQ的同源蛋白，但研究發(fā)現，分枝桿菌DnaQ不具備DNA復制的校對功能[3]。同時，有研究發(fā)現在結核分枝桿菌慢性感染兔模型中，Rv2191在潛伏感染和復燃階段的表達顯著上調，提示Rv2191可能與細菌的持留狀態(tài)和復蘇有關[4]。然而，目前對Rv2191蛋白的生理功能還不清楚。

本研究通過比較結核分枝桿菌Rv2191與恥垢分枝桿菌(Mycolicibacteriumsmegmatis)MSMEG_4259(Rv2191的同源物；以下簡寫為Ms4259)的氨基酸序列和結構域，發(fā)現兩者具有高度同源性。因此，以恥垢分枝桿菌為模式，構建Ms4259基因敲除(ΔMs4259)菌株，比較分析野生型與ΔMs4259菌株的生長速率、利福平(rifampicin，RIF)耐藥突變頻率、突變譜、DNA損傷應答和對DNA損傷劑的耐受性，以研究Ms4259的生理功能和特性，從而發(fā)現Ms4259參與分枝桿菌基因組維護及DNA氧化損傷應答，為進一步研究分枝桿菌致病和耐藥突變的形成奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒恥垢分枝桿菌mc2155菌株、大腸埃希菌DH5α菌株和質粒pYUB854均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑Middlebrook 7H9、7H10培養(yǎng)基購自美國BD公司；膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、Phase Lock Gel購自中國TIANGEN公司；限制性核酸內切酶、DNase Ⅰ、Q5超保真聚合酶購自美國NEB公司；RNA純化試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司；RNA提取試劑TRIzol購自美國Ambion公司；SuperScriptTMⅣ反轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMGC(Perfect Real Time)購自日本TaKaRa公司；常用抗生素購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物本研究所用引物如表1所示。

1.2.2 細菌培養(yǎng)大腸埃希菌采用 LB液體培養(yǎng)基(37 ℃、220 r/min)和 LB固體培養(yǎng)基 (37 ℃靜置)分別培養(yǎng)12～18 h；恥垢分枝桿菌采用含0.2%甘油、0.05%吐溫80的 Middlebrook 7H9液體培養(yǎng)基(37 ℃、100 r/min)和含0.2%甘油的Middlebrook 7H10固體培養(yǎng)基(37 ℃靜置)分別培養(yǎng)2～3 d。

1.2.3 敲除菌株及回補菌株的構建利用同源重組方法進行基因敲除。以恥垢分枝桿菌mc2155的基因組DNA為模板，通過引物 Ms4259KO-F1/Ms4259KO-R1和Ms4259KO-F2/Ms4259KO-R2分別擴增上下臂，獲得的PCR產物經酶切后依次連接至質粒pYUB854，采用噬菌體轉導方法[5]將重組質粒導入恥垢分枝桿菌mc2155，獲得ΔMs4259菌株。然后，利用引物4259testF/4259testR來驗證Ms4259基因是否敲除成功。為了能夠充分回補，通過分析恥垢分枝桿菌核糖體圖譜[6]， 選擇較高轉錄水平的基因groL1的轉錄調控區(qū)域作為回補基因的表達元件。以Rpro-F/Rpro-R為引物，通過PCR擴增該基因本身的18 bp及前290 bp，將PCR產物連接至pMV361質粒，命名為pMV361-Rpro。用引物MS4259-F/MS4259-R擴增回補基因片段Ms4259，而后連接至質粒pMV361-Rpro。將構建好的回補質粒電擊轉化ΔMs4259感受態(tài)細胞，獲得ΔMs4259+Ms4259回補菌株。

表1 PCR引物

1.2.4 生長曲線測定將 -80 ℃ 保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。吹散混勻，以終吸光度值OD600=0.02接種于20 mL新鮮Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min 搖床培養(yǎng)。6 h后，每隔3 h測一次菌液OD600值，并記錄匯總作圖。

1.2.5 突變頻率測定將-80 ℃保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以終OD600=0.02接種于10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8。用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基稀釋菌液至OD600=0.000 1，分裝至30個細胞培養(yǎng)瓶(25 cm2)，5 mL菌液/瓶，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～1。吸取30 μL菌液，用含0.05%吐溫80的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline with 0.05% Tween 80，PBST)梯度稀釋至105，分別吸取50 μL涂布于2個LBG平板(LB固體培養(yǎng)基+0.2%甘油)，37 ℃培養(yǎng)3 d，記錄單克隆數，并計算涂板菌液的菌落形成單位(colony forming unit，CFU)。CFU值=2×10×105×C，C為LBG平板長出的單菌落數。每個樣品的2個LBG平板計算的CFU取平均值作為每1 mL涂板菌液的活菌數。將剩余菌液約4.5 mL轉移至15 mL離心管，4 000 r/min離心6 min，收集菌體。將菌體用 100 μL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基重懸，全部涂布于含有100 μg/mL利福平的Middlebrook 7H10平板，37 ℃ 培養(yǎng)4～5 d，記錄單克隆數。利福平耐藥突變頻率=利福平平板上長出的單菌落數/計算的涂板菌液的總活菌數。

1.2.6 突變譜分析收集利福平耐藥菌落，接種于200 μL含100 μg/mL利福平的Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)6～7 d。收集菌體，用200 μL ddH2O洗滌2次，重懸于20 μL ddH2O，98 ℃金屬浴10 min以提取基因組DNA。4 000 r/min離心6 min，取上清液作為PCR模板，使用引物RpoB-F/RpoB-R擴增rpoB基因的I簇區(qū)域，PCR產物進行雙向測序。

1.2.7 RNA提取將-80 ℃保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以OD600=0.02的濃度轉接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8。室溫、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用1 mL TRIzol[7]重懸，使TRIzol與細菌充分接觸，將混合物轉移至2 mL螺口管(含500 μL 0.1 mm二氧化鋯珠)，冰水浴3 min。均質儀裂解菌體步驟如下：5 000 r/min，破碎5次，每次35 s，冰上間隔至少1 min。破碎完成后，4 ℃、16 000 g離心5 min，吸取上層液體于Phase Lock Gel，加入300 μL氯仿，劇烈振蕩20 s，室溫放置10 min使之分層。4 ℃、16 000 g離心10 min，緩慢吸取上層溶液于新的1.5 mL離心管(RNase-free)中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻10次，冰水浴30 min。4 ℃、20 000 g離心30 min，將沉淀物用1 mL預冷的70%乙醇洗滌1次。室溫下干燥核酸沉淀，加入100 μL 1×DNase Ⅰ Buffer(含5 μL RNase-free DNase Ⅰ)，37 ℃水浴30 min。最后利用RNA純化試劑盒進行純化，將獲得的RNA保存于 -80 ℃。

1.2.8 qRT-PCR將提取的分枝桿菌RNA用SuperScriptTMⅣ First-strand Synthesis System試劑盒進行反轉錄，合成的cDNA用TB Green? Premix Ex TaqTMGC(Perfect Real Time)試劑盒進行 qRT-PCR，利用引物對sigA-F/sigA-R、recA-F/recA-R、adnA-F/adnA-R、adnB-F/adnB-R和Ms4259-F/Ms4259-R分別對sigA、recA、adnA、adnB和Ms4259基因進行檢測和擴增。qRT-PCR的內參基因選用sigA，其轉錄在氧化壓力條件下不受影響[8]。采用2-ΔΔCt法比較不同樣本間目的基因的差異表達水平。ΔΔCt=(Ct處理樣本目的基因-Ct處理樣本內參基因) -(Ct對照樣本目的基因-Ct對照樣本內參基因)。

1.2.9 氧氟沙星殺菌曲線測定將 -80 ℃ 保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min 培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以OD600=0.02轉接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8。用Middlebrook 7H9培養(yǎng)基將菌液稀釋至OD600=0.1，每個搖菌管分裝1 mL，加入1.5 μg/mL氧氟沙星，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置。在每個取樣時間點吸取30 μL菌液于270 μL PBST中，梯度稀釋，吸取5 μL點涂于LBG平板，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌落數和稀釋度，計算CFU值。CFU=2×100×a×c;其中a為稀釋倍數,c為該稀釋度下存活的單菌落數。

1.2.10 叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)殺菌曲線測定將 -80 ℃ 保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min 培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以菌液濃度OD600=0.02轉接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至終濃度OD600值為0.6～0.8。每個搖菌管分裝1 mL，加入1 mmol/L t-BHP，37 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)。在每個取樣時間點吸取30 μL菌液于270 μL PBST中，梯度稀釋，吸取5 μL點涂于LBG平板，37 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌落數和稀釋度，參照1.2.9小節(jié)方法計算CFU。

1.2.11 紫外線殺菌實驗將-80 ℃保存的野生型mc2155菌株與ΔMs4259菌株分別接種于2 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至穩(wěn)定期。以OD600=0.02的菌液濃度轉接種子液至10 mL Middlebrook 7H9培養(yǎng)基，37 ℃、100 r/min培養(yǎng)至菌液濃度OD600值為0.6～0.8。用PBST調至菌液濃度OD600=0.1，梯度稀釋至105，并點涂于不含抗生素的Middlebrook 7H10平板。待菌液晾干后，使用紫外交聯儀(美國UVP公司，HL-2000)照射，紫外線輻射劑量為5、10、15、20 mJ/cm2。照射完畢，立即用鋁箔紙包裹平板，于37 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)2～4 d。記錄平板上每個稀釋梯度生長的單克隆數，計算CFU。

1.3 統計學分析

采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計并作圖。除rpoB突變譜分析使用卡方檢驗外，其余數據進行t檢驗，P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 分枝桿菌Ms4259的氨基酸序列分析

利用美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)生物大分子序列比對搜索工具BLAST比較恥垢分枝桿菌mc2155的Ms4259與結核分枝桿菌H37Rv的Rv2191的氨基酸序列，結果顯示氨基酸序列一致性為64%，相似性為74%，表明兩者具有高度同源性。因此，以恥垢分枝桿菌作為模式生物研究Ms4259的功能在一定程度上能夠提示Rv2191在結核分枝桿菌中的作用(見圖1)。利用生物信息學網站InterPro進行蛋白質功能預測和結構域注釋，結果顯示Ms4259含有一個在N端的DEDDh核酸外切酶結構域以及一個在C端的GIY-YIG核酸內切酶結構域， 后者為核苷酸切除修復途徑中內切酶UvrC、Cho和類似蛋白所具有的催化結構域(見圖1)。

The black box is the DEDDh 3′-5′ exonuclease domain. Mtb UvrC is the N-terminal GIY-YIG endonuclease domain of Mycobacterium tuberculosis UvrC (residue 1-103).

2.2 Ms4259非恥垢分枝桿菌生長的必需基因

利用同源重組方法敲除恥垢分枝桿菌mc2155的Ms4259基因(見圖2A)，并用4259testF/4259testR引物驗證基因敲除菌株的基因型。結果如圖2B所示，野生型mc2155菌株能擴增出含目的基因Ms4259的片段(2 455 bp)，ΔMs4259菌株能擴增出含hyg抗性基因的片段 (3 432 bp)，空白對照無條帶，證明ΔMs4259敲除菌株構建成功。通過測定野生型菌株和ΔMs4259菌株的生長曲線，發(fā)現兩者生長能力沒有差異(見圖2C)，提示Ms4259非恥垢分枝桿菌在富營養(yǎng)培養(yǎng)條件下生長的必需基因。

A: Schematic diagram of strain genotypes and process of construction. B: Verification of knockout strain by genotyping PCR with primer 4259testF and 4259testR. C: Growth curves of wild type and ΔMs4259 strains.

2.3 Ms4259參與分枝桿菌基因組穩(wěn)定性的維護

氨基酸序列分析表明，Ms4259具有核酸外切酶和核酸內切酶結構域，提示其與DNA修復有關。為研究Ms4259對恥垢分枝桿菌基因組穩(wěn)定性的影響，本研究測定了施加DNA損傷壓力前后野生型菌株和ΔMs4259菌株的利福平耐藥自發(fā)突變頻率。圖3A結果顯示，在正常實驗室條件培養(yǎng)下，與野生型菌株相比，ΔMs4259敲除菌株的利福平耐藥自發(fā)突變頻率升高約1.9倍(P<0.05)，Ms4259回補菌株的自發(fā)突變頻率無顯著變化，即ΔMs4259敲除菌株的自發(fā)突變頻率升高表型能通過表達野生型Ms4259來實現表型回補。用H2O2處理后，野生型菌株和ΔMs4259菌株自發(fā)突變頻率分別升高約3.8和2.4倍(P<0.000 1)，但兩者之間無統計學差異。絕大多數利福平耐藥突變發(fā)生在rpoB基因Ⅰ簇，因此本研究分別對野生型菌株和ΔMs4259菌株自發(fā)形成的利福平耐藥菌落的rpoB基因Ⅰ簇區(qū)域進行測序。圖3B結果顯示，與野生型菌株相比，ΔMs4259菌株的A: T>C: G突變比率明顯上升，增加約10倍。這些結果表明，Ms4259對維持分枝桿菌基因組的穩(wěn)定性具有重要性。

2.4 Ms4259參與氧化損傷應答

利用熒光qRT-PCR來分析在正常生長狀態(tài)和H2O2處理條件下野生型菌株和ΔMs4259菌株的DNA損傷修復基因表達情況。分枝桿菌的DNA損傷應答系統主要包括SOS應答途徑以及PafBC介導的調控途徑[9]，本研究選用2個途徑共同調控的recA以及單獨被PafBC介導調控的adnA和adnB，作為DNA損傷應答基因[10]。結果顯示，無論是在正常生長條件還是氧化壓力條件下，野生型菌株與ΔMs4259菌株的DNA損傷修復基因轉錄水平無顯著差異(見圖4A)。用5 mmol/L H2O2處理30 min后，recA、adnA和adnB的轉錄情況在野生型菌株和ΔMs4259菌株中的上調水平相似，即兩者在H2O2處理下具有相似的DNA損傷應答能力。此外，野生型菌株的Ms4259基因轉錄水平上調約7倍，表明Ms4259在轉錄水平參與了H2O2引起的氧化損傷應答(見圖4B)。

2.5 Ms4259未參與恥垢分枝桿菌對DNA損傷劑的耐受

為進一步探討Ms4259是否可介導恥垢分枝桿菌對 DNA 損傷劑的耐受， 本研究測定了野生型菌株和ΔMs4259菌株在不同DNA損傷劑處理下的存活率。氧氟沙星作為喹諾酮類殺菌藥物，通過抑制DNA旋轉酶來干擾DNA復制，從而達到殺菌效果。t-BHP是一種烷基氫有機過氧化物，能引起廣泛的DNA氧化損傷。紫外線主要使同一條DNA鏈上的相鄰嘧啶以共價鍵連成二聚體，從而導致DNA損傷。圖5結果顯示，野生型菌株與ΔMs4259菌株在氧氟沙星、t-BHP以及紫外線處理下的存活率無明顯差異，提示Ms4259缺失不影響恥垢分枝桿菌對 DNA 損傷劑引起的 DNA 結構異常的耐受性。

A: Spontaneous and H2O2-induced RIFR mutation frequency. Results shown are mean±SEM of at least 24 independent experiments. *P<0.05, ***P<0.001. B: Mutation spectra expressed in percentage relative to the total mutations identified in the cluster I region of rpoB gene. The number of RIFR colonies selected for sequencing were shown in the center of the ring.

A: qRT-PCR analyses of gene expression in logarithmic-phase strains. All values are normalized to wild type strains. B: qRT-PCR analyses of gene expression in logarithmic-phase strains after exposure to 5 mmol/L H2O2 for 30 min. All values are normalized to untreated samples. Data shown are mean±SEM of three independent experiments.

A: Ofloxacin (1.5 μg/mL). B: t-BHP (1 mmol/L). C: Ultraviolet (0, 5, 10, 15 and 20 mJ/cm2).

3 討論

本研究發(fā)現，較于野生型菌株缺失Ms4259的恥垢分枝桿菌的利福平耐藥自發(fā)突變頻率顯著上升，證實該基因參與恥垢分枝桿菌的基因組維護。但有研究通過波動試驗比較恥垢分枝桿菌野生型與ΔMs4259菌株的突變率，結果顯示無顯著差異[3]。須注意的是，突變率是指單位時間內某種突變發(fā)生的概率，可表示為每個位點、每個基因、每個核苷酸或每個配子在每個世代或每次DNA復制時發(fā)生突變的概率，突變頻率則是指群體內發(fā)生某種突變的細胞或個體數的比例[11]，兩者高度相關，但不相同。本研究結果與此并不沖突。

對篩選到的利福平耐藥菌株的rpoB基因進行測序，發(fā)現A: T>C: G突變在ΔMs4259菌株中發(fā)生的概率比野生型高10倍，提示Ms4259的基因組維護功能與A: T>C: G突變形成有關。A: T>C: G突變是細胞中最常見的與DNA氧化損傷相關的突變類型，與氧化型鳥嘌呤8-oxo-dG在復制過程中錯誤地摻入基因組DNA有關，該堿基易與腺嘌呤(adenine, A)形成錯配，導致A: T>C: G突變形成[12]。同時，本研究還發(fā)現Ms4259在氧化壓力下轉錄表達上調了7倍。以上結果提示，Ms4259可能參與了DNA氧化損傷的修復，但目前還不清楚該修復過程是發(fā)生在DNA復制階段還是復制后修復階段。

目前，對Ms4259及其同源基因的相關研究非常少。有研究發(fā)現，結核分枝桿菌Rv2191在絲裂霉素C處理后能以PafBC介導途徑調控的方式誘導表達[13]，提示其與結核分枝桿菌的DNA損傷應答有關，與本研究結果一致。在結核分枝桿菌感染兔模型中，Rv2191在結核潛伏感染和復蘇階段表達水平提高，提示其可能參與了結核分枝桿菌的持留或復蘇[4]。細菌在潛伏感染時處于一種相對靜止代謝的狀態(tài)(不發(fā)生復制)，此狀態(tài)下細菌基因組面臨宿主細胞環(huán)境，即使DNA損傷也不會及時修復，因此細菌重新活化時須優(yōu)先表達DNA損傷修復基因，從而去修復受損的基因組，避免直接復制導致更嚴重的雙鏈斷裂[14]。然而，目前對分枝桿菌復蘇階段DNA修復和復制的機制研究還十分欠缺。

Ms4259蛋白的N端具有3′-5′核酸外切酶結構域，C端有類UvrC內切酶結構域，提示其具有在同一個DNA序列上進行內切后再利用自身外切酶活性進行核苷酸切除的潛在能力。目前研究發(fā)現，分枝桿菌DNA損傷修復系統既復雜又冗余，具有堿基切除修復、核苷酸切除修復、非同源端連接、單鏈退火、雙鏈DNA斷裂修復和非經典的錯配修復等修復方式，這些DNA修復過程都須通過DNA損傷應答途徑來上調特定的DNA損傷修復基因的水平[15]。本研究發(fā)現，Ms4259缺失不會導致恥垢分枝桿菌突變頻率大幅升高，也不影響恥垢分枝桿菌在DNA損傷條件下的存活率。本文結論提示Ms4259在恥垢分枝桿菌的DNA代謝系統中可能是冗余的，也可能與特定條件下(如細菌休眠與復蘇)的DNA修復調控有關，相關機制有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究揭示了分枝桿菌Ms4259及其同源物的生理功能、突變譜特點及參與氧化壓力應答轉錄調控的特點，為進一步探討其作用機制奠定了基礎。