楊 敏，李 斌，鄒 燃，鄧 薇，徐派的，李 悅

（武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院 武漢 430022）

腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）是一種持續(xù)發(fā)病或間斷發(fā)病的慢性腸道性疾病，發(fā)病癥狀通常表現為腹痛、腹脹、腹部不適、排便不規(guī)律、大便異常等[1]，該病的發(fā)病機制尚未有系統(tǒng)說明，其病因及誘發(fā)因素囊括了人格特性、精神心理狀態(tài)、飲食習慣、感染、家族遺傳等多個方面，病變上至中樞神經系統(tǒng)的紊亂，下至局部胃腸道神經—內分泌網絡的異常調節(jié)。在我國，IBS的發(fā)病率逐年上升，嚴重影響人的正常生活及工作質量，給社會帶來較大的經濟負擔[2]。IBS可分為腹瀉型、便秘型和混合型。但在某些個體中，IBS可能在感染性疾病后急性發(fā)作并發(fā)展成具有發(fā)燒、嘔吐和腹瀉等特征的綜合征，被稱為感染后腸易激綜合征（Post-infectious irritable bowel syndrome，PI-IBS）[3]。目前，因為化學試劑誘導的炎癥反應和宿主免疫激活可以在一定程度上模仿IBS的臨床特征，該方式誘導的IBS動物模型已廣泛用于IBS的機理研究。

在IBS發(fā)病過程的研究中，腦腸軸的重要功能作用愈加受到重視[4]，有研究證明中樞神經系統(tǒng)、自主神經、免疫及內分泌機制參與了腸穩(wěn)態(tài)以及腸管運動的調節(jié)[5]。因此對該病的治療也漸漸從針對終末靶器官消化道，慢慢轉變?yōu)榫裥睦碇委?，其中包含改善腦腸軸穩(wěn)態(tài)的綜合治療，達到緩解癥狀和改善生活質量的治療目標。5-HT便是存在于中樞和外周神經系統(tǒng)的一種腦腸肽，調節(jié)許多神經遞質的釋放，影響各種生物和神經過程，例如攻擊、焦慮、情緒等[6-8]。因此，5-HT的穩(wěn)定能夠反映腦腸軸的穩(wěn)態(tài)，從而提示機體的精神狀態(tài)。

然而，目前IBS臨床治療方式多以對癥用藥處理為主，但存在的缺點較為明顯，用藥后往往出現較大副作用，治療效果不佳。但在中醫(yī)中，“泄瀉”與腸易激綜合征表現的臨床癥狀相似，中醫(yī)臨床治療研究證明針刺、推拿在腸易激綜合征的防治中具有簡、便、廉、驗的特點，具有確切的療效[9-10]。因此，本課題以腸易激綜合征動物模型為研究對象，服用蒙脫石散及氟哌噻噸美利曲辛片并結合以內關、天樞、太沖為主的針刺進行治療，闡述針刺三大穴位的治療效果和其聯(lián)合藥物對藥物治療效果的提升作用，探索針刺對腸易激綜合征的潛在治療效果，為臨床上治療IBS的方案提供改進方向。

1 材料

1.1 實驗動物

SD大鼠42只（雄性，6周齡，每只220 g），實驗許可證號：SYXK（鄂）2018-0104；溫度22-26℃，相對濕度50%-60%的飼養(yǎng)條件下進行飼養(yǎng)，人工光照明暗各12 h。在本次實驗過程中，按照《實驗動物管理條例》等相關文件標準進行飼養(yǎng)與處置。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉（貨號P3761，sigma merck公司）；三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid sol，TNBS）（貨號C9801，sigma公司）；大鼠5-羥色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，大鼠髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（貨號分別為RA20031，RA20325，bio-swamp公司）；伊紅，蘇木素（貨號分別為C0109，C0107，碧云天公司）；Masson三色染色試劑盒（貨號G1340，Solarbio公司）；中性樹脂（貨號S30509，源葉公司）；甲苯胺藍染色液（貨號G1032，Servicebio公司）；化學發(fā)光試劑（貨號MFA5310，rongbai公司）。

1.3 儀器

電子天平（型號FB124，舜宇公司）；顯微剪，顯微鑷（型號分別為WA1020，WA3040，金鐘公司）；酶標分析儀，酶標洗板機（型號分別為AMR-100，APW-200，杭州奧盛公司）；正置顯微鏡（型號JZYQ，皆準公司）；石蠟切片機（型號API-365，艾普公司）；攤片烤片機，生物組織包埋機-冷凍機（型號分別為TK7218，HS-B，恒松公司）；生物組織包埋機（型號KH-BL1，孝感闊海公司）；自動組織脫水機（型號ZT-12P2，亞光病理公司）；全自動化學發(fā)光分析儀（型號FST-I-05，普力菲爾公司）

2 方法

2.1 大鼠腸易激綜合征模型的構建

將大鼠分為對照組（6只）和IBS模型組（36只），實驗前大鼠禁食24 h，采用2%戊巴比妥鈉按照0.2 mL·100 g-1的劑量腹腔注射麻醉深度麻醉。參照Qin等[11]的方法對模型組進行造模，模型組大鼠于離肛門處8 cm，將細塑料導管進入降結腸，大鼠頭部向下垂直放置，1 min內緩慢給予50 mg TNBS，灌注后留置導管1 min后緩慢取出。對照組大鼠以相同方法給予相同體積生理鹽水灌注。造模1周后將對照組大鼠與3只IBS模型組大鼠麻醉，取結腸組織，通過結腸潰瘍和炎癥肉眼評分、結腸組織中5-羥色胺及大鼠髓過氧化物酶含量進行模型鑒定。與對照組相比，IBS模型組結腸潰瘍評分均為4，結腸組織中5-羥色胺及大鼠髓過氧化物酶含量明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05），表明IBS模型復制成功。

2.2 分組治療

除設置6只健康大鼠為空白對照組外，將建模成功的36只大鼠隨機分為6組：IBS模型組、藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組、藥物治療A+B+針刺組。對照組和IBS模型組每天灌胃生理鹽水；藥物治療A組每天給予蒙脫石散灌胃25 mg·kg-1·d-1，連續(xù)2周；針刺組參照《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜定位，將大鼠捆綁后，取內關、天樞和太沖穴，每穴斜刺0.7 mm，并穴位旁開5 mm平刺，接電針。電刺參數為疏密波，頻率2-100 Hz，強度0.1-0.2 mA，以肌肉微微顫動為度，每次20 min，每天1次，連續(xù)2周；藥物治療A+針刺組每天給予蒙脫石散灌胃25 mg·kg-1·d-1，并以內關、天樞、太沖電針，連續(xù)2周。藥物治療A+B組每天給予蒙脫石散灌胃25 mg·kg-1·d-1，氟 哌 噻 噸 美 利 曲 辛 片 灌 胃0.056 mg·kg-1·d-1，連 續(xù)2周。藥物治療A+B+針刺組每天給予蒙脫石散灌 胃25 mg·kg-1·d-1，氟 哌 噻 噸 美 利 曲 辛 片 灌 胃0.056 mg·kg-1·d-1，并以內關、天樞、太沖電針，連續(xù)2周。給藥14 d后，麻醉后腹主動脈取血，取腦和結腸。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般行為學觀察

密切觀察大鼠的精神、活動變化、毛發(fā)潤澤度及體重增長變化等。

2.3.2 結腸潰瘍和炎癥肉眼評分

按照表1中的標準對各組大鼠的臨床表現進行評分。

表1 結腸潰瘍和炎癥肉眼評分標準

2.3.3 AWR評分

參照Elie等[9]的方法進行檢測，2周治療后，大鼠禁食24 h、不禁水，麻醉后固定，用PTCA固定橡膠球囊，插入肛門6 cm并固定。大鼠蘇醒后給球囊充氣加壓，初壓約20 mmHg，壓力遞升20 mmHg直至80 mmHg，每個壓力觀察20 s，期間休息至少5 min，根據大鼠腹部回縮反射（見表2）進行AWR評分。

表2 AWR評分標準

2.3.4 生化檢測結腸組織中5-HT、MPO含量

根據大鼠5-HT酶聯(lián)免疫分析試劑盒和大鼠MPO酶聯(lián)免疫分析試劑盒的說明書，以空白組大鼠作為對照，對IBS模型組大鼠的結腸組織進行檢測。

2.3.5 蘇木精-伊紅染色法及Masson觀察結腸組織變化

將固定好的結腸組織切取0.3 cm的厚度，按常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋，切片厚度為3 μm，水浴展片，撈片，將切片小心貼附于載玻片上，控片，然后將切片放入展片器展片，貼平粘緊后烤片。根據蘇木精-伊紅染色法及Masson三色染色試劑盒的步驟對組織切片進行染色，通過顯微鏡拍照，Leica Application Suite 圖象系統(tǒng)采集樣本相關部位。

2.3.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0進行數據分析。計量資料以平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 一般情況比較

在造模過程中，空白組的大鼠精神食欲良好、活動正常、毛色光滑潤澤；模型組在造模后逐漸出現精神狀態(tài)差、食欲減退、毛色干燥。造模結束后，對照組的體重增長良好，而模型組的體重不斷下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）（見表3和圖1）。結束造模后開展治療，藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組、藥物治療A+B+針刺組各組在治療后精神狀態(tài)、活動情況以及毛色得到好轉。與對照組相比，IBS模型組體重增長z值低，差異顯著（P〈0.05）；藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組體重增長值與對照組相比較低，但比IBS模型組要高；藥物治療A+B+針刺組體重增長值明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。

表3 各組大鼠體重增長值比較

圖1 各組大鼠體重增長值比較

3.2 各組大鼠治療后結腸潰瘍和炎癥肉眼評分比較與AWR評分比較

結果（表4、圖2和圖3）顯示，IBS模型組的肉眼評分顯著高于空白對照組（P〈0.05）；藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組的肉眼評分高于空白對照組，但顯著低于IBS模型組；藥物治療A+B+針刺組的肉眼評分與空白對照組相同，顯著低于IBS模型組（P〈0.05）。IBS模型組的AWR評分顯著高于空白對照組（P〈0.05）；藥物治療A組、針刺組、藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組的AWR評分高于空白對照組，但顯著低于IBS模型組；藥物治療A+B+針刺組的肉眼評分與空白對照組相同，顯著低于IBS模型組（P〈0.05）。

表4 各組大鼠治療后肉眼評分與AWR評分比較

圖2 各組大鼠結腸潰瘍和炎癥肉眼評分比較

圖3 各組大鼠治療后AWR評分比較

3.3 治療后結腸組織中5-HT及MPO含量的比較

如表5、圖4和圖5結果所示，與空白對照組相比，IBS模型組中5-HT和MPO含量顯著升高，約為3倍和4倍；藥物治療A組和針刺組顯著高于空白組，低于IBS模型組；藥物治療A+針刺組、藥物治療A+B組顯著高于對照組，低于IBS模型組、藥物治療A組和針刺組；藥物治療A+B+針刺組高于對照組，但顯著低于其余各組。

圖4 各組大鼠結腸組織中5-HT含量

圖5 各組大鼠結腸組織中MPO含量

表5 各組大鼠治療后5-HT與MPO含量評分比較

3.4 結腸組織HE染色及Masson染色結果

HE染色結果（圖6）顯示，與空白對照組相比，IBS模型組的結腸組織中有明顯的致密炎性細胞浸潤，各治療組在治療后炎性細胞明顯減少；Masson染色結果（圖7）顯示，與空白對照組相比，IBS模型組及其余各組的結腸組織粘膜下層和平滑肌中有大量膠原蛋白，細胞發(fā)生了纖維化。

圖6 HE染色結果

圖7 馬松染色結果

4 討論

流行病學調查顯示，全球人群的IBS患病率估計值在7%-21%，而我國普通人群IBS總體患病率為1.4%-11.5%[12-13]。研究發(fā)現，中青年患病率最高，且IBS患者中焦慮、抑郁發(fā)生率較健康人群明顯升高，猜測是受到不斷加快的生活節(jié)奏與不斷增加的社會壓力的影響[14-15]。因此，對IBS有效的治療方法的研究具有重要作用。

IBS在中醫(yī)理論研究中，其發(fā)病位于大腸，病理因素主要是濕，病變臟腑主要在脾，與肝、胃關系較為密切，脾虛濕盛是導致其發(fā)病的關鍵因素，患者極易因飲食寒涼或情緒抑郁時發(fā)病，屬于“泄瀉”、“腹痛”和“郁證”的范疇[16-17]。從中醫(yī)角度來說“泄瀉”包含了IBS，而泄瀉常常與腸道、胃部密切相關。在中醫(yī)臨床診斷治療“泄瀉”時，并非采取服用藥物的方式，而是通過調理腸胃這兩大臟器使“泄瀉”能得到有效的控制。目前中醫(yī)針對“泄瀉”已有較多的研究，其中針灸是其有效且便利的方式[18]。針灸屬于中醫(yī)的一部分，在針灸的過程中對穴位進行針刺，針刺產生疼痛感覺并通過作用到皮膚下的穴位將機體的疼痛集中于一點，對局部的穴位刺激，最終將直接導致局部血管的擴張的目的，促使機體產生自愈反應，以調節(jié)臟腑功能[19]。針灸的基礎是機體的自適應能力，而氣穴就在這當中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。祖國醫(yī)學的研究里，內關穴主治胃、心、胸疾病，有益心安神、理氣和胃之功；天樞穴為足陽明經要穴、大腸募穴，是臟腑經氣輸注和匯聚于胸腹部的腧穴，有理氣調中，健脾和胃功效；太沖穴可使脾陽得助，升清降濁，胃腸氣機調暢，泄瀉乃止[20-21]。本研究則是根據針灸的治療理論中針刺的部分進行設計，采用電針內關、天樞、太沖三個穴位進行針刺治療。

為了檢測針刺對IBS的治療效果，我們進行了對實驗小鼠的AWR評分與5-HT和MPO的濃度檢測。AWR評分在許多研究中被用于檢測IBS模型大鼠的內臟敏感程度及內臟平滑肌收縮情況[22]。本研究顯示針刺治療組能減少回撤反射，在與藥物同用時能發(fā)揮最佳效果，說明針刺內關、天樞、太沖穴位治療IBS效果良好。這和先前報導的能通過類似的方法對天樞、關元、足三里等穴位改善IBS大鼠腹瀉癥狀的研究相一致[23]。5-HT作為調節(jié)腸道運動的神經遞質，能夠顯示腸道的運動狀態(tài)[24]。有研究表明，經TNBS誘導的大鼠IBS模型中，大鼠結腸組織的EC細胞數量增多，其血漿中的5-HT含量也隨之增多[25]。MPO是一種在嗜中性粒細胞中表達的含血紅素的過氧化物酶，是組織損傷和各種炎性疾病的炎癥局部介質，能夠反映腸道結腸組織的炎癥狀況[26-27]。因此，結腸組織內的5-HT和MPO濃度能夠反應結腸組織的腸易激綜合癥的狀況[28]。本研究中采用ELISA方法對各組大鼠結腸組織中5-HT和MPO的含量進行測定，結果顯示各治療組能有效降低結腸組織中5-HT和MPO含量，針刺與藥物治療同時進行時二者含量降低明顯。同時，在結腸組織的病理切片HE染色檢測中，也能明顯觀察到IBS模型組中的炎性細胞明顯增多，在經過分組治療后，炎性細胞減少；Masson染色則顯示與對照組相比，模型組與治療組的結腸組織中膠原蛋白明顯增多。已有研究顯示，類似的許多針刺手法能夠顯著改善患者血清5-HT、VIP、SP水平及臨床癥狀，其中包括：穴位埋線治療、電溫針療法、局部與遠端取穴治療和眼針治療等[29-30]。

近年來的研究表明，腦腸肽如5-HT、SP、血管活性腸肽（Vasoactive intestinal peptide，VIP）、胃動素（Motilin，MTL）、膽囊收縮素（Cholecystokinin，CCK）等的異常表達可導致內臟的高度敏感性，進而引起胃腸動力紊亂，促使IBS的發(fā)病，對腦腸肽等進行調節(jié)干預則是治療腸易激綜合征的一個重要方向。陳祥林等[31]研究發(fā)現針刺治療IBS的療效機制之一是通過神經內分泌途徑影響神經遞質的分泌，即通過腦腸軸有效調節(jié)腦腸肽的分泌。在我們的研究結果中也顯示，針刺和針刺聯(lián)合藥物處理后，腦腸肽5-HT含量也穩(wěn)定下來，驗證了針刺能夠通過影響腦腸軸發(fā)揮作用，能夠猜測針刺及其聯(lián)合藥物的治療方法能夠從神經和心理方面起到一定的治療作用。

盡管本研究能夠初步展示針刺及其聯(lián)合藥物的干預方式能夠起到一定的治療作用，但在后續(xù)的應用探究實驗中我們也會開展更多的相關研究，并添加設置假藥物組、假針刺組等實驗設計，更為詳盡與嚴謹地對針刺及聯(lián)合藥物這一治療方式的治療效果進行驗證。

綜上所述，電針內關、天樞、太沖穴位配合藥物治療能有效改善腸易激綜合征所致的結腸炎癥和內臟敏感性，提示針刺聯(lián)合藥物治療可能有能夠提高腸易激綜合征療效的作用，啟發(fā)針刺聯(lián)合藥物治療對腸易激綜合征的臨床應用。