何 瓔，趙洪慶，吳夢(mèng)瑤，龔 云，王宇紅，張 鵬

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心 長(zhǎng)沙 410208；2.株洲千金藥業(yè)股份有限公司 株洲 412000）

功能失調(diào)性子宮出血（Dysfunctional uterine bleeding，DUB）是指與妊娠、腫瘤、炎癥無(wú)關(guān)的子宮異常出血[1]。包括月經(jīng)周期紊亂、子宮出血和月經(jīng)失血量或持續(xù)時(shí)間的改變，可導(dǎo)致繼發(fā)性感染、貧血甚至不孕[2-3]。其由各種內(nèi)外因素導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌失調(diào)引起[4]，絕大多數(shù)DUB病例中最合理的病理生理機(jī)制是下丘腦垂體卵巢（Hypothalamus pituitary ovary，HPO）軸的不成熟[5]。DUB的發(fā)生還與患者的精神因素密切相關(guān)，消極的情緒可導(dǎo)致激素分泌紊亂而引起異常子宮出血[6]。它可以發(fā)生在排卵和無(wú)排卵周期，月經(jīng)初潮和更年期之間[7]。DUB可通用藥物或手術(shù)治療，臨床上還可采用系統(tǒng)護(hù)理，通過(guò)緩解DUB患者不良情緒加快康復(fù)進(jìn)程[7]。藥物治療多選取避孕藥、孕酮、雌激素等，手術(shù)治療包括宮腔鏡手術(shù)和子宮切除術(shù)[8]。其局限性為副作用大、安全性低，對(duì)患者的生殖能力造成影響[9]。因此開(kāi)發(fā)針對(duì)DUB的有效藥物刻不容緩。

DUB多屬中醫(yī)的“崩漏”、“月經(jīng)量多”等病證，病機(jī)錯(cuò)綜復(fù)雜，病本在腎[10]，中醫(yī)藥治療DUB有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并且療效已經(jīng)得到證實(shí)[11-12]。婦科斷紅飲膠囊由赤芍、益母草、三七、仙鶴草、地榆炭、蒲黃炭等藥組成，具有涼血、止血、化瘀之效。臨床研究表明婦科斷紅飲膠囊治療DUB時(shí)，止血作用相對(duì)較強(qiáng)且作用較為迅速，對(duì)改善患者頭暈、煩躁等癥狀具有改善作用，臨床試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)，藥物臨床應(yīng)用較為安全，該產(chǎn)品臨床證明治療DUB安全有效[13]，然而，婦科斷紅飲膠囊治療DUB的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以揭示藥物、成分、靶點(diǎn)和疾病之間復(fù)雜的整體生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，能夠揭示中藥復(fù)方和疾病之間的關(guān)聯(lián)性，為分析和預(yù)測(cè)藥物的藥理機(jī)制提供了新的視角[14-15]。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)婦科斷紅飲膠囊治療DUB的作用機(jī)制并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步為婦科斷紅飲膠囊的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 研究思路與方法

本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建婦科斷紅飲膠囊“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)婦科斷紅飲膠囊的止血作用機(jī)制的活性成分，可能的核心靶標(biāo)和重要通路。構(gòu)建DUB大鼠模型，采用RT-qPCR和Western blot方法預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，流程圖見(jiàn)圖1。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究婦科斷紅飲膠囊治療DUB的作用機(jī)制研究流程圖

2 研究和分析

2.1 婦科斷紅飲膠囊化學(xué)成分和靶點(diǎn)的收集和篩選

通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）、相關(guān)文獻(xiàn)檢索[16-23]收集婦科斷紅飲膠囊中三七、益母草、赤芍、仙鶴草、地榆炭、蒲黃炭生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18的化學(xué)成分及其對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)蛋白。由于靶標(biāo)蛋白存在命名不規(guī)范等問(wèn)題，使用STRING（https://string-db.org/）中Multiple proteins搜索功能以及UniProt（http://www.uniprot.org/）中UniProtKB搜索功能將所得到的蛋白校檢為官方名稱，剔除非目標(biāo)活性成分，獲得相關(guān)靶點(diǎn)的信息。

2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取與收集

在Gene Cards（https://www.genecards.org/）中以關(guān)鍵詞“haemorrhage”進(jìn)行查詢，將所得結(jié)果導(dǎo)入Excel表格，與婦科斷紅飲膠囊的候選靶標(biāo)蛋白共同導(dǎo)入VENNY 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）進(jìn)行匹配映射生成韋恩圖。查找共同靶點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1（https://cytoscape.org/）得到各項(xiàng)拓?fù)鋮?shù)，篩選大于平均度值的節(jié)點(diǎn)，得到婦科斷紅飲膠囊止血作用的主要化學(xué)成分。

2.3 PPI的構(gòu)建及其核心網(wǎng)絡(luò)的篩選

為進(jìn)一步了解婦科斷紅飲膠囊的潛在靶點(diǎn)對(duì)止血功能的具體作用機(jī)制，再將共同基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種限制為“Homo sapiens”，置信度設(shè)為中等0.04，獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，得到PPI核心網(wǎng)絡(luò)，并將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1（https://cytoscape.org/），對(duì)節(jié)點(diǎn)度（degree）值進(jìn)行分析，確定婦科斷紅飲膠囊止血的核心靶點(diǎn)。

2.4 GO和KEGG分析

以了解篩選出的核心基因功能及其在信號(hào)通路中的作用為目的，將篩選所得的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID，https://david.ncifcrf.gov/），限制物種條件為“Homo sapiens”，設(shè)定閾值為P〈0.05，采取GO生物學(xué)過(guò)程富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，再用在線繪圖網(wǎng)站imageGP（http://www.ehbio.com/ImageGP/index）和GraphPad Prism 7將結(jié)果可視化處理。

2.5 婦科斷紅飲膠囊“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將婦科斷紅飲膠囊的活性成分、與疾病的共同作用靶點(diǎn)、基因名等信息在Excel表格中建立“活性成分-核心靶點(diǎn)”、“核心靶點(diǎn)-重要通路”相互對(duì)應(yīng)關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)表示活性成分，靶點(diǎn)及作用通路，邊表示各節(jié)點(diǎn)間的相互作用關(guān)系。

2.6 婦科斷紅飲膠囊止血作用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.6.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雌性30只，體質(zhì)量250-300 g；雄性15只，體質(zhì)量350-400 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（）湘）2019-0004，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

2.6.2 藥物

婦科斷紅飲膠囊由株洲千金藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20200401，規(guī)格：0.4 g×18粒。

2.6.3 主要試劑和儀器

試劑：羥基脲（H37021289，齊魯制藥有限公司）；醋酸氫化可的松片（H31021270，上海上藥信誼藥廠有限公司）；米非司酮片（H10950347）、米索前列醇片（H20084598）均購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；AKT抗體（BS-0115R）、PI3K抗體（BS-10657R）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HIF-1抗體（PAB44110，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。

儀器：梯度PCR儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司）；超微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（英國(guó)BioDrop公司）；T10BS25型全自動(dòng)勻漿儀（德國(guó)IKA公司）；ECO型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)illumina公司）；Chemi Doc XRS+Imager型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司)。

2.6.4 造模、分組及給藥

參考文獻(xiàn)[24]，將SD大鼠以雌：雄2∶1的比例合籠，次日檢測(cè)雌性大鼠陰道栓并進(jìn)行陰道涂片，確定大鼠是否受孕。將成功受孕的大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及婦科斷紅飲膠囊組，每組6只。從妊娠第1天起，除空白組外，各組于8∶00灌胃羥基脲450 mg·kg-1，皮下注射氫化可的松3.7 mg·kg-1，持續(xù)7天。妊娠第8天，分別于8∶00和18∶00灌胃米非司酮8.5 mg·kg-1和米索前列醇0.1 mg·kg-1，以復(fù)制DUB模型。模型制備成功后，婦科斷紅飲膠囊組給予前期證實(shí)有效的臨床等效4倍劑量（1.296 g·kg-1），體積為10 mL·kg-1，空白組和模型組分別給予等劑量的生理鹽水，干預(yù)14天。給藥完成后，麻醉大鼠，分離子宮組織于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.5 子宮出血量測(cè)定

剪尾法收集大鼠血液20 μL，加入4 mL 5% NaOH，混勻。并將收集的含有每只大鼠的子宮血液棉球置于EP內(nèi)，根據(jù)出血量的實(shí)際情況加適量5% NaOH，一般為4-7 mL，浸漬提取一段時(shí)間后浸泡擠壓搓洗棉球血漬至洗脫液無(wú)色為止，以5% NaOH溶液為空白對(duì)照，在546 nm處分別測(cè)定浸提液以及大鼠靜脈血的吸光度（A）。陰道出血量（μL）=靜脈血量×（A子宮浸提液×V2）/（A靜脈血×V1），式中，V1，V2分別為稀釋靜脈血及浸提子宮血所用NaOH的量（mL）。

2.6.6 RT-qPCR檢測(cè)VEGFA、PI3K、IL6mRNA水平

每組取大鼠子宮組織置于玻璃勻漿器中，按照TRIzol RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA，測(cè)定RNA濃度和純度后按照Thermo試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA后使用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)定各組織樣本PCR產(chǎn)物Cq值，基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算，各基因引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列信息

2.6.7 Western blot檢測(cè)AKT、PI3K、HIF-1蛋白水平

每組取大鼠子宮組織全蛋白，BCA法定量蛋白濃度，隨后對(duì)蛋白依次進(jìn)行變性；電泳（120 V，60 min）；轉(zhuǎn)膜（200 mA，120 min）；脫脂牛奶中封閉1 h；一抗（AKT、PI3K、HIF-1和GAPDH）孵育過(guò)夜；TBST洗3次；二抗孵育1.5 h；TBST洗3次；ECL顯影；應(yīng)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，檢測(cè)相關(guān)通路蛋白表達(dá)。

2.6.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 21.0和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行多組間比較分析。分析方法為One-way ANOVA分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P〈0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 結(jié)果

2.7.1 婦科斷紅飲膠囊候選活性成分的篩選

通過(guò)TCMSP分析平臺(tái)檢索和文獻(xiàn)檢索收集到婦科斷紅飲膠囊化學(xué)成分390個(gè)，其中三七119個(gè)，赤芍119個(gè)，益母草21個(gè)，仙鶴草44個(gè)，地榆炭45個(gè)，蒲黃炭45個(gè)。以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共有69個(gè)化合物符合該條件，經(jīng)去重后得到54個(gè)活性成分，具體信息見(jiàn)表2。

表2 婦科斷紅飲膠囊部分候選活性成分的基本信息

續(xù)表

2.7.2 婦科斷紅飲膠囊與出血的交集基因

通過(guò)TCMSP檢索得到的作用靶點(diǎn)，去除重復(fù)基因后有178個(gè)。出血靶點(diǎn)中包括“haemorrhage”相關(guān)基因955個(gè)，去除重復(fù)基因后有878個(gè)。通過(guò)在線韋恩圖VENNY 2.1.0映射得到交集基因77個(gè)，見(jiàn)圖2。將共同靶點(diǎn)及對(duì)應(yīng)成分導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1，以大于等于兩倍中心度值為標(biāo)準(zhǔn)，得到止血作用靶點(diǎn)20個(gè)，化學(xué)成分13個(gè)。其中，排名前五位的化合物分別為槲皮素（Quercetin）、花生四烯酸（Arachidonic acid）、木犀草素（Luteolin）、山奈酚（Resurrectionlily phenol）、β-谷甾醇（Beta sitosterol）。藥物-活性成分-靶點(diǎn)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)具體信息見(jiàn)圖3。

圖2 婦科斷紅飲膠囊中化合物與出血相關(guān)靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)

圖3 婦科斷紅飲膠囊“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.7.3 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

憑借STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建交集基因的蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，共得到127個(gè)節(jié)點(diǎn)和2525條邊。對(duì)網(wǎng)絡(luò)發(fā)展中所存在的各個(gè)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)（度值、介中心度值）進(jìn)行研究分析，節(jié)點(diǎn)的度值平均為35，故以度值≥70進(jìn)行篩選，符合該條件的節(jié)點(diǎn)有16個(gè)（圖4），分析得到AKT1、IL6、VEGFA、TP53、TNF等關(guān)鍵基因。具體拓?fù)鋮?shù)信息見(jiàn)表3。

表3 拓?fù)浞治?6個(gè)核心靶點(diǎn)信息

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中前16個(gè)核心靶點(diǎn)

2.7.4 生物過(guò)程和通路富集分析

DAVID中GO功能富集分析中獲得的GO條目共405個(gè)（P〈0.05），其中包括生物過(guò)程（Biological process）條目333個(gè)，涉及對(duì)缺氧的反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)等；細(xì)胞組成（Cellular component）條目32個(gè)，涉及胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙和基質(zhì)等；分子功能（Molecular function）條目40個(gè)，涉及酶結(jié)合、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白結(jié)合等。其中生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能分別占比82.2%、7.9%和9.8%，運(yùn)用GraphPad Prism 7對(duì)GO功能富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 婦科斷紅飲膠囊活性成分潛在止血作用靶點(diǎn)的GO生物學(xué)過(guò)程富集分析

KEGG通路富集結(jié)果經(jīng)過(guò)過(guò)濾選擇共獲得86條信號(hào)通路（P〈0.05），包括細(xì)胞凋亡通路，焦點(diǎn)粘連通路，HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。運(yùn)用ImaegeGP對(duì)KEGG通路富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 婦科斷紅飲膠囊活性成分潛在止血作用靶點(diǎn)的KEGG代謝通路富集分析

2.7.5 婦科斷紅飲膠囊“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)

婦科斷紅飲膠囊“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)如圖7所示。該網(wǎng)絡(luò)中共涉及39個(gè)節(jié)點(diǎn)（包括13個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)、16個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)、10個(gè)通路節(jié)點(diǎn)）和426條邊，平均相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)目為10.923，網(wǎng)絡(luò)中心度為0.388。結(jié)果說(shuō)明婦科斷紅飲膠囊存在一個(gè)靶點(diǎn)同時(shí)被多個(gè)化合物所作用且一個(gè)化合物可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)的效應(yīng)，表明了中藥多組分，多靶點(diǎn)的相互作用機(jī)理。

圖7 婦科斷紅飲膠囊“活性成分-核心靶點(diǎn)-重要通路”網(wǎng)絡(luò)

2.7.6 婦科斷紅飲膠囊對(duì)DUB模型大鼠子宮出血量的影響

大鼠空白組出血量為0 mL，造模后，與空白組比較，模型組大鼠子宮出血，用棉簽擦拭陰部可見(jiàn)明顯血跡；給藥干預(yù)后，與模型組相比，婦科斷紅飲膠囊組出血量皆顯著下降（P〈0.01）。見(jiàn)表4。

表4 婦科斷紅飲膠囊對(duì)DUB模型大鼠出血量的影響（±s，n=4）

表4 婦科斷紅飲膠囊對(duì)DUB模型大鼠出血量的影響（±s，n=4）

注：與空白對(duì)照組比較，**P〈0.01；與模型組比較，##P〈0.01。

組別空白組模型組婦科斷紅飲膠囊組劑量--1.296 g·kg-1子宮出血量-0.62±0.03**0.45±0.04**##

2.7.7 婦科斷紅飲膠囊對(duì)DUB模型大鼠子宮內(nèi)VEGFA、PI3K、IL6mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠子宮組織中VEGFA mRNA表達(dá)水平顯著升高（P〈0.001），PI3K和IL6 mRNA表達(dá)水平顯著下降（P〈0.01或P〈0.05）；與模型組比較，婦科斷紅飲膠囊組大鼠子宮組織中VEGFA mRNA表達(dá)水平顯著下降（P〈0.001），PI3K和IL6 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P〈0.05），見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠子宮內(nèi)的VEGFA、PI3K、IL6mRNA表達(dá)（±s，n=4）

表5 各組大鼠子宮內(nèi)的VEGFA、PI3K、IL6mRNA表達(dá)（±s，n=4）

注：與空白組比較，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001；與模型組比較，#P〈0.05，##P〈0.01，###P〈0.001。

組別空白組模型組婦科斷紅飲膠囊組VEGFA 1.16±0.29 2.66±0.29***0.44±0.16###PI3K 2.11±0.25 0.72±0.24**1.50±0.26#IL6 1.03±0.20 0.54±0.10*1.02±0.11#

2.7.8 婦科斷紅飲膠囊對(duì)DUB模型大鼠子宮內(nèi)AKT、PI3K、HIF-1蛋白表達(dá)的影響

與空白組大鼠相比，模型組大鼠子宮內(nèi)的AKT、PI3K、HIF-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P〈0.001或P〈0.05）；與模型組相比，婦科斷紅飲膠囊組的AKT、PI3K、HIF-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P〈0.001或P〈0.01），見(jiàn)表6和圖8。

表6 各組大鼠子宮內(nèi)的AKT、PI3K、HIF-1蛋白表達(dá)（±s，n = 4）

表6 各組大鼠子宮內(nèi)的AKT、PI3K、HIF-1蛋白表達(dá)（±s，n = 4）

注：與空白組比較，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001；與模型組比較，#P〈0.05，##P〈0.01，###P〈0.001。

組別空白組模型組婦科斷紅飲膠囊組AKT 0.64±0.01 0.46±0.03***0.75±0.04###PI3K 0.63±0.02 0.44±0.03***0.56±0.02##HIF-1 0.58±0.04 0.31±0.07*1.16±0.15###

圖8 各組大鼠子宮AKT、PI3K、HIF-1蛋白條帶圖

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本研究利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索得390個(gè)活性成分和178個(gè)藥物靶點(diǎn)，通過(guò)OB和DL的篩選和去重后得到54個(gè)活性成分，借助VENNY 2.1.0和Cytoscape 3.6.1處理后得到止血作用靶標(biāo)20個(gè)，化學(xué)成分12個(gè)。有效化學(xué)成分靠前的為槲皮素、花生四烯酸、木犀草素等。槲皮素可通過(guò)抑制血小板集合因子和血小板聚集發(fā)揮止血作用[25-26]。有研究表明，槲皮素可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)影響IL-6等水平從而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用[27]，還可通過(guò)激活A(yù)KT磷酸化，作用于PI3K/Akt信號(hào)通路，減少氧化應(yīng)激實(shí)現(xiàn)對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用[28]?；ㄉ南┧岬拇x產(chǎn)物前列腺素可通過(guò)IL-8、VEGFA等來(lái)調(diào)控子宮內(nèi)膜的修復(fù)[29-31]。木犀草素具有較顯著的促凝血作用[32]。PPI分析顯示，婦科斷紅飲膠囊可能與AKT1、IL6、VEGFA、TP53、TNF等多個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生協(xié)同作用，這些靶點(diǎn)分別通過(guò)調(diào)控炎癥反應(yīng)、激素合成、增殖與凋亡來(lái)有效控制子宮出血[33]。其中，AKT1參與代謝、增殖、細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和血管生成等多種生物學(xué)過(guò)程。IL6為多效性細(xì)胞因子，IL6在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢癌患者的早期診斷中有應(yīng)用價(jià)值[34]，調(diào)控IL6表達(dá)水平，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而防止子宮異常出血。VEGFA為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，參與新血管形成和炎癥反應(yīng)等過(guò)程，通過(guò)防止子宮內(nèi)膜過(guò)度增生，對(duì)子宮內(nèi)膜有一定的修復(fù)和保護(hù)作用，達(dá)到止血效果[35-36]。以上表明，婦科斷紅飲膠囊可能通過(guò)本次篩選的槲皮素、花生四烯酸、木犀草素等作用于AKT、IL6、VEGFA等靶點(diǎn)發(fā)揮止血的作用。

GO分析表明婦科斷紅飲膠囊主要的生物學(xué)過(guò)程是生物過(guò)程，其中涉及對(duì)藥物的反應(yīng)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)節(jié)等。KEGG富集分析表明婦科斷紅飲膠囊主要是通過(guò)調(diào)控HIF-1、PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路治療出血。在低氧狀態(tài)下，機(jī)體可通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1信號(hào)通路來(lái)維持內(nèi)環(huán)境的氧穩(wěn)態(tài)，抑制血管生成、細(xì)胞增殖[37-38]。研究表明低氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）可通過(guò)誘導(dǎo)分泌血管新生相關(guān)因子生成，達(dá)到修復(fù)血管和止血作用[39]。PI3K為細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，Akt是PI3K下游的信號(hào)分子，PI3K和Akt可通過(guò)調(diào)控血小板的功能反應(yīng)和血栓形成，從而發(fā)揮止血作用[40-42]，機(jī)體可通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的信號(hào)表達(dá)從而介導(dǎo)血小板聚集、血栓形成，達(dá)到止血的目的。NF-κB信號(hào)通路為PI3K/Akt信號(hào)通路的下游通路，NF-κB是NF-κB信號(hào)通路中的重要作用因子，NF-κB磷酸化激活后可活化內(nèi)皮細(xì)胞或炎性細(xì)胞，促使細(xì)胞釋放一系列細(xì)胞因子、粘附分子等介質(zhì)，參與白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用以及組織的損傷。Malaver等[43]研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB與血小板活化、止血、炎癥和轉(zhuǎn)移相關(guān)。唐利等[44]研究發(fā)現(xiàn)炙甘草湯可通過(guò)活化NF-κB信號(hào)通路，調(diào)節(jié)凝血/抗凝血?jiǎng)討B(tài)平衡，發(fā)揮促凝作用，從而增加血小板數(shù)量和促進(jìn)其的聚集，加快血液凝固，縮短止血時(shí)間，發(fā)揮止血效果。本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)婦科斷紅飲膠囊干預(yù)后，大鼠出血癥狀減輕，VEGFA水平顯著降低，PI3K和IL6水平顯著上升。以上結(jié)果表明婦科斷紅飲膠囊可能通過(guò)活性成分作用于VEGFA、PI3K和IL6靶點(diǎn)，激活PI3K-Akt、HIF-1信號(hào)通路來(lái)抑制子宮出血。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析婦科斷紅飲膠囊止血作用的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律，但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和數(shù)據(jù)庫(kù)具有一定的局限性，增強(qiáng)對(duì)分析結(jié)果的驗(yàn)證是保障網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可靠性的重要手段[45]，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)婦科斷紅飲膠囊的止血作用機(jī)制進(jìn)行探索性研究，揭示了婦科斷紅飲膠囊止血治療的多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，同時(shí)也為婦科斷紅飲膠囊的止血治療提供理論依據(jù)。