吳娉婷，肖 易，梁英業(yè)，謝柳紅，丁 瑤，盧棟明，陳曉紅，唐宏亮

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 南寧 530000；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬防城港醫(yī)院 防城港 538000）

神經(jīng)病理性疼痛（Neuropathic pain，NPP）是由軀體感官神經(jīng)系統(tǒng)的病變或疾病引起的疼痛，流行病學(xué)研究的系統(tǒng)回顧報(bào)道神經(jīng)病理性疼痛的患病率為6.9-10%[1]。由于NPP擁有極其復(fù)雜的的病理生理學(xué)，NPP也被認(rèn)為是目前神經(jīng)原性疼痛綜合征臨床治療的主要挑戰(zhàn)[2]。盡管國(guó)內(nèi)外在NPP的發(fā)病機(jī)制和治療方面已經(jīng)取得了巨大的進(jìn)展，但目前治療這一疾病的方法包括藥物干預(yù)（三環(huán)類抗抑郁藥、曲馬多以及低劑量的阿片類藥物等）、物理療法和脊髓刺激等，其中藥物干預(yù)容易誘導(dǎo)強(qiáng)迫性濫用，而物理療法和脊髓刺激的效果有限且適用性不廣。因此深入探索疼痛的發(fā)病機(jī)制，尋找疼痛治療靶點(diǎn)，對(duì)提高疼痛治療效果有著深遠(yuǎn)的意義。

MicroRNAs[3]越來(lái)越被認(rèn)為是免疫和神經(jīng)元基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是NPP病理生理學(xué)的潛在主開(kāi)關(guān)。且越來(lái)越多的證據(jù)強(qiáng)調(diào)，神經(jīng)病理性疼痛的誘導(dǎo)和維持伴隨著MicroRNAs表達(dá)的變化，而這些MicroRNAs表達(dá)的變化似乎與神經(jīng)損傷、痛覺(jué)過(guò)敏和神經(jīng)可塑性相關(guān)[4]。最近的研究表明[5]miR-21在神經(jīng)病理性疼痛晚期損傷的背根神經(jīng)節(jié)（Dorsal root ganglia，DRG）神經(jīng)元增加，而阻斷miR-21可以緩解神經(jīng)病理性疼痛。與此同時(shí)研究顯示[6]miR-21-5P在DRG神經(jīng)元中高表達(dá)，而鞘內(nèi)注射miR-21-5P拮抗劑可以降低神經(jīng)病理性疼痛的超敏反應(yīng)和炎癥巨噬細(xì)胞在DRG中的募集程度。但miR-21-5P在脊髓背角的表達(dá)尚不明確。本團(tuán)隊(duì)的前期研究已經(jīng)反復(fù)印證了推拿的鎮(zhèn)痛作用[7-8]，也從神經(jīng)傳遞角度闡明了推拿的鎮(zhèn)痛機(jī)制[9-10]。但其機(jī)制尚未完全闡述清楚，還有待進(jìn)一步研究。因此本實(shí)驗(yàn)從微小RNA角度出發(fā)闡明神經(jīng)病理性疼痛在脊髓背角當(dāng)中的發(fā)病機(jī)制以及推拿的鎮(zhèn)痛機(jī)制，為完善推拿治療NPP的效應(yīng)研究提供研究依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只健康雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重210-240 g，月齡為6周。由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)在廣西中醫(yī)藥防治醫(yī)學(xué)分子生物實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房中，濕度恒定，室溫18-20℃，按時(shí)更換墊料以及給予飼料、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天。本實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程符合廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物使用及倫理委員會(huì)審查。

1.2 主要試劑及儀器

microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa），TB Green PCR熒光試劑（TaKaRa），抗STAT3抗體（PTG），抗ERK抗體（PTG），蛋白定量試劑盒（BCA法）（碧云天），IL-1β ELISA試劑盒（賽默飛），Thermo Scientific Piko Real 96 PCR儀（賽默飛公司，美國(guó)），Bio-Rad Powerpac HC電泳儀及ChemiDoc MP Touch Hot圖像掃描儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），電子von Frey 2393及熱板痛覺(jué)測(cè)試儀（IITC公司，美國(guó)），酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

將40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組：正常組（n=8）、假手術(shù)組（n=8）、模型組（n=8），假推拿組（n=8）、推拿組（n=8）。

2.2 造模方法

參照課題組前期研究[11]，模型組、推拿組和假推拿組建立大鼠L5脊神經(jīng)結(jié)扎（SNL）模型。按照3 mL·kg-1的大鼠體重配置10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉后，定位每只大鼠的左側(cè)后上棘，剃除該部位及周邊的毛發(fā)備皮。常規(guī)消毒后于后上棘左側(cè)與脊柱垂直切開(kāi)，約2 cm長(zhǎng)，與脊柱平行。分離左側(cè)棘旁的筋膜和肌肉后，顯露脊柱。用小咬鉗去除L5橫突，暴露L5脊神經(jīng)，用5-0可吸收縫線將神經(jīng)結(jié)扎，僅單側(cè)結(jié)扎。假手術(shù)組僅暴露L5脊神經(jīng)2-3 min，不結(jié)扎。最后用生理鹽水清洗手術(shù)創(chuàng)口，并給予碘伏消毒，逐層關(guān)閉傷口?？p合傷口后將大鼠放入籠中觀察，直至麻醉恢復(fù)，以免窒息導(dǎo)致死亡。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為術(shù)后大鼠患側(cè)出現(xiàn)跛行、撤足、抬足。

2.3 干預(yù)方法

推拿組選擇足少陽(yáng)膽經(jīng)上的“環(huán)跳”、“陽(yáng)陵泉”和“懸鐘”三個(gè)穴進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)時(shí)用布袋將大鼠束縛防止掙扎，然后使用按摩推拿手法模擬儀（中國(guó)人民共和國(guó)發(fā)明專利號(hào)：ZL 200710187403.1）從造模后第1天開(kāi)始進(jìn)行推拿治療。按摩推拿手法模擬儀按摩頭選用直徑10 mm的圓形光滑接觸面，刺激力量為4 N，手法模擬點(diǎn)法、揉法和撥法。每天1次，每次每穴每法1 min，每側(cè)共9 min，每次治療18 min（雙側(cè)），連續(xù)干預(yù)7天；假推拿組的大鼠同樣用布袋束縛防止掙扎，每天給予雙后肢18 min的輕輕撫摸，連續(xù)干預(yù)7天。正常組、模型組以及假手術(shù)組只觀察7天，不做任何干預(yù)處理。

2.4 觀察指標(biāo)

2.4.1 大鼠患側(cè)機(jī)械痛閾值（PWMT）的測(cè)定

將大鼠提前放入鐵籠中適應(yīng)環(huán)境，當(dāng)大鼠停止自我梳理和探索活動(dòng)時(shí)選用4 g、6 g、8 g、10 g、15 g、26 g、60 g、100 g的von-Frey纖維絲依次從鐵籠底部伸進(jìn)去刺激大鼠的患側(cè)足，當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足或舔趾等陽(yáng)性反應(yīng)行為時(shí)，記錄所對(duì)應(yīng)的纖維絲的刺激強(qiáng)度。連續(xù)測(cè)3次，每次測(cè)量間隔15 s，取平均值即為機(jī)械痛閾值。于術(shù)前第1天及術(shù)后第3、7天進(jìn)行PWMT測(cè)量。

2.4.2 大鼠患側(cè)熱痛閾值(PWTL)的測(cè)定

按Hargreaves[12]法測(cè)定。當(dāng)測(cè)試儀達(dá)到預(yù)設(shè)溫度52.5℃時(shí)，將大鼠按組別依次放進(jìn)測(cè)試儀的有機(jī)玻璃動(dòng)物籠內(nèi)，等大鼠停止自我梳理和探索活動(dòng)時(shí)按下計(jì)時(shí)器，當(dāng)大鼠患側(cè)足出現(xiàn)舔足、回縮或跳躍時(shí)測(cè)試儀上顯示的時(shí)間即為大鼠熱痛閾值（PWTL）。在沒(méi)有反應(yīng)的情況下，在30 s時(shí)將大鼠從熱板上取出，以避免組織損傷。每只大鼠測(cè)量3次，每次測(cè)量時(shí)間隔5 min，取平均值作為熱痛閾值。于術(shù)前第1天及術(shù)后第3、7天進(jìn)行PWTL測(cè)量。

2.4.3 蛋白免疫印跡

使用蛋白免疫印跡法檢測(cè)干預(yù)7天后的大鼠脊髓（L4-6）中ERK、STAT3的蛋白相對(duì)表達(dá)量。按照每100 mg組織加入1 mL蛋白裂解液的方法取L4-6段脊髓放入蛋白裂解液中進(jìn)行低溫勻漿，4℃ 12 000 rpm離心10 min，取上清液。各樣本蛋白濃度使用BCA蛋白濃度試劑盒測(cè)定。用SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封膜1 h，加入稀釋后的抗體（STAT3一抗，1∶1000；ERK一抗，1∶1000），放置4℃冰箱孵育過(guò)夜。清洗后孵育二抗（1∶5000）1 h。滴加ECL溶液，使用Bio-Rad ChemiDoc MP Touch Hot圖像掃描儀采集圖像。使用Image J軟件分析圖像結(jié)果。

2.4.4 酶聯(lián)免疫吸附

使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)干預(yù)7天后的大鼠血清中IL-1β含量，所有操作步驟按照試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行。終止反應(yīng)后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

2.4.5 熒光定量PCR

使用熒光定量PCR法檢測(cè)干預(yù)7天后的大鼠脊髓（L4-6）中miR-21-5P mRNA表達(dá)。用Trizol試劑提取總RNA，然后按照PCR產(chǎn)品試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。miR-21-5P、β-actin基因序列引物由TaKaRa公司提供，引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 1 min，95℃；50℃ 30 s。將所得Ct值按照2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

表1 熒光定量PCR的引物序列

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Tamhane’s T2檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。以P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠的PWMT比較

術(shù)前各組大鼠的機(jī)械痛閾值無(wú)顯著差異。術(shù)后第3天，機(jī)械痛閾值結(jié)果顯示模型組、假手術(shù)組、假推拿組和推拿組較正常組相比均下降，模型組較假手術(shù)組下降（P〈0.05），且正常組及假手術(shù)組顯著高于模型組，數(shù)據(jù)顯示正常組為（54.00±5.07）、假手術(shù)組為（38.87±8.54）、模型組為（12.75±1.66）；與模型組、假推拿組相比，推拿組的機(jī)械痛閾值升高（P〈0.05），且推拿組顯著高于模型組為（39.37±8.07）、假推組為（22.37±5.04）。術(shù)后第7天，結(jié)果顯示模型組與假推組的機(jī)械痛閾值較正常組降低，模型組的機(jī)械閾值較假手術(shù)組降低（P〈0.05），且發(fā)現(xiàn)大鼠模型組的機(jī)械痛閾值為（16.50±2.87），推拿組的機(jī)械痛閾值為（45.87±8.11），推拿組和模型組相比痛閾明顯提高（P〈0.05），提示推拿有助于緩解SNL大鼠的疼痛，且能恢復(fù)SNL大鼠的痛閾。如表2，圖1所示。

圖1 推拿對(duì)NPP大鼠機(jī)械痛閾值的影響

表2 推拿對(duì)NPP大鼠機(jī)械痛閾值的影響（±s，g，n=8）

表2 推拿對(duì)NPP大鼠機(jī)械痛閾值的影響（±s，g，n=8）

注：與正常組比較，#P〈0.05；與假手術(shù)組比較，*P〈0.05；與模型組和假推拿組比較，+P〈0.05。

組別正常組模型組假手術(shù)組推拿組假推組術(shù)前1天52.87±6.97 50.75±8.32 51.00±7.32 53.62±7.5 50.37±5.62術(shù)后3天54.00±5.07 12.75±1.66#*38.87±8.54#39.37±8.07#+22.37±5.04#術(shù)后7天52.12±5.27 16.50±2.87#*44.25±6.11 45.87±8.11+26.00±4.34#

3.2 各組大鼠的PWTL比較

術(shù)前各組大鼠的熱痛閾值無(wú)顯著差異。術(shù)后第3天，熱痛閾值結(jié)果顯示模型組、假手術(shù)組、假推拿組和推拿組較正常組相比均下降，模型組較假手術(shù)組下降（P〈0.05），且正常組及假手術(shù)組顯著高于模型組，數(shù)據(jù)顯示正常組為（27.09±5.80）、假手術(shù)組為（21.64±1.54）、模型組為（12.20±1.36）；與模型組、假推拿組相比，推拿組的熱痛閾值升高（P〈0.05），且推拿組顯著高于模型組為（23.01±0.98）、假推組為（16.73±1.81）。術(shù)后第7天，結(jié)果顯示模型組與假推組的熱痛閾值較正常組降低，模型組的機(jī)械閾值較假手術(shù)組降低（P〈0.05），且發(fā)現(xiàn)大鼠模型組的熱痛閾值為（16.43±1.27），推拿組的熱痛閾值為（27.98±2.19），推拿組與模型組相比對(duì)熱刺激的耐受明顯提高（P〈0.05），提示推拿有助于緩解SNL大鼠的疼痛，且能提高大鼠對(duì)熱刺激的閾值。如表3，圖2所示。

表3 推拿對(duì)NPP大鼠熱痛閾值的影響（±s，g，n=8）

表3 推拿對(duì)NPP大鼠熱痛閾值的影響（±s，g，n=8）

注：與正常組比較，*P〈0.05；與假手術(shù)組比較，#P〈0.05；與模型組和假推拿組比較，△P〈0.05。

組別正常組模型組假手術(shù)組推拿組假推組術(shù)前1天29.06±1.29 30.50±1.78 30.34±1.19 30.44±1.67 29.55±1.59術(shù)后3天27.09±5.80 12.20±1.36*#21.64±1.54*23.01±0.98*△16.73±1.81*術(shù)后7天27.26±7.48 16.43±1.27*#28.34±1.29 27.98±2.19△20.42±2.70*

圖2 推拿對(duì)NPP大鼠熱痛閾值的影響

3.3 各組大鼠脊髓背角中miR-21-5P mRNA表達(dá)的比較

術(shù)后第7天，模型組脊髓miR-21-5P mRNA的表達(dá)相較于正常組及假手術(shù)的表達(dá)升高（P〈0.01），且推拿組miR-21-5P mRNA的表達(dá)較模型組顯著下降（P〈0.01）。如表4，圖3所示。

表4 推拿對(duì)NPP大鼠脊髓組織中miR-21-5P mRNA表達(dá)的影響（±s，2-△△ct，n=8）

表4 推拿對(duì)NPP大鼠脊髓組織中miR-21-5P mRNA表達(dá)的影響（±s，2-△△ct，n=8）

注：與正常組及假手術(shù)組比較，*P〈0.01；與模型組比較，**P〈0.01。

組別正常組模型組假手術(shù)組推拿組假推組miR-21-5P表達(dá)水平1.00±0.00 6.53±1.12*2.47±0.80 1.10±0.41**1.83±0.57

圖3 推拿對(duì)NPP大鼠脊髓組織中miR-21-5P mRNA表達(dá)的影響

3.4 各組大鼠脊髓背角中ERK、STAT3蛋白表達(dá)的比較

術(shù)后第7天，模型組脊髓背角ERK、STAT3的表達(dá)相較于正常組及假手術(shù)組的表達(dá)升高（P〈0.01）。經(jīng)推拿干預(yù)后，推拿組的ERK表達(dá)下降，與模型組相比表達(dá)差異明顯（P〈0.05），推拿組的STAT3表達(dá)同樣下降，與模型組相比差異具有顯著性（P〈0.01）。如圖4所示。

圖4 推拿對(duì)NPP大鼠脊髓組織中ERK、STAT3蛋白表達(dá)的影響

3.5 各組大鼠血清中IL-1β表達(dá)的比較

術(shù)后第7天，模型組IL-1β的表達(dá)相較于正常組及假手術(shù)組的表達(dá)升高（P〈0.05）。經(jīng)推拿干預(yù)后，推拿組的IL-1β表達(dá)降低，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。如表5，圖5所示。

表5 推拿對(duì)NPP大鼠血清中IL-1β表達(dá)的影響（±s，pg·mg-1，n=8）

表5 推拿對(duì)NPP大鼠血清中IL-1β表達(dá)的影響（±s，pg·mg-1，n=8）

注：與正常組、假手術(shù)組比較，△P〈0.05；與模型組比較，*P〈0.05。

組別正常組假手術(shù)組模型組假推組推拿組IL-1β表達(dá)水平0.09±0.33 9.12±0.83 30.95±0.58△20.53±0.73 18.01±0.93*

圖5 推拿對(duì)NPP大鼠血清中IL-1β表達(dá)的影響

4 討論

4.1 推拿治療疼痛的中醫(yī)機(jī)制

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疼痛有虛實(shí)之分，即所謂“不通則痛”和“不榮則痛”?！安煌▌t痛”多為“實(shí)痛”，多因外感六淫、痰濁凝滯、跌仆外傷，或食積蟲(chóng)擾等阻滯臟腑經(jīng)脈，氣血運(yùn)行不暢所致；“不榮則痛”多為“虛痛”，多因陽(yáng)氣虧虛，精血不足，臟腑經(jīng)絡(luò)失養(yǎng)所致。而推拿手法作用于經(jīng)絡(luò)腧穴，可行氣活血、疏經(jīng)通絡(luò)，從而達(dá)到治療疼痛的效果。正如《素問(wèn)·血?dú)庑沃酒吩唬骸靶螖?shù)驚恐，經(jīng)絡(luò)不通，病生于不仁，治之以按摩醪藥[13]。”另外，推拿手法通過(guò)對(duì)機(jī)體體表的溫?zé)岽碳?，產(chǎn)生熱效應(yīng)，從而加速氣血的流動(dòng)達(dá)到散寒止痛的功效，如《素問(wèn)·舉痛論》曰：“寒氣客于背俞之脈則脈泣，脈泣則血虛，血虛則痛……按之則熱氣至，熱氣至則痛止矣[14]?！苯罟顷P(guān)節(jié)受損的疾病通過(guò)推拿治療能起到理筋整復(fù)、松解粘連與滑利關(guān)節(jié)的作用，正如《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》曰：“因跌撲閃失，以至骨縫開(kāi)錯(cuò)……宜用按摩法。按其經(jīng)絡(luò)，以通郁閉之氣……其患可愈[15]?！杯h(huán)跳穴為多氣多血之經(jīng)的足少陽(yáng)膽經(jīng)與足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，主腰胯疼痛、下肢痿痹等腰腿疾患。正如《針灸甲乙經(jīng)·陰受病發(fā)痹》云：“腰脅相引痛急……脛痛不可屈伸……環(huán)跳主之”，因此，推拿環(huán)跳穴可起到祛風(fēng)化濕、疏通經(jīng)絡(luò)之效[16]。陽(yáng)陵泉為足少陽(yáng)膽經(jīng)的合穴，膽的下合穴，八會(huì)穴之筋會(huì)，是足少陽(yáng)膽經(jīng)氣血匯聚之所。據(jù)《針灸大成》記載：“陽(yáng)陵泉，主治下肢經(jīng)筋病癥之要穴[17]”，因此，推拿作用于陽(yáng)陵泉穴可以促進(jìn)局部的血液循環(huán)以及炎癥介質(zhì)的分解、稀釋，從而緩解局部的疼痛癥狀。懸鐘穴是足三陽(yáng)之大絡(luò)，為八會(huì)穴之髓會(huì)，是人體髓氣匯聚的地方，古有記載，《針灸甲乙經(jīng)》：“脛酸痛，按之不可，名曰胕髓病，以镵針針絕骨出其血立已?！笨梢?jiàn)干預(yù)懸鐘穴具有疏調(diào)肝膽氣機(jī)、通經(jīng)活絡(luò)、祛風(fēng)止痛、補(bǔ)髓壯骨之功效。因此推拿是緩解神經(jīng)病理性疼痛的一種有效措施。

4.2 NPP與miR-21-5P及ERK、STAT3蛋白的關(guān)系

MicroRNA參與多種生物調(diào)控過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡以及炎癥反應(yīng)等，而在神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型中MicroRNA的調(diào)節(jié)異常，提示MicroRNA在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。Chang等[18]通過(guò)微陣列分析評(píng)估了大鼠DRG中差異MicroRNA的表達(dá)，與假手術(shù)組相比，SNL組在神經(jīng)損傷后7d觀察到83個(gè)差異MicroRNA。有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-183在SNL大鼠模型中表達(dá)顯著下調(diào)，而過(guò)表達(dá)miR-183可通過(guò)抑制miR-183的靶基因來(lái)緩解疼痛樣行為[19]。ERK是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的關(guān)鍵組成部分，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝途徑、細(xì)胞增殖、分化和凋亡來(lái)控制某些神經(jīng)活動(dòng)，ERK還影響神經(jīng)彈性特性、神經(jīng)生長(zhǎng)以及腦損傷時(shí)的神經(jīng)和認(rèn)知過(guò)程[20]。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛的幾種動(dòng)物模型中，ERK在神經(jīng)元、微膠質(zhì)和星形細(xì)胞中被激活，且ERK的抑制劑可以在不同的時(shí)間點(diǎn)減輕疼痛[21]。因此，ERK是神經(jīng)性疼痛產(chǎn)生、痛覺(jué)信號(hào)傳遞等過(guò)程中的關(guān)鍵性因子[22]。STAT3主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道蛋白的表達(dá)，其過(guò)度活化與大鼠神經(jīng)病理性疼痛癥狀同步，抑制其活化可作為治療神經(jīng)病理性疼痛的新靶點(diǎn)[23]。與此同時(shí)，在慢性疼痛的背景下，一些報(bào)道將p-STAT3的激活與炎癥細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子聯(lián)系起來(lái)。例如在疼痛的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭衃24]，p-STAT3或STAT3激活水平的增加與DRG神經(jīng)元中通道的TNF-α上調(diào)有關(guān)。Bernal等[25]證實(shí)神經(jīng)損傷時(shí)，DRG中的STAT3被激活，且存在于非軸突化神經(jīng)元中。Dominguez等[26]在脊髓結(jié)扎的大鼠模型發(fā)現(xiàn)脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)IL-6和p-STAT3的高表達(dá)，并伴隨著機(jī)械痛敏和熱痛潛伏期的減小或縮短。IL-1β是主要由單核-巨噬細(xì)胞合成的促炎癥細(xì)胞因子，參與多種炎癥反應(yīng)的發(fā)生，IL-1β促進(jìn)炎癥的發(fā)生，從而誘導(dǎo)軸突損傷和傷害性纖維的自發(fā)活動(dòng)，導(dǎo)致非典型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到DRG，因此，在神經(jīng)損傷和炎癥刺激后，IL-1β水平升高，所以，IL-1β在神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用[27-28]。Mei等[29]發(fā)現(xiàn)IL-1β在周圍神經(jīng)損傷小鼠體內(nèi)的mRNA和蛋白水平均迅速上調(diào)，而與野生型同窩小鼠相比，缺乏IL-1β的小鼠損傷后的傷害感受敏感性降低，且在IL-1β敲除小鼠的坐骨神經(jīng)損傷部位注射微量重組IL-1β可使機(jī)械痛閾恢復(fù)到損傷野生型小鼠的水平。與此同時(shí)，有研究表明抑制miR-21-5p可逆轉(zhuǎn)PI3K/AKT和ERK通路的異常激活[30]。而抑制了ERK的表達(dá)可以降低STAT3的激活，最終抑制肝癌的增殖[31]。同時(shí)，抑制了STAT3的表達(dá)后又可以下調(diào)IL-1β的表達(dá)[32]。以上實(shí)驗(yàn)皆證實(shí)了NPP與miR-21-5P及ERK、STAT3蛋白密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)miR-21-5P、ERK、STAT3、IL-1β之間存在關(guān)聯(lián)性，而推拿可能通過(guò)影響miR-21-5P、ERK、STAT3及IL-1β的表達(dá)，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的。

5 結(jié)果分析

SNL大鼠模型是一個(gè)可靠的、可重復(fù)的誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病變的嚙齒動(dòng)物模型，因此該模型在神經(jīng)病理性疼痛的研究中被廣泛應(yīng)用。因SNL模型造模時(shí)傷口過(guò)深，為排除因手術(shù)造成的炎癥損傷及疼痛，所以設(shè)置假手術(shù)組。同理，本研究設(shè)置假推拿組的目的是為了與推拿組對(duì)比，從而驗(yàn)證經(jīng)絡(luò)腧穴及推拿手法的治療療效。本研究觀察到，SNL大鼠在造模后第3天有明顯的跛行、抬足及啃咬術(shù)后一側(cè)腳趾等疼痛行為表現(xiàn)，同時(shí)SNL大鼠的機(jī)械痛閾值和熱痛閾值均有所降低，造模后第7天推拿組SNL大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)較第3天有所好轉(zhuǎn)，機(jī)械痛閾值與熱痛閾值較第3天同樣有所提高，這說(shuō)明在推拿的干預(yù)下，SNL大鼠疼痛行為的發(fā)生下降，同時(shí)能夠提高SNL大鼠的機(jī)械痛閾值和熱痛閾值，推拿的鎮(zhèn)痛效果顯著。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)qPCR觀察到SNL大鼠損傷7天后，L4-6脊髓背角的miR-21-5P表達(dá)明顯升高，經(jīng)推拿干預(yù)后miR-21-5P的表達(dá)水平降低；通過(guò)WB觀察到造模后SNL大鼠脊髓背角中ERK、STAT3表達(dá)升高，推拿干預(yù)后ERK、STAT3的表達(dá)水平均有所降低；通過(guò)ELISA觀察到SNL大鼠造模后IL-1β表達(dá)水平上升，經(jīng)推拿干預(yù)后IL-1β的表達(dá)水平降低。這表明miR-21-5P、ERK、STAT3在SNL大鼠中被激活，然后誘導(dǎo)了炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致疼痛感。經(jīng)過(guò)7天的推拿干預(yù)后，miR-21-5P、ERK、STAT3和IL-1β的表達(dá)均顯著減少，這表明推拿可以通過(guò)降低miR-21-5P、ERK、STAT3的表達(dá)來(lái)抑制SNL大鼠的炎癥反應(yīng)，從而減輕SNL大鼠對(duì)疼痛的感知。

綜上所述，推拿可緩解神經(jīng)病理性疼痛，其機(jī)制可能與通過(guò)下調(diào)miR-21-5P、ERK、STAT3的表達(dá)，減少炎癥因子IL-1β的表達(dá)相關(guān)。本研究在一定程度上為臨床推拿治療神經(jīng)病理性疼痛提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)還未證實(shí)miR-21-5P/ERK/STAT3的上下游關(guān)系，今后將用miR-21-5P抑制劑或基因敲除等方式進(jìn)一步探究miR-21-5P與ERK、STAT3及推拿鎮(zhèn)痛的關(guān)系。