李曉芳，高 慧，朱紹光，周 鳴，劉亞平，葉喜德**

（1.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學藥學院 南昌 330004；3.江西新干縣三湖鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院 吉安 331303）

陳皮為蕓香科植物橘Citrμs reticμlataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，藥材分為“陳皮”和“廣陳皮（新會陳皮）”，而以廣陳皮為質(zhì)佳。廣陳皮為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑Citrus reticulata‘Chachi’的干燥成熟果皮，具理氣健脾、燥濕化痰功效[1]。歷代本草典籍記載其以“陳久者良”，如《藥鑒》[2]中提到“陳皮須用隔年陳”，又如《本草匯言》[3]載“又他藥貴新，惟橘皮貴陳”。然而對其陳化年限的界定，歷代本草說法不一，如1年、2年、3年或數(shù)十年等，也有“陳久”、“陳年”、“多年”等[4]。陳皮因陳化年份不同，其成分和藥理活性均有一定差別，對目前于陳皮年份的鑒別常通過感官評價法、近紅外光譜或測定其成分組成與含量來鑒別[5-7]?，F(xiàn)代研究中對于陳皮在存放過程中揮發(fā)性成分與黃酮類成分研究較多，認為陳皮在貯藏過程含量均會有所變化，但對于其具體的變化趨勢，不同學者研究結果不盡相同，結論不一[8-12]。

指紋圖譜是中藥質(zhì)量評價與控制的重要方法之一，可以較為全面地表征中藥所含化學成分，而與多元統(tǒng)計分析相結合可用于不同基原、不同產(chǎn)地、不同炮制品以及不同貯藏年限的中藥材成分差異評價。目前文獻對廣陳皮與陳皮的指紋圖譜研究雖較多[12-14]，但運用指紋圖譜并結合化學模式識別方法對不同貯藏年限廣陳皮進行研究未見相關文獻報道。且無論從本草典籍還是現(xiàn)有研究方面來看，對于陳皮陳化多久方可藥用或貯藏多久為質(zhì)佳仍未明確?；诖耍狙芯坎捎弥讣y圖譜結合多元統(tǒng)計分析，對貯藏年限1-10年的廣陳皮展開整體性研究，并以主要差異成分含量作為定量測定指標，探究不同貯藏年限對廣陳皮成分的影響。同時，依照成分含量變化差異，研究成分含量隨時間變化規(guī)律，以期為陳皮藥材的質(zhì)量控制標準提供參考，為揭示陳皮“陳久者良”科學內(nèi)涵提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 藥材與試劑

對照品橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素均購于四川省維克奇生物科技有限公 司，批 號 分 別 為wkq20030407、wkq21060106、wkq20031701、wkq20041611、wkq21052610，純度均≥98%。乙腈和磷酸為色譜純（GRACE公司），實驗用水為自制雙蒸水。

廣陳皮（編號S1-S10）購于廣東省江門市新會陳皮村市場股份有限公司，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學胡生福副教授鑒定為經(jīng)鑒定為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑（Citrus reticulata‘Chachi’）的干燥成熟果皮。10批陳皮藥材見表1、圖1。

表1 10批廣陳皮藥材產(chǎn)地與貯藏年限

圖1 10批廣陳皮藥材外觀比較

1.2 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀（配備VWD紫外檢測器，安捷倫化學色譜工作站，美國安捷倫公司）；高速中藥粉碎機（型號：YF-111B，瑞安市永歷制藥機械有限公司）；超聲波清洗器（型號KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（型號：AE240，美國Mettler-Toledo 公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Syncronis C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸（B）,梯度洗脫（0-28 min，10%-26% A；28-32 min，26%-30% A；32-34 min，30%-40% A；34-55 min，40%-55% A）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；進樣量5 μL；檢測波長330 nm。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱重，加甲醇溶解并定容，過0.22 μm微孔濾膜。再取上述單一對照品適量，甲醇稀釋并定容，制得橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素質(zhì)量濃度分別為1.020 mg·mL-1、0.020 mg·mL-1、0.412 mg·mL-1、0.218 mg·mL-1、0.018 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取廣陳皮粉末0.50 g（過3號篩），精密稱重，加入甲醇20 mL，超聲40 min后放冷稱重，甲醇補足，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，得供試品溶液。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度實驗

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項方法進行供試品溶液制備，以“2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)6次。以橙皮苷（10號峰）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間與相對峰面積[15]，得相對保留時間RSD小于0.26%，相對峰面積RSD小于2.78%，表明該儀器的精密度良好。具體見表2。

表2 精密度實驗中各共有峰相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）

2.4.2 重復性實驗

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項方法進行供試品溶液制備，平行制備6份，以“2.1”項下色譜條件進行測定。以橙皮苷（10號峰）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD小于0.45%，相對峰面積RSD小于2.77%，表明該方法的重復性較好。具體見表3。

表3 重復性實驗中各共有峰相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）

2.4.3 穩(wěn)定性實驗

取S1的同一份供試品溶液，分別于 0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h ，以“2.1”項下色譜條件進行測定，以橙皮苷（10號峰）為參照峰，計算得各共有峰相對保留時間RSD小于0.38%，相對峰面積RSD小于2.65%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。具體見表4。

表4 穩(wěn)定性實驗中各共有峰相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）

2.5 HPLC指紋圖譜建立及相似度評價

取10批廣陳皮粉末，按“2.3”項方法進行供試品溶液的制備，按“2.1”項色譜條件進樣測定。將10批陳皮色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，以S1為參照圖譜，經(jīng)多點校正與Mark峰匹配，共確定了19個共有峰，10批廣陳皮的指紋圖譜見圖2。與橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素等對照品比對，指認出共有峰中的5個色譜峰，如圖3，分別為：峰10（橙皮苷）、峰13（甜橙黃酮）、峰15（川陳皮素）、峰18（橘紅素）、峰19（5-去甲川陳皮素）。以橙皮苷（峰10）為參照峰，計算10批廣陳皮共有峰的相對保留時間、相對峰面積，見表5和表6。結果得10批次樣品相對保留時間RSD為0.14%-0.54%，相對峰面積的RSD為8.87%-52.07%。以對照圖譜為參照圖譜，對10批廣陳皮的指紋圖譜進行相似度評價，得10批樣品的相似度均大于0.990，表現(xiàn)出較強的相似性，具體見表7。分析發(fā)現(xiàn)，10批不同貯藏年限廣陳皮的圖譜相似度較高，但部分色譜峰相對峰面積RSD大，說明部分成分含量仍存在一定差異。

圖2 10批廣陳皮的HPLC指紋圖譜

圖3 供試品溶液HPLC圖譜（A）與混合對照品溶液HPLC圖譜（B）

表5 10批廣陳皮共有峰相對保留時間

表6 10批廣陳皮共有峰相對峰面積

表7 10批廣陳皮指紋圖譜相似度評價結果

2.6 多元統(tǒng)計分析

2.6.1 聚類分析（HCA）

系統(tǒng)聚類是聚類分析方法中的較為常見的一種，也稱層次聚類。將10批廣陳皮19個共有峰的峰面積導入SPSS 21版軟件中，采用離差平方和法（Ward法）聯(lián)結，歐式距離平方和為度量標準，進行系統(tǒng)聚類分析，根據(jù)樣品相似度對其分類，聚類分析樹狀圖見圖4。當距離為10時，10批廣陳皮樣品可聚為3類：S1、S3聚為一類，S4、S6聚為一類，S2、S5、S7-S10聚為一類。這說明不同貯藏年限對廣陳皮成分變化具有一定的影響，其中1年與3年廣陳皮成分變化較為接近，4年與6年廣陳皮較接近，而2年、5年，7-10年廣陳皮較接近。

圖4 10批廣陳皮聚類分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析（PCA）

進一步將10批廣陳皮19個共有峰的峰面積導入SMICA 13.0軟件中，進行主成分分析，結果見圖5。一共得到4個主成分，累計R2X=0.895，代表模型的擬合能力；Q2=0.363代表了模型的預測能力，結果表明PCA的模型擬合度較好。由圖5中可看出，不同貯藏年限廣陳皮能有效區(qū)分，說明10批廣陳皮樣品成分存在差異，其中S1、S3號樣品與聚集中心偏離程度較大，而S4、S6號樣品稍有偏離，這與聚類分析結果一致。

圖5 10批廣陳皮（S1-S10）的PCA得分圖

將峰面積導入至SPSS 21軟件中，結果提取了4個特征值大于1的主成分，4個主成分的特征值為9.459、3.590、2.740、1.265，其方差貢獻率為49.787%、18.895%、14.422%、6.565%，累積貢獻率為89.760%，表明提取出的4個主成分可代表10批廣陳皮藥材的大部分信息。峰4、峰5、峰11、峰13（甜橙黃酮）、峰14、峰15（川陳皮素）、峰16、峰18（橘紅素）、峰19（5-去甲川陳皮素）在主成分1上有較高的載荷，峰2在主成分2上有較高的載荷（載荷絕對值大于0.7），具體見表8。載荷的絕對值越大，對主成分的貢獻越大，對樣品的區(qū)分影響也越大，這表明以上成分是影響不同貯藏年限廣陳皮差異的主要成分。

表8 初始因子載荷矩陣

2.7 多成分含量測定

2.7.1 線性關系考察

精密吸取“2.2”項下的5種成分的混標溶液，加甲醇倍比稀釋為2、4、8、16、32倍，得6份不同濃度的混標溶液，按“2.1”項色譜條件測定。以濃度為橫坐標（X），待測成分的峰面積為縱坐標（Y），進行線性回歸。橙皮苷、甜橙黃酮等5種成分的線性方程、相關系數(shù)與線性范圍見表9。

表9 5種化學成分的線性方程、相關系數(shù)與線性范圍

2.7.2 精密度實驗

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項方法進行供試品溶液制備，以“2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)6次，計算得橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素及5-去甲川陳皮素的保留時間RSD分別為0.07%、0.02%、0.03%、0.03%、0.06%，峰面積RSD分別為1.50%、1.26%、1.44%、1.22%、1.57%，表明該儀器精密度良好。具體見表10。

表10 5種成分的保留時間與峰面積及RSD

2.7.3 重復性實驗

取廣陳皮粉末（S1），按“2.3”項方法進行供試品溶液制備，平行制備6份，以“2.1”項下色譜條件進行測定，計算橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素5種成分含量RSD分別為2.13%、1.88%、1.83%、1.79%、2.42%，表明該方法重復性良好。具體見表11。

表11 重復性實驗中5種成分含量及RSD

2.7.4 穩(wěn)定性實驗

取S1的同一份供試品溶液，分別于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h以“2.1”項下色譜條件測定，計算橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素峰面積的RSD分別為2.52%、1.48%、2.51%、2.10%、2.59%，表明24 h內(nèi)供試品溶液具有良好的穩(wěn)定性。具體見表12。

表12 穩(wěn)定性實驗中5種成分峰面積及RSD

2.7.5 加樣回收率實驗

取已知含量的廣陳皮（S1）粉末6份，各0.25 g，精密稱定，分別按供試品待測指標成分含量100%，精密加入一定量的混標溶液，按“2.1.3”項方法進行供試品溶液制備，按“2.1”項下的色譜條件測定，計算得橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素、5-去甲川陳皮素的加樣回收率分別為96.92%、96.18%、98.46%、99.75%、98.19%，RSD分別為2.12%、2.21%、2.95%、3.08%、2.02%。具體見表13。

表13 廣陳皮中5種成分的加樣回收率

2.7.6 樣品含量測定

取10批廣陳皮粉末（過3號篩）0.50 g，精密稱定，制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，計算橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素5種成分的含量，結果見表14，變化趨勢結果見圖6。結果顯示，10批廣陳皮中橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素和5-去甲川陳皮素的含量依次為20.940 mg·g-1-34.780 mg·g-1、0.344 mg·g-1-0.517 mg·g-1、4.667 mg·g-1-7.456 mg·g-1、3.592 mg·g-1-5.879 mg·g-1、0.391 mg·g-1-0.710 mg·g-1。這表明不同貯藏年限的廣陳皮中橙皮苷、甜橙黃酮以及川陳皮素等多種成分含量存在差異。

圖6 10批廣陳皮（S1-S10）多成分含量變化趨勢

表14 10批廣陳皮含量測定結果

3 討論

3.1 含量測定指標的選擇

廣陳皮主要成分為黃酮，具抗氧化、抗炎、抗腫瘤與保肝等藥理作用。其中橙皮苷、川陳皮素、橘皮素為2020版《中國藥典》中廣陳皮質(zhì)量評價指標成分，橙皮苷因具較強的清除氧自由基能力，表現(xiàn)出強抗氧化活性；川陳皮素能舒張支氣管具平喘作用，同時具有神經(jīng)保護作用；甜橙黃酮抗血管生成，同時可抑制人AGS胃癌細胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用；橘皮素具有很好的祛痰、理氣作用；而5-去甲川陳皮素具抗炎作用[15-16]。結合指紋圖譜與主成分分析可知，除橙皮苷外的其它4個成分是引起不同貯藏年限廣陳皮差異的成分，故本研究選擇橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素和5-去甲川陳皮素作為定量分析指標。

3.2 提取條件的優(yōu)化

比較提取溶劑與提取時間對廣陳皮中橙皮苷、甜橙黃酮與川陳皮素等黃酮類成分含量，及對指紋圖譜色譜峰數(shù)量的影響，對提取溶劑50%甲醇、70%甲醇、純甲醇與超聲提取時間20 min、30 min、40 min進行了考察。結果表明，提取溶劑為純甲醇時對陳皮成分的提取效率最好，超聲提取40 min對各成分的提取效率高于20 min、30 min，最終確定提取溶劑為純甲醇，超聲提取時間為40 min。

3.3 指紋圖譜及多元統(tǒng)計分析

中藥指紋圖譜可獲得標示中藥材共有峰的色譜圖，能較全面反映中藥材化學成分信息，具整體性、模糊性等特點。聚類分析與主成分分析是常用的多元統(tǒng)計方法。聚類分析是一種將未知類別的樣本，根據(jù)相似性大小進行聚類劃分的方法；而主成分分析是一種降維統(tǒng)計方法，依據(jù)貢獻率大小（〉85%），把多個指標轉化為少數(shù)幾個綜合指標來反映原始數(shù)據(jù)的信息。指紋圖譜結合多元統(tǒng)計分析方法，有助于對中藥材質(zhì)量進行綜合評價[17]。

本研究建立了貯藏年限1年-10年廣陳皮的HPLC特征指紋圖譜并進行相似度分析，同時結合聚類分析、主成分分析等多元統(tǒng)計方法，比較了不同貯藏年限廣陳皮成分變化差異。指紋圖譜相似度結果表明，10批廣陳皮具有較好的一致性，總體質(zhì)量保持穩(wěn)定，但部分色譜峰相對峰面積RSD大，仍存在一定差異。聚類分析將10批不同貯藏年限廣陳皮分為3類，但并未呈現(xiàn)出按貯藏年限聚類趨勢，提示貯藏年限只是廣陳皮成分與質(zhì)量變化的影響因素之一。而造成該聚類差異的主要色譜峰有甜橙黃酮、川陳皮素、橘紅素與5-去甲川陳皮素，其中部分成分未進行有效指認，故后續(xù)可通過LC-MS技術鑒定其余未知成分。

3.4 多成分含量測定

中藥在貯藏過程中自身化學成分會發(fā)生變化，且隨著貯藏時間的變化其成分含量發(fā)生相應的變化。如橙皮苷常隨貯藏時間延長而增加[18]，但研究也發(fā)現(xiàn)橙皮苷成分下降時，橘皮素成分含量卻增加[19]。但也有研究發(fā)現(xiàn)其黃酮類含量變化較小[20]，或隨貯藏年份變出現(xiàn)波動變化[21]，或部分成分含量在3-10年內(nèi)增加，15-30年下降[22]。而本研究對貯藏年限1年-10年廣陳皮中藥典指標成分橙皮苷與差異成分甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素、5-去甲川陳皮素共5種成分進行含量測定，結果發(fā)現(xiàn)各成分含量隨貯藏時間增加呈波動變化，且其變化趨勢存在一定相似性，如與1年陳皮比較，2年陳皮的5種成分含量呈升高趨勢，3年陳皮則又呈現(xiàn)出降低趨勢，而后隨時間延長各成分含量呈現(xiàn)出一定的波動增加與下降趨勢，這與部分學者的研究結果一致。

綜上所述，本實驗對不同貯藏年限廣陳皮藥材進行了指紋圖譜和多元統(tǒng)計分析研究，并建立了廣陳皮HPLC指紋圖譜與橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素等多成分HPLC含量測定方法。該法操作簡便、準確可靠、重復性好，可用于不同貯藏年限廣陳皮藥材的指紋圖譜研究和多成分含量測定。另外，指紋圖譜結合多元統(tǒng)計分析，結果表明廣陳皮隨貯藏時間的延長，其整體質(zhì)量相對穩(wěn)定，但具體成分含量存在差異。其中橙皮苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素與5-去甲川陳皮素等5種成分含量呈波動變化，而不是隨著貯藏年份增長而增加的。故陳皮在貯藏過程中，上述成分的變化與其“陳久者良”是否存在相關性尚待進一步驗證。