黃夢(mèng)芹

上海上藥中西制藥有限公司（上海 201806）

硫酸羥氯喹即（±）-2[[4-[（7-氯-4-喹啉基）氨基]苯基]-乙氨基]乙醇硫酸鹽（C18H26ClN3O·H2SO4），其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

圖1 硫酸羥氯喹的化學(xué)結(jié)構(gòu)

硫酸羥氯喹是喹酮類抗瘧藥，通常被作為抗風(fēng)濕病的獨(dú)特藥物。其由芳香環(huán)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)中氯喹的乙基被羥乙基所代替。該藥物于1944年人工合成，1950年以來，隨著抗瘧藥在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中的廣泛應(yīng)用[1]，硫酸羥氯喹被廣泛應(yīng)用于臨床治療風(fēng)濕??；學(xué)者研究表明，該藥物還可用于治療原發(fā)性干燥綜合征（PSS）、痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎、皮肌炎等[2-4]。至20世紀(jì)后期，在臨床上，用硫酸羥氯喹來治療類風(fēng)濕病已超過90%[5]。

美國(guó)藥典（USP）、我國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)及部頒標(biāo)準(zhǔn)ChP均采用薄層色譜法（TLC）來檢測(cè)硫酸羥氯喹中的相關(guān)物質(zhì)，但該方法特異性不強(qiáng)、靈敏度偏低，且只能進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)限度檢查，不能測(cè)定出雜質(zhì)含量。英國(guó)藥典（BP）雖采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定，但樣品前處理步驟比較復(fù)雜[6]。文獻(xiàn)[7]表明，通過HPLC法對(duì)硫酸羥氯喹有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)的方法學(xué)進(jìn)行質(zhì)量研究，樣品前處理步驟比較簡(jiǎn)便，方法簡(jiǎn)單快速且專屬性好，色譜條件簡(jiǎn)單。

為了進(jìn)一步控制上海上藥中西制藥有限公司硫酸羥氯喹原料的質(zhì)量，全面探究了硫酸羥氯喹有關(guān)物質(zhì)2種雜質(zhì)的測(cè)定，并使用C18柱，建立了測(cè)定硫酸羥氯喹原料中有關(guān)物質(zhì)的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，根據(jù)主成分自身對(duì)照法測(cè)定了2種已知雜質(zhì)含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

AL104電子天平、XPE105電子天平、S210 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試劑

乙酸銨、硫酸，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇，色譜純，國(guó)藥集團(tuán)沃凱試劑有限公司；乙腈，色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；四氫呋喃，色譜純，默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品

實(shí)驗(yàn)過程使用的標(biāo)準(zhǔn)品如表1所示。

表1 標(biāo)準(zhǔn)品信息

1.4 方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Extend C18柱（4.6 mm×150 mm×5μm）；以0.05 mol/L乙酸銨水溶液（用三乙胺溶液調(diào)pH=10.5）為流動(dòng)相A，以甲醇-乙腈-異丙醇（體積比為70∶20∶10）為流動(dòng)相B，梯度洗脫，洗脫程序如表2所示；柱溫箱溫度為35℃；洗脫流速為0.8 mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

表2 梯度洗脫程序

1.4.2 溶液的配制

1.4.2.1 系統(tǒng)適用性溶液制備

取硫酸羥氯喹原料以及雜質(zhì)E，雜質(zhì)F對(duì)照品適量，配制成1 mL中含硫酸羥氯喹0.5 mg，雜質(zhì)E及雜質(zhì)F各0.5μg的混合溶液，作為分離度溶液。

1.4.2.2 硫酸羥氯喹一級(jí)貯備液制備

精密稱定硫酸羥氯喹標(biāo)準(zhǔn)品25 mg置于50 mL容量瓶中，加稀釋劑適量使其溶解，再定容，混勻。

1.4.2.3 靈敏度溶液制備

精密量取硫酸羥氯喹一級(jí)貯備液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，混勻；再精密量取上述溶液1.0 mL置于250 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋定容，搖勻。

1.4.2.4 雜質(zhì)對(duì)照品溶液的制備

分別稱取約10 mg的雜質(zhì)E，雜質(zhì)F置于100 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解稀釋至100 mL，作為各雜質(zhì)貯備液1。移取雜質(zhì)E，F(xiàn)貯備液1各10 mL，置于100 mL容量瓶中，加稀釋液稀釋至刻度，混勻，作為準(zhǔn)確度雜質(zhì)對(duì)照品溶液。

1.4.2.5 硫酸羥氯喹供試品母液制備

稱取硫酸羥氯喹供試品1.0 g置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，混勻。

1.4.2.6 供試品溶液制備

移取硫酸羥氯喹供試品母液5 mL置于100 mL容量瓶中，分別加入適量的準(zhǔn)確度雜質(zhì)對(duì)照品溶液，稀釋至刻度，混勻，作為供試液。

1.4.2.7 對(duì)照溶液制備

精密量取供試品溶液5.0 mL置于50 mL容量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度；移取該溶液1.0 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋溶液稀釋至刻度。

1.4.2.8 測(cè)定方法

精密量取系統(tǒng)適用性溶液、靈敏度溶液、空白溶液、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F貯備液10μL，注入液相色譜儀，系統(tǒng)適用性溶液中各組分的分離度不得小于1.5，靈敏度溶液峰信噪比不小于3；精密量取供試液及其稀釋的對(duì)照溶液10μL，記錄色譜圖，用自身對(duì)照法來計(jì)算供試液中雜質(zhì)E，雜質(zhì)F的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取系統(tǒng)適用性溶液10μL，注入高效液相色譜儀，結(jié)果如表3所示。在有關(guān)物質(zhì)色譜條件下，理論塔板數(shù)按硫酸羥氯喹計(jì)為40131，各峰之間分離度均大于1.5，說明該法色譜條件分離效果好。

表3 有關(guān)物質(zhì)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 檢測(cè)限（LOD）和定量限（LOQ）試驗(yàn)

精密量取5.0 mL雜質(zhì)E，雜質(zhì)F雜質(zhì)對(duì)照品溶液，置于50 mL量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，作為各線性混合液的雜質(zhì)貯備液。再用稀釋劑稀釋成不同質(zhì)量濃度的溶液，精密量取10μL，以信噪比（S/N）大于10為定量限；取定量限溶液稀釋3倍（3→10），作為檢測(cè)限。

在該色譜條件下，雜質(zhì)E，雜質(zhì)F和硫酸羥氯喹的定量限分別為0.0546，0.050 6和0.0509 mg/L；雜質(zhì)E，雜質(zhì)F檢測(cè)限分別為0.018 2和0.016 9 mg/L。各雜質(zhì)的檢測(cè)限均在供試品質(zhì)量濃度的0.01%以下，說明該色譜法靈敏度較高。

2.3 專屬性試驗(yàn)

精密量取空白溶液10μL，注入液相色譜儀，空白稀釋劑溶液色譜圖在硫酸羥氯喹、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F保留時(shí)間處無干擾峰。

2.4 線性試驗(yàn)

精密稱取硫酸羥氯喹、雜質(zhì)E和雜質(zhì)F對(duì)照品適量，分別用水-甲醇-10%硫酸（體積比為125∶125∶1）溶液稀釋制成不同質(zhì)量濃度的溶液，在有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)的色譜條件下，精密量取10μL，注入高效液相色譜儀，按照上述步驟進(jìn)行線性回歸計(jì)算，結(jié)果如表4所示。

表4 硫酸羥氯喹及各雜質(zhì)線性試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，雜質(zhì)E在0.053 5～1.070 9 mg/L（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.01%～0.20%）內(nèi)，線性關(guān)系良好；硫酸羥氯喹在0.051 6～1.032 8 mg/L（相當(dāng)于供試品質(zhì)量濃度的0.01%～0.20%）內(nèi)，線性關(guān)系良好；雜質(zhì)E在0.051 8～1.036 6 mg/L（相當(dāng)于供試品溶液質(zhì)量濃度的0.01%～0.20%）內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.5 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

移取硫酸羥氯喹供試品母液5.0 mL置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為空白溶液。移取雜質(zhì)E，F(xiàn)貯備液1各10 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀釋液稀釋至刻度，混勻，作為準(zhǔn)確度雜質(zhì)對(duì)照品溶液。移取硫酸羥氯喹供試品母液5 mL置于100 mL容量瓶中，分別加入適量準(zhǔn)確度雜質(zhì)對(duì)照品溶液，各制成每1 mL分別含雜質(zhì)0.25，0.5和0.6μg的混合溶液。每個(gè)質(zhì)量濃度平行配制3份供試液，進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)，結(jié)果表明：雜質(zhì)E的平均回收率為102.04%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.0%；雜質(zhì)F的平均回收率為94.98%，RSD為4.5%。該方法測(cè)得的硫酸羥氯喹雜質(zhì)E和雜質(zhì)F中，9份樣品平均回收率均在94.63%～105.10%間，RSD均符合限度，證實(shí)該方法的準(zhǔn)確度較高，也證明了其精確性和可靠性。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 重復(fù)性試驗(yàn)

供試品溶液制備同1 mL含雜質(zhì)0.5μg的準(zhǔn)確度溶液制備，平行配制6份供試液，檢測(cè)有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果表明，在6份供試液中：雜質(zhì)E含量的RSD為1.8%，均值為0.10%；雜質(zhì)F含量的RSD為2.2%，均值為0.10%；相對(duì)保留時(shí)間（RRT）為0.44的雜質(zhì)含量的RSD為1.6%，均值為0.06%；RRT為0.50的雜質(zhì)含量的RSD為2.8%，均值為0.03%；RRT為0.67的雜質(zhì)含量的RSD為7.2%，均值為0.01%；RRT為1.24的雜質(zhì)含量的RSD為1.8%，均值為0.03%；RRT為0.20的雜質(zhì)含量的RSD為9.0%，均值為0.01%。在6份供試品溶液中，總雜質(zhì)含量RSD為2.2%，絕對(duì)差值為0.02%，表明該方法重復(fù)性好。

2.6.2 中間精密度

由不同檢驗(yàn)員在不同日期使用不同儀器（更換色譜柱批號(hào)），按重復(fù)性步驟進(jìn)行操作。12份供試液中：雜質(zhì)E含量的RSD為7.6%，均值為0.11%；雜質(zhì)F含量的RSD為7.0%，均值為0.10%。12份供試品溶液總雜質(zhì)含量的絕對(duì)差值為0.05%，總雜含量的RSD為3.1%，表明該方法的精密度較好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

供試品溶液制備同1 mL含雜質(zhì)0.5μg的準(zhǔn)確度溶液制備。取一份系統(tǒng)適用性溶液，一份供試液，在室溫下保存，分別于0，5，10，28，40，48，56及64 h取樣，取上述2種溶液各進(jìn)樣1針，考察供試液穩(wěn)定性。結(jié)果表明，供試液在室溫條件放置64 h之內(nèi)，各時(shí)間段雜質(zhì)含量與剛配制好（0 h）時(shí)含量的絕對(duì)差值范圍為0～0.01%，總雜質(zhì)含量的絕對(duì)差值均為0.02%。由此可知，供試品溶液在64 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 耐用性試驗(yàn)

供試品溶液制備同1 mL含雜質(zhì)0.5μg的準(zhǔn)確度溶液制備。改變流速、柱溫以及流動(dòng)相pH，進(jìn)行耐用性挑戰(zhàn)試驗(yàn)（不同序列號(hào)色譜柱在中間精密度中考察，接受標(biāo)準(zhǔn)為中間精密度標(biāo)準(zhǔn)），結(jié)果如表5所示。由表5可知，進(jìn)樣流速、柱溫、流動(dòng)相pH及色譜柱批號(hào)等在一定范圍內(nèi)變動(dòng)均不影響主成分的測(cè)定，證實(shí)該方法的耐用性好。

表5 耐用試驗(yàn)性挑戰(zhàn)試驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果

3 結(jié)語

以0.05 mol/L乙酸銨溶液-（乙腈-甲醇-異丙醇）作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用C18柱或效能相當(dāng)?shù)纳V柱，建立了RP-HPLC法對(duì)硫酸羥氯喹原料有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法。該分析方法靈敏度較高、精密度好、耐用性良好，且簡(jiǎn)便快速、精密穩(wěn)定，專屬性好，適用于硫酸羥氯喹原料有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。