覃秋杏，韓小雨，黃衛(wèi)東，戰(zhàn)吉宬，游義琳,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京市葡萄科學(xué)與釀酒技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)（興化）健康食品產(chǎn)業(yè)研究院，江蘇 興化 225700）

釀造過程中，為了控制不同批次酒的質(zhì)量穩(wěn)定，多使用單一菌種發(fā)酵劑來進(jìn)行發(fā)酵，目前較為常用的酵母為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。釀酒酵母的發(fā)酵能力極強(qiáng)，但這也導(dǎo)致發(fā)酵過程中酵母多樣性下降，酵母產(chǎn)生的生化反應(yīng)復(fù)雜程度降低，在一定程度上掩蓋了不同發(fā)酵原料之間品種和地域的差異，造成發(fā)酵酒的香氣和口感復(fù)雜度下降，帶來了酒同質(zhì)化嚴(yán)重、風(fēng)味趨近的問題[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，隨著技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，消費(fèi)者已不再滿足于傳統(tǒng)發(fā)酵酒的單一風(fēng)味，對(duì)發(fā)酵酒風(fēng)味的多樣性提出了更高的要求。消費(fèi)者對(duì)于酒類多樣化的需求和單一菌株發(fā)酵帶來弊端之間的矛盾催生了關(guān)于非釀酒酵母（non-Saccharomyces cerevisiae）的研究。非釀酒酵母是發(fā)酵酒釀造中的非常規(guī)酵母（unconventional yeast），其發(fā)酵性能和逆境耐受能力都弱于釀酒酵母，但非釀酒酵母在發(fā)酵過程中可以分泌大量胞外酶，改善發(fā)酵酒的酒體、口感、色澤和泡沫等性質(zhì)，其中非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BGL）（EC3.2.1.21）通過對(duì)糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的水解作用可以提高發(fā)酵酒的香氣復(fù)雜性。本文對(duì)發(fā)酵酒中影響β-葡萄糖苷酶活力的因素以及β-葡萄糖苷酶在不同發(fā)酵體系中的作用進(jìn)行綜述，為發(fā)酵酒釀造、高β-葡萄糖苷酶活力酵母篩選和相關(guān)酵母基因編輯等研究提供參考。

1 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶是一類纖維素類水解酶，通過催化水解糖苷結(jié)合態(tài)物質(zhì)中的糖苷鍵釋放香氣物質(zhì)[2]。

1.1 β-葡萄糖苷酶來源

β-葡萄糖苷酶來源十分廣泛[3]，其編碼基因BGL幾乎存在于所有生物中[4]。食品中的β-葡萄糖苷酶主要來自于植物和微生物，植物源的β-葡萄糖苷酶主要位于漿果果皮中，與釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶一樣，在酒類發(fā)酵條件下（酸性（pH值3～4）、高糖含量以及一定濃度的乙醇）對(duì)于風(fēng)味改善幾乎沒有作用[2,5-6]。因此目前研究的熱點(diǎn)在于微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶，商業(yè)使用的β-葡萄糖苷酶大多來自黑曲霉（Aspergillus niger）和哈茨木霉（Trichoderma harzianum），外源添加β-葡萄糖苷酶可以提高果汁的產(chǎn)量，改善成品酒的色澤、澄清度和品種香氣[7-8]。真菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶也存在一定的不足，如外源酶制劑的純度無法達(dá)到100%，因而可能引發(fā)安全性問題[9]，β-葡萄糖苷酶對(duì)色素糖苷的水解作用可能會(huì)導(dǎo)致?lián)]發(fā)性酚類物質(zhì)的產(chǎn)生，使食品產(chǎn)生不良風(fēng)味等[7,10]?；谝陨系牟蛔?，研究者開始將目光轉(zhuǎn)向其他來源的β-葡萄糖苷酶，研究發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的活力較高，與霉菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶相比安全性高、獲取方式簡(jiǎn)單且成本較低，因此非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶或許更適合用于發(fā)酵酒中[11]。

1.2 β-葡萄糖苷酶的作用機(jī)制

得益于其催化糖苷鍵的能力，β-葡萄糖苷酶在揮發(fā)性香氣物質(zhì)的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用。香氣化合物在發(fā)酵酒中的存在方式有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)，游離態(tài)的物質(zhì)可以直接揮發(fā)產(chǎn)生香氣，而結(jié)合態(tài)的物質(zhì)需水解為游離態(tài)物質(zhì)后才能釋放出香氣物質(zhì)[12-13]。糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)由苷元和糖基組成，其中苷元是風(fēng)味活性物質(zhì)，水解后可增加發(fā)酵酒中植物、水果型香氣[14]，在酒類原料中的風(fēng)味活性苷元包括中鏈烷醇和烯醇、莽草酸衍生物、苯衍生物、C13-降異戊二烯、單萜烯和倍半萜醇等[14-15]。

糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的水解方式包括酸水解和酶水解。在葡萄汁中，糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)可以自發(fā)進(jìn)行酸水解，釋放苷元[16-17]，使得香氣物質(zhì)游離；而酶水解過程則需要酶類的參與（圖1），首先糖苷外切酶α-鼠李糖苷酶、α-阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶或β-洋芹糖苷酶等作用于糖苷基末端的糖苷鍵，釋放β-葡萄糖苷，隨后β-葡萄糖苷酶作用于β-葡萄糖苷，釋放苷元和葡萄糖，游離態(tài)的苷元達(dá)到感官閾值后即可對(duì)酒的香氣做出貢獻(xiàn)[16,18-19]。在糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的水解過程中，糖苷外切酶和β-葡萄糖苷酶具有協(xié)同作用，其中β-葡萄糖苷酶是關(guān)鍵的限速酶[20-21]，發(fā)酵過程中該酶的含量與活力影響著發(fā)酵所得成品酒的風(fēng)味復(fù)雜度。

圖1 β-葡萄糖苷酶作用機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the action mechanism of β-glucosidase

不同的水解方式對(duì)酒的影響不同，酸水解導(dǎo)致苷元發(fā)生重新排列，反應(yīng)速度慢，可能會(huì)產(chǎn)生不良風(fēng)味[15,17]；而酶水解所需的β-葡萄糖苷酶多來自原料及酵母，獲取方式簡(jiǎn)單且酶水解反應(yīng)速度快，并且非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活力是所有酵母中最高的，可以在釀酒酵母無法產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶或酶活力不足的情況下進(jìn)行補(bǔ)充，從而提高發(fā)酵酒香氣的復(fù)雜度[22]。

2 β-葡萄糖苷酶活力的影響因素

與其他種類的酶一樣，β-葡萄糖苷酶活力也受到多種因素的影響，酵母合成和釋放β-葡萄糖苷酶的能力、發(fā)酵環(huán)境中的溫度、酸堿度和可發(fā)酵糖濃度都會(huì)對(duì)其酶活力產(chǎn)生影響[23]。

2.1 酵母合成和釋放β-葡萄糖苷酶的能力對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

大部分非釀酒酵母都可以合成和釋放β-葡萄糖苷酶，然而非釀酒酵母具有非常強(qiáng)的菌株特異性，導(dǎo)致菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活力存在著種間差異和種內(nèi)差異，不同酵母細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶的存在位置和聚合方式也有所不同。王佳等[24]發(fā)現(xiàn)不同的非釀酒酵母產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的能力不同，其中陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）和季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。對(duì)非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行酶活定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶在酵母細(xì)胞中有細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞壁中3 種存在方式。在對(duì)123 株季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）中β-葡萄糖苷酶活力進(jìn)行測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外β-葡萄糖苷酶活力最高，73%的菌株酶活力在80～120 pNP nmol/（mL·h）（pNP表示4-硝基苯酚），而在70 株葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）中，細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞壁中的β-葡萄糖苷酶活力為30～40 pNP nmol/（mL·h）的菌株所占比例分別為37%、30%和29%，無論是同一菌屬或是不同菌屬，酶活定位的不同導(dǎo)致酶活力存在差異[13]。李愛華等[25]發(fā)現(xiàn)葡萄汁有孢漢遜酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶為胞外酶，超聲破碎后細(xì)胞上清液中的β-葡萄糖苷酶活力遠(yuǎn)高于其他樣品，但也有研究發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活力高于胞壁結(jié)合酶活力，因此細(xì)胞中酶活定位的不同會(huì)帶來酶活力的不同，但是無法根據(jù)酶活定位來確定酶活力高低[26]。酵母細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶有多種聚合方式，包括單聚體、二聚體、三聚體和四聚體[27]，已有研究發(fā)現(xiàn)在不同菌屬的細(xì)胞或同一菌屬不同菌株的細(xì)胞中，都會(huì)存在β-葡萄糖苷酶聚合方式的差異，β-葡萄糖苷酶活力也存在不同[28-29]。酵母合成和釋放β-葡萄糖苷酶的能力不同導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶的活力不同再次驗(yàn)證了菌株特異性對(duì)于非釀酒酵母在啤酒中應(yīng)用效果的影響，也提示著發(fā)酵前菌株篩選的必要性。

釀造過程中釀酒酵母和非釀酒酵母之間會(huì)產(chǎn)生相互作用，導(dǎo)致菌株β-葡萄糖苷酶活力發(fā)生改變[30]。非釀酒酵母的發(fā)酵能力較弱，為了獲得較高的發(fā)酵度，通常會(huì)在接種非釀酒酵母的發(fā)酵液中同時(shí)或順序接種釀酒酵母[31]。在美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）和釀酒酵母共發(fā)酵葡萄酒的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)無論是混合接種還是順序接種，共發(fā)酵組中的β-葡萄糖苷酶水解產(chǎn)生的橙花醇和香葉醇的含量都會(huì)顯著低于美極梅奇酵母單菌發(fā)酵組[32]，徐建坤[33]也得到了類似結(jié)果，雖然混合發(fā)酵組酶活力均高于釀酒酵母單菌發(fā)酵組，但混合接種時(shí)發(fā)酵液中最高β-葡萄糖苷酶活力遠(yuǎn)低于非釀酒酵母在最適條件下的酶活力，釀酒酵母與非釀酒酵母共發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的相互作用會(huì)影響β-葡萄糖苷酶的活力。

2.2 發(fā)酵環(huán)境對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響

β-葡萄糖苷酶對(duì)環(huán)境的變化十分敏感，且不同的環(huán)境對(duì)酶活力的影響不同。

酒類的發(fā)酵溫度通常低于25 ℃，而β-葡萄糖糖苷酶的最適溫度為40～50 ℃，遠(yuǎn)高于發(fā)酵溫度，導(dǎo)致β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵溫度時(shí)的活力低于最適溫度時(shí)的活力[34]。β-葡萄糖苷酶對(duì)高溫和低溫的耐受性也并不一致，其對(duì)于高溫的耐受能力弱于低溫。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)4 株野生非釀酒酵母的最適溫度為50 ℃，溫度升高到70 ℃時(shí)β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活力降低為44%，而當(dāng)溫度降低為10 ℃時(shí)相對(duì)酶活力大于54%，結(jié)果顯示β-葡萄糖苷酶對(duì)低溫的耐受性更好[16]。β-葡萄糖苷酶較好的低溫耐受力可以使其在酒類的發(fā)酵溫度下維持較高的活力，獲得較好的發(fā)酵效果。

環(huán)境酸堿度的改變通過影響β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)從而改變其酶活力。酸堿度改變時(shí)，酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。β-葡萄糖苷酶的最適pH值為5.0～6.0，在最適pH值條件下，β-葡萄糖苷酶α-螺旋和β-折疊相對(duì)含量最高，無規(guī)卷曲相對(duì)含量最低（BGL1：26.7%，BGL2：23.8%，AS：24.2%），pH值降低，α-螺旋和β-折疊的相對(duì)含量減少，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對(duì)含量增加，酶活力降低[35]。對(duì)巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）Y8產(chǎn)生的多種酶的pH值耐受性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在pH 5.0時(shí)β-葡萄糖苷酶活力最高，而當(dāng)pH值為2.0時(shí)，酶活力會(huì)降低至pH 5.0時(shí)的19%，并且β-葡萄糖苷酶對(duì)于酸性環(huán)境的敏感性遠(yuǎn)高于其他酶類[2]。在常見的發(fā)酵酒體系中，常規(guī)啤酒的pH值在4.0～5.0之間[36-37]（酸啤酒由于含有乳酸，pH值可降至3.3[38]），葡萄汁和果汁由于含有較多的果酸，pH值一般為2.0～4.0[39-40]，β-葡萄糖苷酶的高酸敏感性可能會(huì)導(dǎo)致其在一些pH值較低的果酒（如葡萄酒）中的作用效果較差。

發(fā)酵液中還含有大量的可發(fā)酵糖（葡萄糖、果糖和蔗糖等），其中葡萄糖對(duì)于β-葡萄糖苷酶活力有較大的影響[41]。Lopez等[18]對(duì)4 種非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的糖耐受能力進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)菌株的β-葡萄糖苷酶活力隨著葡萄糖濃度升高而逐漸下降，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到200 mmol/L后活力僅為未添加葡萄糖時(shí)的20%，而果糖和蔗糖對(duì)酶活力幾乎沒有影響。葡萄糖是非釀酒酵母酒精發(fā)酵過程中不可缺少的重要糖類，但其對(duì)于β-葡萄糖苷酶活力的影響可能會(huì)導(dǎo)致成品酒的風(fēng)味物質(zhì)含量發(fā)生改變。

乙醇是酵母酒精發(fā)酵的產(chǎn)物，發(fā)酵過程中可發(fā)酵糖的消耗可以緩解糖類對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的抑制作用，但乙醇含量的增加會(huì)抑制酶活力，并且乙醇對(duì)β-葡萄糖苷酶的抑制作用隨乙醇濃度的增大而增強(qiáng)。果酒和啤酒的酒精度較低，乙醇體積分?jǐn)?shù)一般為2%～5%，此條件下對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的抑制作用較弱[42-43]，而葡萄酒的乙醇體積分?jǐn)?shù)一般大于12%，在此條件下β-葡萄糖苷酶的活力受到強(qiáng)烈抑制[11,44]。乙醇對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的抑制作用隨濃度增加而增強(qiáng)的情況或許提示高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母對(duì)于低酒精度酒的增香更為有效。

β-葡萄糖苷酶活力的影響因素眾多，除上述因素外，發(fā)酵時(shí)間[17]、金屬離子[16]等也會(huì)導(dǎo)致酶活力發(fā)生改變，因此在篩選酵母或?qū)湍高M(jìn)行改造時(shí)，除了對(duì)出發(fā)菌株自身特性進(jìn)行考察，還需要考慮所得實(shí)驗(yàn)菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對(duì)發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)能力。表1對(duì)部分非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)進(jìn)行了總結(jié)。

表1 部分非釀酒酵母來源的β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)Table 1 Properties of β-glucosidases from non-Saccharomyces yeasts

3 β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵酒中的應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于非釀酒酵母中，其在假絲酵母屬（Candidasp.）、耐熱克魯維酵母（Lachancea thermotolerans）、畢赤氏酵母（Pichiasp.）、有孢漢遜酵母（Hanseniasporasp.）、梅氏酵母（Metschnikowia zizyphicola）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）和酒香酵母（Brettanomycessp.）等菌屬的某些菌株中具有較高的活力[45,51-53]，可用于發(fā)酵酒以提高香氣復(fù)雜度，并對(duì)酒體的顏色穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。

3.1 β-葡萄糖苷酶在葡萄酒中的應(yīng)用

β-葡萄糖苷酶在葡萄酒中的作用不僅包括水解糖苷鍵增加香氣復(fù)雜度，部分非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對(duì)花色苷的水解作用也會(huì)對(duì)葡萄酒的顏色產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母可以將葡萄果實(shí)中的糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)如單萜烯、C13-降異戊二烯和芳香族化合物等釋放出來。在本課題組前期研究中，將葡萄汁有孢漢遜酵母H30（Hanseniaspora uvarumH30）和光滑假絲酵母D18（Candida glabrataD18）與釀酒酵母順序接種于葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)這兩株非釀酒酵母都可以增加成品酒中的萜烯類物質(zhì)和C13-降戊二烯類物質(zhì)的含量，并且光滑假絲酵母D18可以使發(fā)酵酒中品種香種類增多[16]。高β-葡萄糖苷酶活力的季也蒙有孢漢遜酵母（Hanseniaspora guilliermondii）BF1被用于無味菲亞諾葡萄（Fiano）的發(fā)酵中，無論是BF1單菌發(fā)酵還是與釀酒酵母混菌發(fā)酵，成品酒中芳樟醇和松油烯-4-醇的含量均較高，感官評(píng)價(jià)顯示兩款酒中水果味和玫瑰花香最為突出[13]。β-葡萄糖苷酶還與葡萄酒中萜烯類物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān)，王興凱[17]發(fā)現(xiàn)葡萄模擬汁中萜烯類物質(zhì)（主要是芳樟醇、香茅醇和香葉醇）的變化與β-葡萄糖苷酶活力的變化趨勢(shì)一致，而從陸生伊薩酵母菌（Issatchenkia terricola）中分離得到的β-葡萄糖苷酶用于葡萄酒釀造時(shí)，則可以使葡萄酒中酚類物質(zhì)含量增加83%，降異戊二烯化合物含量增加65%[46]。多種高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母已被證明可以用于葡萄酒的發(fā)酵，且在增加香氣物質(zhì)特別是萜烯類物質(zhì)和C13-降戊二烯類物質(zhì)等含量方面有重要作用。

除了香氣特征外，顏色也是葡萄酒重要的屬性之一，花青素是葡萄酒中重要的色素化合物，大部分的花青素是單葡萄糖苷，部分β-葡萄糖苷酶可使糖苷鍵斷裂，游離的花青素迅速降解成無色化合物，導(dǎo)致葡萄酒色澤不佳甚至失色[54-56]。不同菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對(duì)花色苷的作用不同，研究者將阿薩絲孢酵母（Trichosporon asahii）所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶加入至蛇龍珠葡萄汁中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶對(duì)花色苷特別是飛燕草素葡萄糖苷具有較強(qiáng)的降解作用[35]，而在Vernocchi等[57]的研究中，將含有高β-葡萄糖苷酶活力的釀酒酵母BV12和BV14接種于桑嬌維塞（Sangiovese）葡萄汁時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)這兩株酵母對(duì)葡萄酒顏色的不良影響。β-葡萄糖苷酶對(duì)于花色苷的分解作用的差異可能與底物的結(jié)構(gòu)特征和β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)有關(guān)，β-葡萄糖苷酶對(duì)花色苷的分解作用也可以作為一種改變葡萄酒顏色的方法加以利用[58]。

3.2 β-葡萄糖苷酶在啤酒中的應(yīng)用

啤酒中的糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)主要來自啤酒花，酒花中含有的糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)包括脂肪醇、萜烯醇和C13-降異戊二烯類化合物等[14,59]，這些物質(zhì)在發(fā)酵過程中被水解釋放，從而改善啤酒的香氣復(fù)雜性[60]。其中，萜烯類糖苷物質(zhì)的香氣閾值較低，水解時(shí)產(chǎn)生的萜烯類物質(zhì)（如月桂烯、香葉醇、佛手柑醇和芳樟醇等）具有濃郁的花香和水果香氣[61]，單萜烯還可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為β-香茅醇或α-萜烯醇，增強(qiáng)花香味和檸檬味[62]。C13-降異戊二烯包括β-大馬士酮和β-紫羅蘭酮等，是β-葡萄糖苷酶水解產(chǎn)生的重要風(fēng)味物質(zhì)，可以產(chǎn)生令人愉悅的香氣[63]。

目前在啤酒發(fā)酵體系中利用非釀酒酵母產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)進(jìn)行增香的研究較少，以酒香酵母的研究最為透徹。酒香酵母因其可以產(chǎn)生大量的酚類物質(zhì)從而導(dǎo)致異味，在過去通常被認(rèn)為是導(dǎo)致腐敗的酵母[64]，但隨著對(duì)酒香酵母研究的不斷深入，酒香酵母可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的特性逐漸被開發(fā)，并且發(fā)現(xiàn)部分菌株在發(fā)酵過程中并未產(chǎn)生不良風(fēng)味，這也加速了酒香酵母在啤酒中的應(yīng)用研究[65-66]。布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）和異酒香酵母（Brettanomyces anomalus）是啤酒發(fā)酵中較為常見的兩類酒香酵母，常用于貴茲啤酒和蘭比克啤酒的發(fā)酵中。酒香酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶可以作用于酒花和麥芽，當(dāng)酒香酵母作用于酒花時(shí)，可以水解釋放出酒花中含有的苷元，如芳樟醇、水楊酸甲酯、順-3-己烯-1-醇和1-辛烯-3-醇等，且水解所得苷元物質(zhì)的質(zhì)量濃度大于0.005 mg/L[48]。當(dāng)酒香酵母作用于麥芽時(shí)，可以使得麥芽中的糖苷鍵斷裂，使麥芽中的萜烯類物質(zhì)游離出來[49]。酒香酵母能否產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶與其是否含有BGL1和BGL2基因有關(guān)，同時(shí)含有這兩個(gè)基因，或者僅含BGL2基因的酒香酵母具有較高的胞外β-葡萄糖苷酶活力，并且在發(fā)酵過程中酶活力高于僅含BGL1或不含BGL1和BGL2基因的酵母[67]。部分釀酒酵母中編碼外切葡聚糖酶的EXG基因也被證實(shí)具有非特異作用于葡萄糖聚合物和較小的糖基結(jié)合底物的活力[68]，高EXG活力的酵母菌株在發(fā)酵過程中對(duì)酒花糖苷也有一定的分解能力，但不同菌株之間的活力相差較大[69]，且其對(duì)于酒花糖苷的分解能力遠(yuǎn)低于非釀酒酵母[48]，基因組成決定了釀酒酵母和非釀酒酵母是否具有產(chǎn)生高活力β-葡萄糖苷酶的能力。酒香酵母目前多用于特種啤酒的發(fā)酵，但隨著對(duì)其基因組學(xué)和代謝組學(xué)研究的不斷深入，其在啤酒發(fā)酵中的應(yīng)用也會(huì)大大擴(kuò)寬。

耐熱克魯維酵母具有較高β-葡萄糖苷酶活力的特性也被應(yīng)用于啤酒發(fā)酵中，可以促進(jìn)酒花中糖苷前體物質(zhì)的釋放[70-71]，耐熱克魯維酵母還是一種潛在的啤酒發(fā)酵劑，在啤酒發(fā)酵中可產(chǎn)生乳酸降低pH值[72]，與酸啤酒發(fā)酵常用的乳酸菌相比，耐熱克魯維酵母耐受異α-酸的能力更高，更適合用于酸啤酒的發(fā)酵。耐熱克魯維酵母在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生甘油，對(duì)于改善酒體和口感有重要作用[71]。耐熱克魯維酵母在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶、發(fā)酵能力、產(chǎn)乳酸、產(chǎn)甘油等方面優(yōu)于其他非釀酒酵母，因此其在啤酒中的應(yīng)用前景也更廣闊。

高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母種類眾多，并且大部分都在葡萄酒增香中有較好表現(xiàn)，但其在啤酒體系中的研究較少，布雷特酵母和耐熱克魯維酵母在啤酒增香中的作用表明高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母對(duì)于啤酒風(fēng)味具有改善作用，這也側(cè)面說明其他高β-葡萄糖苷酶活力的酵母在啤酒發(fā)酵中也具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 β-葡萄糖苷酶在其他發(fā)酵酒中的作用

β-葡萄糖苷酶在發(fā)酵酒中的應(yīng)用并不局限于葡萄酒和啤酒，在一些果酒如蘋果酒[50]、毛桃果酒[73]等發(fā)酵體系中也有相關(guān)的研究，β-葡萄糖苷酶在這些酒中的作用不僅包括增香，還可以改善酒的品質(zhì)。在蘋果汁中單獨(dú)或混合接種戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）與釀酒酵母，發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵時(shí)酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶和果膠酶的活力均高于單菌發(fā)酵時(shí)的活力，并且酶活力越高對(duì)蘋果酒香氣的改善效果越好[50]。在毛桃果酒釀造過程中由于果實(shí)顏色不一，產(chǎn)品會(huì)發(fā)生變色和渾濁，在發(fā)酵過程中加入β-葡萄糖苷酶后，花色素苷發(fā)生水解，毛桃果酒顏色穩(wěn)定性提高[73]。在果酒發(fā)酵中使用非釀酒酵母，可以篩選和馴化適用于果酒的非釀酒酵母，隨著研究的深入，非釀酒酵母的性能開發(fā)也將更為多樣。

3.4 不同發(fā)酵體系對(duì)非釀酒酵母要求的比較

β-葡萄糖苷酶對(duì)于香氣的改善作用在葡萄酒、啤酒、蘋果酒等體系中都得到了驗(yàn)證，并且不同菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活力不同，不同的發(fā)酵汁對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響也不同。葡萄酒等果酒發(fā)酵汁中，含有較多的酸性物質(zhì)，pH值較低，并且葡萄酒的酒精度通常較高，因此篩選用于果酒發(fā)酵的非釀酒酵母時(shí)，需要對(duì)其酒精耐受力和耐酸能力進(jìn)行測(cè)試。啤酒發(fā)酵汁與以上酒類的不同之處在于其在發(fā)酵過程中加入了啤酒花，啤酒花在煮沸過程會(huì)產(chǎn)生異α-酸，異α-酸在酸性環(huán)境中可以抑制酵母的生長(zhǎng)[74]，導(dǎo)致非釀酒酵母的延滯期延長(zhǎng)[75]，因此用于啤酒增香發(fā)酵的非釀酒酵母除了高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶外還需要具有一定的耐受異α-酸等的能力。不同發(fā)酵體系中酵母的適應(yīng)性不同，因此在發(fā)酵液中接種非釀酒酵母時(shí)需先根據(jù)發(fā)酵體系中對(duì)菌株進(jìn)行篩選。

3.5 獲取具有β-葡萄糖苷酶活力菌株的方法

目前獲得高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母的方法有很多種，包括直接篩選、誘變育種和基因工程等（表2）。直接篩選法指從含有β-葡萄糖苷酶的基質(zhì)中，通過一定的方法篩選出可以產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶的酵母，牟含[76]通過七葉苷顯色法從白酒酒窖中篩選得到了多株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母，并將所得非釀酒酵母用于葡萄酒增香釀造中。產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株來源十分廣泛，除了酒類發(fā)酵醪，各種細(xì)菌和真菌[77]以及茶樹類植物[78]也是其重要來源，因此通過直接篩選法獲得高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株是一個(gè)極其普適的方法。誘變育種指利用物理或化學(xué)的方法使酵母的遺傳物質(zhì)和性能發(fā)生改變的一種方法，研究人員通過常壓室溫等離子體與紫外復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)兩株釀酒酵母進(jìn)復(fù)合誘變，所得菌株產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶活力遠(yuǎn)高于出發(fā)菌株[79]。誘變育種方法具有快速、突變率高等特點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)形成大量突變，因此也是獲得高β-葡萄糖苷酶活力菌株的較好方式[80]?；蚬こ碳夹g(shù)是指直接在出發(fā)菌株中導(dǎo)入目的基因從而獲得高產(chǎn)所需物質(zhì)菌株的方法，目前較為常用的技術(shù)為CRISPR/Cas9技術(shù)，研究人員利用該技術(shù)將酵母細(xì)胞壁蛋白Cwp2p編碼基因破壞后，使得酵母分泌的β-葡萄糖苷酶活力提高[81]。通過基因工程技術(shù)尋找與β-葡萄糖苷酶相關(guān)的靶點(diǎn)基因，可以達(dá)到提高出發(fā)菌株酶活力的目的。以上方法都是目前較為常用的獲取新性能酵母的方法，但是也不可避免地存在一定的不足，這也導(dǎo)致在進(jìn)行高酶活力酵母的篩選和改造時(shí)，需要根據(jù)所需特性及不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行選擇。

表2 獲取產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株方法比較Table 2 Comparison of methods for obtaining yeast strains with β-glucosidase

4 結(jié) 語

高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母在發(fā)酵酒中的應(yīng)用已經(jīng)在葡萄酒、啤酒和其他發(fā)酵酒等多個(gè)發(fā)酵體系中得到驗(yàn)證（圖2）。在我國(guó)傳統(tǒng)的酒精飲料白酒的酒曲和黃水以及黃酒的酒曲中，也有關(guān)于高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的發(fā)現(xiàn)，研究人員將其用于葡萄酒的發(fā)酵中可以增加酒的柑橘類、甜果類、香料類香氣[86-89]。大量研究表明非釀酒酵母產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對(duì)于發(fā)酵酒的作用包括水解糖苷結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)，釋放C13-降異戊二烯、單萜烯、倍半萜醇和脂肪醇等增加酒類香氣的復(fù)雜度。β-葡萄糖苷酶對(duì)花色苷的水解作用也影響著酒類的顏色穩(wěn)定性。部分高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母在發(fā)酵中還可以產(chǎn)生乳酸和甘油，改善酒的口感和風(fēng)味。

圖2 β-葡萄糖苷酶活力的影響因素及其在不同發(fā)酵體系中的應(yīng)用Fig 2 Factors affecting β-glucosidase activity and its application in different fermentation systems

雖然高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的非釀酒酵母在發(fā)酵酒中的應(yīng)用研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展，但由于菌株特異性以及β-葡萄糖苷酶活力的影響因素眾多等原因，導(dǎo)致其在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問題。商業(yè)釀酒酵母是一種常用的發(fā)酵劑，在多種發(fā)酵環(huán)境中都具有較好的發(fā)酵能力，而非釀酒酵母并非普適性的發(fā)酵劑，其在不同發(fā)酵體系和發(fā)酵條件的適用性還有待驗(yàn)證。對(duì)于大部分非釀酒酵母而言，由于其本身對(duì)于發(fā)酵環(huán)境更為敏感，并且發(fā)酵能力較弱，因此在發(fā)酵體系和發(fā)酵條件發(fā)生改變時(shí)，適用于新環(huán)境的非釀酒酵母需要進(jìn)行改造或重新篩選。非釀酒酵母雖然已經(jīng)被廣泛研究，但其并不是被長(zhǎng)期使用的公認(rèn)安全的酵母，由于其會(huì)產(chǎn)生異味等性質(zhì)，在過去甚至被認(rèn)為是腐敗酵母[42]，部分非釀酒酵母本身是一種病原體，在發(fā)酵中可能會(huì)導(dǎo)致食品安全問題[49]，因此非釀酒酵母本身以及產(chǎn)生的物質(zhì)的生物安全性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。目前除了自然發(fā)酵酒外，大部分非釀酒酵母在發(fā)酵酒中的應(yīng)用處于實(shí)驗(yàn)室階段，而高β-葡萄糖苷酶活力的非釀酒酵母在發(fā)酵酒中的應(yīng)用研究才剛剛起步，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化還有漫長(zhǎng)的發(fā)展歷程。

微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶不僅可以應(yīng)用于酒類的增香，在速溶茶增香[21]、食品脫苦[90]、白藜蘆醇生成[29]、異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元[91]、土壤改善[92]、病蟲害防治[93]等方面都有著良好的應(yīng)用前景，無論是通過從自然基質(zhì)中篩選獲得含有β-葡萄糖苷酶的菌株，或是通過誘變育種和基因工程的方法改造從而獲得高酶活力菌株，隨著代謝組學(xué)和全基因組測(cè)序研究的不斷深入，將β-葡萄糖苷酶用于工業(yè)生產(chǎn)是其未來發(fā)展的重要方向。