蘇安祥，胡 燁，胡秋輝，徐 輝，劉建輝，謝旻皓，裴 斐，楊文建*

（南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

腸道性炎癥包括結(jié)腸炎和直腸炎，近年來其發(fā)病率不斷升高，嚴(yán)重影響人們的身體健康和日常生活。腸道性炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展與飲食結(jié)構(gòu)、精神壓力、生活習(xí)慣有關(guān)[1-2]。從飲食方面入手，篩選有抑制炎癥作用的食物成分、調(diào)節(jié)膳食組成是預(yù)防和控制腸道炎癥的可行途徑。文獻報道顯示，大蒜素[3-4]、乳鐵蛋白[5]、白藜蘆醇[6]、人參水溶性膳食纖維[7]、金針菇多糖[8]、藍莓花色苷[9]、靈芝多糖[10]、松仁多糖[11]、百合多糖[12]等均對腸道炎癥有抑制作用。食用菌功能成分的生物活性已被廣泛證實[13]，多糖被發(fā)現(xiàn)具有可控制病毒感染[14]、增強免疫應(yīng)答[15]等生物活性功能。靈芝蛋白聚糖作為一種復(fù)雜的糖復(fù)合物，當(dāng)其直接作用于癌細胞時或作用于免疫細胞時，可通過刺激細胞釋放因子，從而抑制腫瘤細胞的增殖，表現(xiàn)出抗腫瘤活性；而蛋白聚糖作用于免疫細胞時，同樣通過抑制一氧化氮（nitrite oxide，NO）的釋放，同時抑制細胞釋放細胞因子（白細胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、下調(diào)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）等），達到抗炎效果，有效減緩炎癥[16]。本課題組前期對金針菇的功能成分進行了系統(tǒng)的分析研究，闡明了金針菇多糖、金針菇多酚等成分的功能作用[17-19]。本實驗通過分離純化得到金針菇蛋白聚糖（Flarnmulina velutipesproteoglycans，F(xiàn)PG）1-1，擬從細胞水平探討其對腸道炎癥的生物活性。

Caco-2細胞來源于人結(jié)腸腺癌細胞，具有微絨毛結(jié)構(gòu)，能夠生產(chǎn)小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶，細胞培養(yǎng)成熟后可形成完整的細胞單層膜，其結(jié)構(gòu)和功能類似于小腸上皮細胞，是國際上公認的研究小腸上皮細胞吸收和轉(zhuǎn)運等功能的最佳模型之一[20]。Caco-2細胞容易在體外培養(yǎng)，穩(wěn)定性好，實驗重現(xiàn)性高，與動物實驗相比具有容易操作、耗費時間少、需要的樣品量小等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于體外活性快速篩選、腸道相關(guān)問題的科學(xué)研究[21]。但是僅用Caco-2細胞難以有效模擬體內(nèi)微環(huán)境，特別是細胞與細胞之間的相互作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腸上皮細胞與免疫細胞之間具有精細的對話機制，腸上皮細胞通過信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫細胞細胞因子等物質(zhì)的分泌，從而改善腸道健康[22]。Caco-2細胞和免疫細胞（巨噬細胞RAW264.7）共培養(yǎng)技術(shù)可以彌補Caco-2細胞單培養(yǎng)在模擬體內(nèi)微環(huán)境上的不足，有助于系統(tǒng)探討生物活性物質(zhì)對腸道上皮細胞的屏障作用、腸黏膜上皮細胞與免疫細胞的對話機制[22]。

本實驗以來源于金針菇的蛋白聚糖為原料，建立脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的Caco-2細胞、巨噬細胞RAW264.7共培養(yǎng)炎癥模型，測定NO、活性氧（reactive oxygen species，ROS）及細胞因子水平等指標(biāo)，以分析FPG1-1對炎癥抑制的作用，為金針菇功能成分的開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FPG1-1根據(jù)文獻報道方法[23]分離純化獲得。人克隆結(jié)腸腺癌細胞（Caco-2）和小鼠單核巨噬細胞（RAW264.7）購于復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院細胞資源中心。

LPS、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶 美國Gibco生物科技公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、NO、ROS等試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10等酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 南京建成生物工程生物研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

生物安全柜、8000系列二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、Barnstead GenPure xCAD超純水儀 美國Thermo Fisher公司；酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；倒置式生物顯微鏡 北京Precise儀器有限公司；高壓滅菌鍋 日本Tomy Koqyo公司；RES-2電阻儀德國Millicell公司；DM2500 LED熒光顯微鏡 德國Leica公司；FACSCalibur流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；Transwell培養(yǎng)皿 美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

由10%胎牛血清、0.5%青鏈霉素與DMEM配制細胞培養(yǎng)液，將Caco-2或RAW264.7細胞接種至含完全培養(yǎng)液T25細胞培養(yǎng)瓶中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃、5% CO2）。當(dāng)細胞增殖至80%時進行傳代，用3 mL PBS洗滌兩次。加入3 mL培養(yǎng)液并吹打細胞，使其脫落，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，離心（37 ℃、1 000 r/min、5 min），去除上清，加1 mL完全培養(yǎng)液吹打成細胞懸浮液。吸取0.5 mL細胞懸液加入到T25培養(yǎng)瓶，然后加10 mL完全培養(yǎng)液，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[24]。

1.3.2 細胞增殖率的測定

使用MTT法測定FPG1-1對RAW264.7的細胞毒性作用。RAW264.7細胞在96 孔板中37 ℃孵育24 h后，用PBS洗滌數(shù)次。對照組（含RAW264.7細胞）和空白組（不含RAW264.7細胞）分別加入200 μL DMEM，各處理組加入等體積不同質(zhì)量濃度（25、50、75、100、150、200 μg/mL）的樣品，每組設(shè)置6 個平行，孵育24 h后，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）并在37 ℃培養(yǎng)基中孵育4 h。去除MTT溶液后每孔加入100 μL DMSO。將96 孔板置于恒溫振蕩器上室溫振蕩20 min后，測定波長570 nm處吸光度，按照式（1）計算細胞增殖率。

式中：A1表示處理組吸光度；A2表示對照組吸光度；A0表示空白組吸光度。

1.3.3 Caco-2細胞單層細胞模型的建立

培養(yǎng)的Caco-2細胞消化離心后制備細胞懸浮液，按照Transwell實驗使用方法，在Transwell小室和下室中均加入培養(yǎng)基，Caco-2細胞接種于Transwell小室，使細胞終濃度為2.5×105個/mL，第一周每2 d更換一次Transwell小室和下室細胞培養(yǎng)基，第2、3周每天更換培養(yǎng)基[24]。以跨膜電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）和細胞形態(tài)評估單層細胞的形成情況，步驟參照方法1.3.4節(jié)和1.3.5節(jié)。

1.3.4 Caco-2細胞單層細胞模型跨膜電阻的測定

Caco-2細胞單層跨膜電阻值（trans-epithelial electrical resistance，TEER）采用電阻儀每天測定電阻，并根據(jù)公式（2）計算TEER。其中空白組為未接種細胞的孔，樣品組為接種細胞的孔。

式中：Rs為樣品組的電阻值/Ω；Ra為空白組的電阻值/Ω；S為孔板的膜面積/cm2。

1.3.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察

使用倒置光學(xué)顯微鏡觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.3.6 Caco-2細胞和RAW264.7巨噬細胞共培養(yǎng)模型建立

參考文獻[25]的方法并稍作修改。通過形態(tài)學(xué)觀察，Caco-2細胞單層細胞模型培養(yǎng)合格后，去除下室培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，將培養(yǎng)的RAW264.7巨噬細胞懸液接種于下室，加入培養(yǎng)基使下室RAW264.7巨噬細胞密度為1×105個/mL。

實驗分組：對照組小室和下室以無血清培養(yǎng)基孵育；模型組小室加入無血清培養(yǎng)基，下室加入LPS，使其質(zhì)量濃度為10 μg/mL；蛋白聚糖處理組下室加入LPS（終質(zhì)量濃度10 μg/mL）處理4 h后，小室分別加入終質(zhì)量濃度25、50、100、200 μg/mL的蛋白聚糖，孵育12 h。每組樣品設(shè)置5 個平行實驗。

1.3.7 NO濃度的測定

按照NO試劑盒操作說明進行測定。根據(jù)公式（3）計算NO含量。

式中：An為樣品組吸光度；A0為空白組吸光度；A為標(biāo)準(zhǔn)品組吸光度；c為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100 μmol/L）；N為樣品測試前稀釋倍數(shù)。

1.3.8 ROS相對水平的測定

參考文獻[26]報道的方法，利用二氯熒光乙酰乙酸鹽（dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）熒光探針法檢測細胞ROS水平。按照ROS測試試劑盒說明書進行操作，流式細胞儀檢測熒光強度，并根據(jù)公式（4）計算ROS相對水平。

式中：Bn為各處理組熒光強度值；B0對照組熒光強度值。

1.3.9 細胞因子質(zhì)量濃度的測定

按照ELISA試劑盒操作說明，測定IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10細胞因子質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以O(shè)ne-Way ANOVA進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7增殖的影響

采用MTT法研究FPG1-1對巨噬細胞活力的影響。細胞增殖率可用來反映細胞生長分裂情況，常用來指示樣品對細胞活性的影響，以確定適用于細胞實驗的樣品質(zhì)量濃度。定義對照組測得的細胞增殖率為100%，測得質(zhì)量濃度為25、50、75、100、150、200 μg/mL的FPG1-1樣品處理后的細胞增殖率分別為（96.13±2.47）%、（91.34±2.19）%、（90.01±2.06）%、（91.65±3.24）%、（89.74±4.79）%和（88.26±2.21）%，增殖率均高于80%，這些質(zhì)量濃度遠高于半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（half-maximal inhibitory concerntration，IC50），但是FPG1-1質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，細胞增殖率顯著降低（P＜0.05）（圖1）。由此可知當(dāng)FPG1-1處理濃度低于200 μg/mL時，對小鼠巨噬細胞活性無顯著影響且毒性作用低，可用于細胞實驗。為了保證所選的樣品質(zhì)量濃度范圍大，同時減少實驗組數(shù)，因此選取FPG1-1質(zhì)量濃度25、50、100、200 μg/mL作為樣品處理質(zhì)量濃度進行后續(xù)研究。

圖1 FPG1-1對RAW264.7細胞增殖率的影響Fig.1 Effect of FPG1-1 on viability of RAW264.7 cells

2.2 Caco-2細胞單層細胞模型的建立

Caco-2細胞結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞，其結(jié)構(gòu)與人小腸上皮細胞類似，可用作腸道轉(zhuǎn)運模型[27-28]。培養(yǎng)過程Caco-2細胞單層細胞模型TEER的變化如圖2所示，TEER是一種反映Caco-2細胞單層完整性的指標(biāo)，TEER與細胞單層通透性呈負相關(guān)關(guān)系，與細胞單層完整性、致密性呈正相關(guān)關(guān)系，其變化可以反映細胞單層結(jié)構(gòu)的形成情況，可通過測量Caco-2單層的TEER來判斷單層Caco-2細胞的完整性。結(jié)果顯示TEER整體上呈“S”型增長，Transwell中的Caco-2細胞在培養(yǎng)1～4 d內(nèi)TEER升高緩慢（低于100 Ω·cm2）；5～11 d內(nèi)TEER升高迅速；12～15 d內(nèi)TEER繼續(xù)升高，但增速降低，該范圍內(nèi)TEER超過400 Ω·cm2，第15天時TEER已在500 Ω·cm2左右。16～22 d，TEER變化不明顯，趨于穩(wěn)定，處于500～550 Ω·cm2范圍內(nèi)，說明15 d時細胞已形成完整的致密單層，單層細胞模型建立成功。此結(jié)果與丁濤[29]、余自成[30]等的研究結(jié)果一致。

圖2 Caco-2細胞單層細胞模型TEERFig.2 Transepithelial electrical resistance (TEER) of Caco-2 cell monolayer model as a function of culture time

結(jié)合細胞形態(tài)學(xué)觀察進一步確定單層細胞完整性形成情況，如圖3所示，觀察不同培養(yǎng)時間下的Caco-2細胞（Transwell小室）形態(tài)。Caco-2細胞接種到培養(yǎng)板培養(yǎng)8 d后，貼壁生長的Caco-2細胞繁殖，細胞呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，單細胞層開始逐漸連接形成片狀，18 d后細胞結(jié)合緊密，已形成完整的細胞單層，此時Caco-2細胞開始出現(xiàn)成熟腸道黏膜上皮細胞的結(jié)構(gòu)特征，此時細胞單層結(jié)構(gòu)完整性好，適于進一步實驗。

圖3 培養(yǎng)時間對Caco-2單層細胞形態(tài)的影響（×20）Fig.3 Effect of culture time on Caco-2 monolayer cell morphology (× 20)

2.3 FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7 NO分泌的影響

有研究報道NO參與免疫應(yīng)答相關(guān)的生理過程，是巨噬細胞殺傷病原微生物的主要效應(yīng)分子之一[31]。NO的分泌水平可以表征細胞狀態(tài)，巨噬細胞通過釋放細胞因子，積極參與炎癥反應(yīng)。如圖4所示，LPS處理極顯著增加了細胞中NO的生成量，而經(jīng)FPG1-1處理后細胞中的NO濃度顯著降低，并顯示出劑量依賴性，NO濃度隨著FPG1-1處理質(zhì)量濃度的升高而下降，200 μg/mL FPG1-1處理后的細胞內(nèi)NO濃度為（16.23±1.46）μmol/L，極顯著低于LPS模型組。由此推測，F(xiàn)PG1-1可能通過抑制NO分泌，保護Caco-2細胞和RAW264.7細胞共培養(yǎng)模型，發(fā)揮抗炎作用，這與胡曉祎[22]的研究結(jié)果一致。

圖4 FPG1-1對RAW264.7細胞中NO生成量的影響Fig.4 Effect of FPG1-1 on NO production in RAW264.7 cells

2.4 FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7 ROS生成的影響

ROS包括超氧自由基、其衍生物過氧化氫和羥自由基等，通過檢測細胞內(nèi)ROS水平可以反映生物體氧化損傷的程度。圖5為FPG1-1對巨噬細胞RAW264.7 ROS生成的影響。結(jié)果顯示，LPS處理能顯著誘導(dǎo)RAW264.7細胞內(nèi)ROS生成量提高（P＜0.01），F(xiàn)PG1-1處理會降低細胞內(nèi)LPS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激產(chǎn)生ROS水平，經(jīng)過不同質(zhì)量濃度FPG1-1（25、50、100、200 μg/mL）處理后，細胞內(nèi)ROS分泌量顯著降低（P＜0.05、P＜0.01），并且FPG1-1干預(yù)質(zhì)量濃度越高，ROS水平下降越多。FPG1-1質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，ROS相對水平降至102.68%。有研究報道，ROS促進腸道炎癥中的氧化應(yīng)激，而ROS水平增加與疾病加重和惡化有關(guān)，炎性腸病實驗中，隨著ROS水平增加，內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的消耗和氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平顯著增加，過量的ROS引起氧化應(yīng)激，在體內(nèi)產(chǎn)生氧化分解產(chǎn)物從而誘發(fā)炎癥，同時激活炎癥細胞去分泌促炎因子，導(dǎo)致氧化損傷[31]。另有研究顯示，ROS水平與細胞增殖密切相關(guān)，當(dāng)ROS濃度過高時，會誘導(dǎo)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而造成氧化損傷[32]。結(jié)合實驗結(jié)果可知，F(xiàn)PG1-1能夠有效降低ROS的產(chǎn)生，避免氧化應(yīng)激，從而緩解細胞炎癥。

圖5 FPG1-1對RAW264.7細胞中ROS生成量的影響Fig.5 Effect of FPG1-1 on ROS production by RAW264.7 cells

2.5 FPG1-1對RAW264.7細胞因子水平的影響

為了研究FPG1-1對細胞炎癥抑制作用是否是通過調(diào)控細胞因子的分泌水平而實現(xiàn)，將不同質(zhì)量濃度FPG1-1（25、50、100、200 μg/mL）作用于Caco-2細胞與RAW264.7細胞共培養(yǎng)模型，通過ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中各細胞因子的水平。不同質(zhì)量濃度的FPG1-1對細胞的IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10質(zhì)量濃度的影響如圖6所示。經(jīng)過25、50、100、200 μg/mL FPG1-1處理后，IL-6質(zhì)量濃度分別為（10.46±1.01）、（10.12±0.90）、（8.88±1.32）、（8.48±0.31）ng/mL，模型組為（14.45±1.12）ng/mL，對照組為（9.93±1.34）ng/mL，F(xiàn)PG1-1處理組與模型組IL-6質(zhì)量濃度有顯著性差異（P＜0.05），說明FPG1-1能顯著抑制炎癥因子IL-6的分泌。對于IL-10而言，25、50、100、200 μg/mL FPG1-1處理后其質(zhì)量濃度分別為（189.75±4.62）、（221.40±18.39）、（290.36±36.14）、（329.15±25.12）ng/mL，模型組為（154.92±10.32）ng/mL，說明高質(zhì)量濃度FPG1-1能有效促進抗炎細胞因子IL-10釋放。同時，與模型組相比，F(xiàn)PG1-1處理顯著降低IL-1β分泌（P＜0.05），極顯著降低TNF-α的生成量（P＜0.01）。研究顯示，免疫細胞在腸炎過程中分泌過量的促炎因子是腸道炎癥發(fā)展的重要因素之一，某些生物活性成分可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠細胞產(chǎn)生TNF-α，間接抑制IL-1β的合成表達，并抑制促炎細胞因子（如IL-6）的過度分泌，促進抗炎性細胞因子（IL-10）產(chǎn)生，從而緩解炎癥[33]。以上結(jié)果表明，F(xiàn)PG1-1的抗炎作用與抑制促炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6分泌和提高抗炎細胞因子IL-10分泌有關(guān)。

圖6 FPG1-1對RAW264.7細胞因子含量的影響Fig.6 Effect of FPG1-1 on cytokine secretion by RAW264.7 cells

3 結(jié) 論

本研究建立了Caco-2細胞和RAW264.7細胞共培養(yǎng)腸炎模型，分析FPG1-1的抗炎作用。利用NO釋放量表征巨噬細胞的炎癥活化狀態(tài)，與模型組相比，F(xiàn)PG1-1處理顯著降低了細胞NO、ROS水平（P＜0.05、P＜0.01），表明FPG1-1可顯著抑制NO、ROS分泌，保護細胞進而緩解氧化應(yīng)激。ELISA測定細胞因子水平結(jié)果表明FPG1-1能上調(diào)IL-10和下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6分泌。以上結(jié)果表明，F(xiàn)PG1-1可以作用于腸上皮細胞，通過上皮細胞與免疫細胞之間的相互作用，降低細胞NO、ROS水平，抑制炎癥細胞因子的分泌，發(fā)揮改善腸道炎癥的作用。下一步將通過動物實驗深入研究其在體內(nèi)的作用效果及機制。