葛 瑩，王歡歡，張 雷，李慶海，黃 沁，章學(xué)東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

糖尿病是因胰島素分泌不足(1型糖尿病)或胰島素抵抗(2型糖尿病)引起的一種復(fù)雜的慢性代謝性疾病[1,2]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟報告，2019年全球約有4.63億人患糖尿病，預(yù)計到2035年達到5.92億，已然成為威脅人類健康的一大疾病。常見的抗糖藥物有胰島素類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑類等。其中，阿卡波糖屬于α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥且目前在臨床上得到廣泛應(yīng)用[3-5]。但研究發(fā)現(xiàn)長期使用會發(fā)生不良反應(yīng)或療效不佳的情況[6]。許多專家認(rèn)為除了運動和藥物控制，飲食治療是糖尿病治療的基礎(chǔ)措施[7]。因此，從食品中挖掘更安全、有效的抗糖功能成分具有重要的意義。

烏骨雞是我國特有的藥食兩用雞種，長期以來深受消費者喜愛。據(jù)《本草綱目》記載烏骨雞能夠治療消渴癥，即糖尿病[8]。同時，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實烏骨雞體內(nèi)富含多種功能活性成分，包括黑色素、氨基酸、脂肪酸和生物活性肽等。其中，烏骨雞活性肽(以下簡稱烏雞肽)是烏骨雞肌肉蛋白水解得到的一些特定小分子量氨基酸片段，已被證實具有抗氧化、補氣血、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生理作用[9-11]。目前，烏雞肽與糖尿病的關(guān)聯(lián)研究較少。本課題組前期研究初步證實烏雞肽能夠改善鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的體重、空腹血糖、血脂等水平。在此基礎(chǔ)上，本試驗分析烏雞肽對糖尿病小鼠的糖化血清蛋白(glycosylated serum protein，GSP)含量及脾、胸腺指數(shù)的影響，以期進一步解析烏雞肽的抗糖作用，為充分開發(fā)烏骨雞功能成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗素材 雄性ICR小鼠(5周齡，清潔級)來自浙江省醫(yī)科院實驗動物中心，實驗期間確保飼養(yǎng)環(huán)境安靜清潔，室內(nèi)溫度(20±2)℃、濕度50%～60%、12 h明暗循環(huán)以及提供充足的飼料和飲水，造模前需適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。烏雞肽由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，是由烏骨雞蛋白經(jīng)酶解分離制得的分子量小于5000 kDa的多肽。

1.2試劑及儀器 STZ(S0130，Sigma)，阿卡波糖(德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，檸檬酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等分析純(生工生物工程(上海)股份有限公司)，GSP測試盒(南京建成生物工程)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；臺式低溫高速離心機(Eppendorf，德國)；血糖儀和血糖試紙(Roche，美國)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)；超純水機(Millipore，美國)。

1.3造模 將STZ溶于0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液以配制10 mg·mL-1注射液。ICR小鼠隔夜禁食后，按照120 mg·kg-1的STZ劑量進行腹腔注射來誘導(dǎo)糖尿病。注射1周后斷尾采血，測得空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1則為糖尿病小鼠。

1.4試驗分組 將造模成功的小鼠隨機分為3組，每組10只。分別每天灌喂400 mg·kg-1烏雞肽(BP組)、30 mg·kg-1阿卡波糖(AC組)和生理鹽水(PC組)。另隨機選擇10只健康小鼠作為正常對照組(NC)并灌喂生理鹽水。

1.5試驗方法 連續(xù)灌喂30 d后稱重，然后采用脫頸法處死小鼠，眼眶靜脈竇采血，4℃靜置24 h，3000 r·min-1、15 min分離出血清，根據(jù)GSP測試盒說明書，利用酶標(biāo)儀檢測GSP含量，采集脾、胸腺組織，生理鹽水沖洗后擦干、稱重，最后計算脾、胸腺指數(shù)，公式如下：

脾指數(shù)(mg·g-1)=脾重量(mg)/體重(g)

胸腺指數(shù)(mg·g-1)=胸腺重量(mg)/體重(g)

1.6數(shù)據(jù)分析 采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)值，使用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異顯著性采用Tukey檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1烏雞肽對血清GSP含量的影響 GSP能有效地反映過去2～3周內(nèi)平均血糖水平，不受臨時血糖濃度波動干擾，是觀察血糖控制情況的重要指標(biāo)之一。由表1可知，相比于NC組，其余3組的GSP含量顯著較高(P<0.05)，即灌胃一段時間后的糖尿病小鼠仍持續(xù)高血糖。但相比于PC組，BP組和AC組的GSP含量顯著較低(P<0.05)且這兩組間無顯著差異，說明灌喂烏雞肽和阿卡波糖后的糖尿病小鼠血糖均顯著下降，并且兩者效果相似?？傊?，烏雞肽和阿卡波糖能在一定程度上調(diào)節(jié)降低糖尿病小鼠血糖。

表1 烏雞肽對糖尿病小鼠血清GSP含量的影響 單位：mmol·L-1

2.2烏雞肽對免疫器官的影響 脾和胸腺是機體重要的免疫器官，并且脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為評估免疫功能的基礎(chǔ)指標(biāo)。由圖1可知，與NC組相比，BP組和AC組的脾指數(shù)無顯著差異，而PC組顯著較低(P<0.05)；PC組的脾指數(shù)低于BP、AC組，且與后者具有顯著差異(P<0.05)。胸腺指數(shù)由高到低為NC、BP、AC、PC組，但組間無顯著差異。以上表明，灌喂烏雞肽有利于提高糖尿病小鼠脾指數(shù)，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

3 討論

目前，實驗室常將STZ作為糖尿病模型誘導(dǎo)試劑。它是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，進入體內(nèi)被葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至胰腺組織，特異性破壞β細胞使胰島素分泌下降，造成機體無法吸收葡萄糖、血糖升高[12]。研究者們通過一次腹腔注射大劑量STZ誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠，具有高血糖和“三多一少”的癥狀[13,14]。同樣，本試驗經(jīng)腹腔一次注射120 mg·kg-1劑量的STZ，1周后檢測發(fā)現(xiàn)小鼠空腹血糖高于11.1 mmol·L-1，說明糖尿病小鼠構(gòu)建成功。

GSP是由血液中的葡萄糖與白蛋白和其他蛋白分子N末端發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物，其中糖化白蛋白濃度約占90%[15]。它不受血液系統(tǒng)疾病的影響且半衰期較短(17～19天)，從而反映測定前2～3周的短期血糖狀態(tài)[16-17]。相比于空腹血糖測定的繁瑣(需要禁食)和不穩(wěn)定性，GSP能更快速、準(zhǔn)確地反映血糖控制情況或者監(jiān)測糖尿病治療變化。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)STZ型糖尿病小鼠GSP水平顯著高于健康小鼠(P<0.05)。本試驗也證實了健康小鼠GSP含量[(2.02±0.33)mmol·L-1)]顯著低于陽性對照小鼠[(3.93±0.52)mmol·L-1](P<0.05)。灌喂烏雞肽、阿卡波糖30 d后的小鼠組血糖均顯著低于陽性對照組(P<0.05)，說明烏雞肽同阿卡波糖一樣在一定程度上降低糖尿病小鼠血糖。但也觀察到烏雞肽、阿卡波糖組顯著高于正常對照組(P<0.05)，即血糖未恢復(fù)到健康小鼠水平，這可能與給藥濃度及烏雞肽關(guān)鍵功能肽段未完全分離提純有關(guān)。

長期高血糖使機體對胰島多種抗原成分失去耐受，主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子與其處理的β細胞抗原共同激活細胞毒性因子，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致免疫力下降引發(fā)嚴(yán)重的心血管、肝腎損傷等并發(fā)癥[18]。脾和胸腺作為動物重要的免疫器官，其中脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，具有T、B淋巴細胞以及巨噬細胞，胸腺能誘導(dǎo)T淋巴細胞分化、成熟，輔助T細胞產(chǎn)生抗體。當(dāng)機體發(fā)生超敏反應(yīng)，促進淋巴細胞增殖、免疫器官質(zhì)量增加。因此，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)是衡量免疫功能的重要指標(biāo)[19,20]。黃桂紅等[21]發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠脾、胸腺指數(shù)顯著低于健康小鼠(P<0.05)。本研究也發(fā)現(xiàn)陽性對照組小鼠的脾、胸腺指數(shù)低于其他組。已有研究表明烏雞肽可以通過促進淋巴細胞增殖和巨噬細胞活力來增強免疫調(diào)節(jié)[22]。朱小語等[23]認(rèn)為烏雞肽可改善環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫功能。本試驗也觀察到灌胃烏雞肽及阿卡波糖的糖尿病小鼠脾指數(shù)與健康小鼠無顯著差異，說明它對糖尿病小鼠的免疫器官具有調(diào)節(jié)作用，從而減少并發(fā)癥的產(chǎn)生。

總之，本研究證實了烏雞肽對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有一定降低血糖、增強免疫功能的作用，后期課題組將進一步研究烏雞肽降糖的關(guān)鍵功能肽段及其作用機制。