田甜，陳鏡樓，黃徐英，林智娟，宋慧晶

(1.武漢市第四醫(yī)院/華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430034；2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢 430056)

木丹顆粒由黃芪、醋制延胡索、蘇木、三七、赤芍、丹參、紅花、川芎、雞血藤等9味中藥配伍而成，主要用于四肢末梢及軀干部麻木、疼痛及感覺(jué)異常，或見(jiàn)肌膚甲錯(cuò)、面色晦暗、倦怠乏力、神疲懶言、自汗等糖尿病性周圍神經(jīng)病變屬氣虛絡(luò)阻證的治療[1]?，F(xiàn)代臨床研究表明，木丹顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床效果顯著[2-4]，可有效改善患者生活質(zhì)量和血流動(dòng)力學(xué)，降低血脂，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，安全性較高[5]，對(duì)早期糖尿病腎病、血脂異常、糖尿病伴頸動(dòng)脈硬化、糖尿病足、糖尿病自主神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥均有明顯療效[6]，該藥聯(lián)合α-硫辛酸可明顯降低血清同型半胱氨酸水平[7]，聯(lián)合貝前列素鈉、依帕司他可明顯改善正中神經(jīng)和腓總神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度和感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度[8]，聯(lián)合紅景天乳膏可降低總癥狀評(píng)分及足部感覺(jué)震動(dòng)閾值，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，明顯改善患者臨床癥狀[9]。木丹顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ00422008，該標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)芍藥苷和人參皂苷Rg1進(jìn)行定量控制，未對(duì)方中君藥及其他藥味所含成分進(jìn)行定量研究，筆者也僅檢索到對(duì)木丹顆粒所含單一成分延胡索乙素進(jìn)行定量研究的文獻(xiàn)報(bào)道[10]。中藥及其制劑所含成分復(fù)雜，高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法(high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLC-QAMS)的多成分同時(shí)測(cè)定多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，有效降低了檢驗(yàn)成本，解決了部分對(duì)照品不穩(wěn)定等不足，近年來(lái)已逐步應(yīng)用于中成藥復(fù)方制劑質(zhì)量控制。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-QAMS法，以延胡索乙素為內(nèi)參物，對(duì)木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，以期為全面科學(xué)評(píng)價(jià)木丹顆粒質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；BSA224S型電子天平(德國(guó)Sartorius公司，感量：0.1 mg)；HU31208型超聲波清洗器(上海珂淮儀器有限公司)；Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，WondaSil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2試藥 延胡索乙素對(duì)照品(批號(hào)：110726-201819，CAS號(hào)：2934-97-6，含量：99.8%)、(±)原蘇木素B對(duì)照品(批號(hào)：111882-201302，CAS號(hào)：102036-29-3，含量：98.9%)和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品(批號(hào)：111920-201606，CAS號(hào)：20633-67-4，含量：97.6%)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；巴西蘇木素對(duì)照品(批號(hào)：PRF8032701，CAS號(hào)：474-07-7，含量：99.1%)、四氫非洲防己堿對(duì)照品(批號(hào)：PRF8050321，CAS號(hào)：483-34-1，含量：98.4%)、四氫黃連堿對(duì)照品(批號(hào)：PRF8070621，CAS號(hào)：4312-32-7，含量：99.8%)、毛蕊異黃酮對(duì)照品(批號(hào)：PRF8062601，CAS號(hào)：20575-57-9，含量：99.6%)和芒柄花素對(duì)照品(批號(hào)：PRF8091225，CAS號(hào)：485-72-3，含量：99.9%)購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；去氫紫堇堿對(duì)照品(批號(hào)：CFS201901，CAS號(hào)：83218-34-2，含量：98.0%)購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；木丹顆粒(規(guī)格：每袋7 g，批號(hào)：10181124，10190102，10190415)來(lái)源于遼寧奧達(dá)制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品各適量，置同一量瓶，用甲醇制成濃度分別為0.982，0.714，0.206，0.478，0.324，0.358，0.212，0.116和0.372 mg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.1.2混合對(duì)照品溶液 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL，用甲醇制成巴西蘇木素49.1 μg·mL-1、(±)原蘇木素B35.7 μg·mL-1、四氫非洲防己堿10.3 μg·mL-1、四氫黃連堿23.9 μg·mL-1、延胡索乙素16.2 μg·mL-1、去氫紫堇堿17.9 μg·mL-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷10.6 μg·mL-1、毛蕊異黃酮5.8 μg·mL-1和芒柄花素18.6 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3供試品溶液 取木丹顆粒，研成細(xì)粉，精密稱取約1.0 g，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲波清洗器超聲處理30 min，放冷后稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)重，濾過(guò) ，制成木丹顆粒供試品溶液。

2.1.4陰性樣品溶液 按國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBZ00422008中木丹顆粒的工藝處方分別制備缺蘇木、缺醋制延胡索、缺黃芪的陰性樣品，再按上述方法分別制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～11.0 min，10.0%A；>11.0～20.0 min，10.0%A→15.0%A；>20.0～41.0 min，15.0%A→42.0%A；>41.0～57.0 min，42.0%A→55.0%A；>57.0～65.0 min，55.0%A→10.0%A)，流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)分別為280 nm[0～41.0 min檢測(cè)巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素和去氫紫堇堿][11-14]和254 nm(41.0～65.0 min檢測(cè)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素)[15]；進(jìn)樣量10 μL。精密吸取“2.1.2～2.1.4”項(xiàng)下各溶液依法進(jìn)樣檢測(cè)，巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰形對(duì)稱，分離度均>1.5，理論板數(shù)按各成分色譜峰計(jì)均≥4500，陰性樣品對(duì)木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素定量測(cè)定無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

A.混合對(duì)照品；B.木丹顆粒；C.蘇木陰性樣品；D.延胡索陰性樣品；E.黃芪陰性樣品；1.巴西蘇木素；2.(±)原蘇木素B；3.四氫非洲防己堿；4.四氫黃連堿；5.延胡索乙素；6.去氫紫堇堿；7.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；8.毛蕊異黃酮；9.芒柄花素。

2.3線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，用甲醇配制成6個(gè)濃度梯度混合對(duì)照品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4精密度考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積RSD分別為0.58%，0.63%，1.17%，0.79%，1.01%，0.95%，1.13%，1.24%和0.86%。

2.5重復(fù)性考察 取同一批次木丹顆粒樣品，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積，計(jì)算得9種成分含量RSD分別為0.91%，1.02%，1.73%，1.16%，1.39%，1.24%，1.65%，1.88%和1.30%。

2.6穩(wěn)定性考察 精密吸取木丹顆粒同一份供試品溶液，于0，2，4，6，10，18 h進(jìn)樣檢測(cè)巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積，結(jié)果木丹顆粒供試品溶液18 h內(nèi)穩(wěn)定，9種成分的峰面積RSD分別為0.59%，0.65%，1.14%，0.81%，1.05%，1.37%，1.16%，1.26%和0.91%。

表1 9種成分線性關(guān)系與范圍

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取9種成分含量已知的同一批次木丹顆粒樣品，研成細(xì)粉，取9份，精密稱取約0.5 g，隨機(jī)分成3組，按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版四部要求加入混合對(duì)照品溶液[巴西蘇木素0.654 mg·mL-1、(±)原蘇木素B0.486 mg·mL-1、四氫非洲防己堿0.122 mg·mL-1、四氫黃連堿0.328 mg·mL-1、延胡索乙素0.186 mg·mL-1、去氫紫堇堿0.202 mg·mL-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.146 mg·mL-1、毛蕊異黃酮0.068 mg·mL-1、芒柄花素0.262 mg·mL-1]0.5，1.0和1.5 mL各一組，使各組9種成分對(duì)照品加入量約為樣品含有量的50%，100%和150%，再按照“2.1.3”項(xiàng)方法制成加樣供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的峰面積，計(jì)算9種成分平均加樣回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9種成分加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8相對(duì)校正因子測(cè)定 采用多點(diǎn)校正法，精密吸取“2.3”項(xiàng)下6種混合對(duì)照品溶液依法進(jìn)樣測(cè)定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的峰面積，以延胡索乙素為內(nèi)參物，按照計(jì)算公式：fk/m=fk/fm=(Ck×Am)/(Cs×Am)(式中C代表質(zhì)量濃度，A代表峰面積，k代表內(nèi)參物，m代表其他成分)計(jì)算巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素相對(duì)校正因子，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分相對(duì)校正因子

2.9耐用性考察

2.9.1不同儀器、色譜柱 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，考察不同儀器(Waters 2695型、Agilent 1290型)、色譜柱(Agilent Zorbax SB-C18、Diamonsil C18、WondaSil C18)對(duì)相對(duì)校正因子影響，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.9.2不同柱溫 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，考察不同柱溫(28，29，30，31，32 ℃)對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響

2.10色譜峰的定位 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，記錄巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰保留時(shí)間，以內(nèi)參物延胡索乙素色譜峰為基準(zhǔn)峰，采用相對(duì)保留時(shí)間值法(各待測(cè)成分與內(nèi)參物保留時(shí)間的比值)對(duì)待測(cè)成分色譜峰進(jìn)行定位，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同儀器、色譜柱各成分的相對(duì)保留時(shí)間值

2.11樣品含有量測(cè)定 取3批木丹顆粒樣品，按“2.1.3”項(xiàng)方法制成木丹顆粒供試品溶液(每批次平行制備3份)，依法檢測(cè)巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，首先采用外標(biāo)法計(jì)算9種成分含量，再以延胡索乙素為內(nèi)參物，根據(jù)“2.8”項(xiàng)建立的相對(duì)校正因子和計(jì)算公式計(jì)算巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，結(jié)果見(jiàn)表7。結(jié)果表明HPLC-QAMS法計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)外標(biāo)法檢測(cè)平均含量的80%，暫定本品每袋含黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計(jì)不得低于1.60 mg，以毛蕊異黃酮計(jì)不得低于0.70 mg，以芒柄花素計(jì)不得低于2.90 mg；含醋制延胡索以四氫非洲防己堿計(jì)不得低于1.30 mg，以四氫黃連堿計(jì)不得低于3.60 mg，以延胡索乙素計(jì)不得低于2.00 mg，以去氫紫堇堿計(jì)不得低于2.20 mg，含蘇木以巴西蘇木素計(jì)不得低于7.30 mg，以(±)原蘇木素B計(jì)不得低于5.30 mg。

3 討論

3.1檢測(cè)指標(biāo)成分的選擇 木丹顆粒組方中，黃芪補(bǔ)脾胃之元?dú)猓瑲馔?，祛瘀而不傷正，為方中君藥，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素等黃酮類為其主要活性成分，對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床療效顯著[16-17]。醋制延胡索活血散瘀、行氣止痛，四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素和去氫紫堇堿等異喹啉類生物堿類為其主要藥效成分，能夠有效減弱急性炎癥和神經(jīng)性疼痛[18]；三七補(bǔ)血活血、散瘀止痛，合為臣藥。蘇木活血祛瘀、消腫止痛，巴西蘇木素和(±)原蘇木素B為其特征成分，通過(guò)影響糖尿病大鼠、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自噬功能，治療糖尿病性大血管病變[19]；丹參活血涼血、消癰鎮(zhèn)痛，赤芍涼血鎮(zhèn)痛，紅花活血通經(jīng)，川芎活血行氣，共為佐藥。雞血藤補(bǔ)血活血、舒筋活絡(luò)，為使藥。諸藥共奏，以達(dá)益氣活血、祛瘀生新、通絡(luò)鎮(zhèn)痛功效[2]。本實(shí)驗(yàn)參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物[20-21]以君藥為首選，同時(shí)兼顧臣佐使藥的原則，選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B為檢測(cè)指標(biāo)成分，可為全面評(píng)價(jià)木丹顆粒整體質(zhì)量提供依據(jù)。

3.2流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)在選擇流動(dòng)相時(shí)，首先對(duì)比了乙腈-水[15，22]、甲醇-水[23-24]洗脫效果，結(jié)果甲醇-水系統(tǒng)基線不平穩(wěn)，干擾檢測(cè)；乙腈-水系統(tǒng)基線平穩(wěn)且分離效果較好，但毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮色譜峰因拖尾不能完全分離，故考慮在水相中加入弱酸(0.2%甲酸溶液[14，23-24]、0.2%醋酸溶液[11-12，25]、0.2%磷酸溶液[13])以改善峰形和分離效果，同時(shí)對(duì)優(yōu)選后的流動(dòng)相比例進(jìn)行不斷優(yōu)化，最終確定以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相，按“2.2”項(xiàng)流動(dòng)相比例對(duì)木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

筆者在本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-QAMS法，對(duì)木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素9種成分含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，建立了木丹顆粒多指標(biāo)成分質(zhì)量控制方法，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷完善制劑生產(chǎn)所有原藥材種屬、產(chǎn)地等源頭控制，不斷提升制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)以達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效一致性，同時(shí)，HPLC-QAMS法利用中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，有效降低了檢驗(yàn)分析成本，便于多組分質(zhì)量控制模式的普及應(yīng)用。筆者在本實(shí)驗(yàn)建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，分析檢測(cè)時(shí)間較短，降低了檢驗(yàn)成本，對(duì)提升木丹顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有一定指導(dǎo)意義。