黃曉婧，曾楨，肖春霞，許莉，李慶，趙小勤

(成都市藥品檢驗(yàn)研究院/中藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610045)

中醫(yī)藥具有幾千年的悠久歷史，是中華民族的寶貴財(cái)富[1]。人口的增加及中醫(yī)藥的發(fā)展導(dǎo)致對(duì)中藥材的需求量不斷增加，野生資源的過度開發(fā)也造成了中藥資源的嚴(yán)重短缺。中藥栽培作為一個(gè)新興的產(chǎn)業(yè)應(yīng)運(yùn)而生，并逐漸走向了規(guī)?；痆2]。植物生長調(diào)節(jié)劑為人工合成的對(duì)植物生長發(fā)育有調(diào)節(jié)作用的化學(xué)物質(zhì)，能有效調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育過程，達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、增強(qiáng)植物抗逆性等目的[3]。植物生長調(diào)節(jié)劑在農(nóng)林果蔬園藝等領(lǐng)域已廣泛使用，其可以顯著縮短生長年限并增加產(chǎn)量，在藥用植物種植中的應(yīng)用研究始于20世紀(jì)80年代末[4]，集中于根及根莖類藥材，如應(yīng)用在丹參[5]、川白芷[6]、麥冬[7]等品種上，以提高產(chǎn)量。但在增產(chǎn)的同時(shí)也具有一定的毒性，如赤霉素可能增加皮膚和膀胱慢性炎癥的發(fā)生[8]，多效唑原藥在一定劑量時(shí)可導(dǎo)致繁殖毒性[9]。也有研究表明，植物生長調(diào)節(jié)劑會(huì)使黨參有效成分黨參炔苷含量降低[10]。

知母為百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)干燥根莖，主要化學(xué)成分包括甾體皂苷、木質(zhì)素、黃酮等[11]，具有抗腫瘤、抗炎、改善老年癡呆、改善骨質(zhì)疏松等作用[12]。目前，對(duì)知母的研究主要集中在有效成分及藥理方面，筆者未見檢測(cè)知母中植物生長調(diào)節(jié)劑的報(bào)道。本研究針對(duì)根莖類常用的8種植物生長調(diào)節(jié)劑，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)建立其在知母中的含量檢測(cè)方法，以期為知母生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制和安全性檢測(cè)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜串聯(lián)6470三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-MS/MS，美國安捷倫公司)；AUX220型電子天平(日本島津公司，感量：0.001 mg)；XPE26型電子天平(梅特勒-托尼多儀器有限公司，感量：0.001 mg)；SK250H型超聲波清洗器(250 W，53 kHz，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2藥品與試劑 丁酰肼(批號(hào)：20927，含量：97.0%)、矮壯素(批號(hào)：111686，含量：99.0%)、助壯素(批號(hào)：112950，含量：99.0%)、4-硝基苯酚鈉(批號(hào)：30320，含量：92.9%)、氯吡脲(批號(hào)：109007，含量：99.2%)對(duì)照品均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，赤霉素(批號(hào)：20170324，含量：99.2%)、多效唑(批號(hào)：20170616，含量：99.4%)、烯效唑(批號(hào)：20160311，含量：99.8%)對(duì)照品均購于上海市農(nóng)藥研究所有限公司。

試劑：乙腈(德國Merck公司，色譜純)；甲酸銨(美國Fisher公司，質(zhì)譜級(jí))；水為娃哈哈純凈水，其余試劑為分析純。

30批次知母樣品(編號(hào)s1～s30)，經(jīng)成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院周世玉主任中藥師鑒定，為百合科知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根莖，樣品信息見表1。

表1 知母樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取丁酰肼、矮壯素、助壯素、赤霉素、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、多效唑、烯效唑?qū)φ掌犯骷s10 mg，置于10 mL量瓶，加乙腈溶解定容，制成約1 mg·mL-1單標(biāo)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。再用乙腈稀釋配制成1 μg·mL-1混合對(duì)照品溶液，于棕色量瓶保存(12 h內(nèi)使用)。

2.1.2供試品溶液 精密稱取知母樣品粉末(過三號(hào)篩，篩孔內(nèi)徑355 μm)3 g，置50 mL具塞離心管，加入含0.1%甲酸的乙腈提取液20 mL，渦旋混勻30 s，超聲處理20 min，4000 r·min-1離心10 min(r=60 mm)，靜置，取上清液。加乙腈10 mL，同法提取1次，合并上清液。于40 ℃氮?dú)獯抵?～2 mL，加50%乙腈定容至10 mL，用孔徑0.22 μm濾膜濾過，即得。

2.1.3空白對(duì)照 在不加樣品的情況下，同“2.1.2”項(xiàng)操作，得空白對(duì)照溶液。

2.2色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSST3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：5 mmol·L-1甲酸銨溶液(流動(dòng)相A)-乙腈(流動(dòng)相B)，梯度洗脫，0～2 min，98%A；2～3 min，98%A→65%A；3～6 min，65%A→60%A；6～10 min，60%A→15%A；10～11 min，15%A→10%A；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

2.3質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧(electrospray ionization，ESI)；掃描方式：正、負(fù)離子同時(shí)掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)，毛細(xì)管電壓：4000 V(正離子模式)；3500 V(負(fù)離子模式)；氣體溫度：350 ℃；氣體流速：10 L·min-1；8種植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)譜分析條件見表2，倍增管電壓(electron multiplier voltage ，EMV)分段條件見表3。 在上述色譜條件下，對(duì)照品溶液、樣品溶液和空白對(duì)照溶液總離子流圖見圖1～3。MRM離子流圖見圖4。

表2 8種植物生長調(diào)節(jié)劑質(zhì)譜分析參數(shù)

表3 質(zhì)譜分段電壓

1.丁酰肼；2.矮壯素；3.助壯素；4.赤霉素；5.4-硝基苯酚鈉；6.氯吡脲；7.多效唑；8.烯效唑。

圖2 知母樣品總離子流圖

圖3 空白對(duì)照總離子流圖

2.4線性關(guān)系考察 取未檢出8種植物生長調(diào)節(jié)劑的知母樣品，同“2.1.2”項(xiàng)下操作，制成空白基質(zhì)提取液。采用空白基質(zhì)提取液，將“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照溶液稀釋成濃度分別為1000，500，100，50，10，1，0.5，0.1，0.02 ng·mL-1溶液，按“2.2”“2.3”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件分析，以濃度為橫坐標(biāo)、定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表4。

圖4 8種植物生長調(diào)節(jié)劑多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子流圖

表4 8種植物生長調(diào)節(jié)劑線性范圍、檢出限和定量限測(cè)定結(jié)果

2.5定量限與檢測(cè)限考察 精密量取“2.1.1”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，以乙腈倍比稀釋，再按“2.2”“2.3”項(xiàng)條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為 3：1，10：1時(shí)分別得檢測(cè)限、定量限。結(jié)果見表4。

2.6精密度實(shí)驗(yàn) 取“2.4”項(xiàng)50 ng·mL-1混合對(duì)照品溶液，按“2.2”“2.3”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果丁酰肼、矮壯素、助壯素、赤霉素、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、多效唑、烯效唑峰面積RSD分別為1.74%，2.73%，2.73%，2.39%，1.49%，3.13%，2.05%，2.56%(n=6)。表明該儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.6”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液，于室溫下放置0，2，4，6，8，12 h，按“2.2”“2.3”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積。結(jié)果丁酰肼、矮壯素、助壯素、赤霉素、4-硝基苯酚鈉、氯吡脲、多效唑、烯效唑峰面積RSD分別為1.35%，1.88%，2.12%，1.89%，1.33%，2.06%，2.15%，2.11%(n=6)。表明對(duì)照品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取未檢測(cè)出植物生長調(diào)節(jié)劑的知母樣品1.5 g，共6份，分別加入混合對(duì)照品溶液1 mL(濃度10 ng·mL-1)，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.2”“2.3”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析，記錄峰面并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 8種植物生長調(diào)節(jié)劑加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表5 8種植物生長調(diào)節(jié)劑加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.9含量測(cè)定結(jié)果 取30批次知母樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，按照“2.2”“2.3”項(xiàng)方法進(jìn)樣，結(jié)果s2批次矮壯素含量為6.3 μg·kg-1，s26批次矮壯素含量為3.8 μg·kg-1。其余批次均未檢出。

3 討論

3.1色譜條件優(yōu)化 本研究考察了不同色譜柱對(duì)多成分的分離效果和峰形影響。對(duì)比了Agilent Eclipse plus C18RRHD(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，8種待測(cè)組分性質(zhì)差異較大，矮壯素、助壯素、丁酰肼極性較大，T3作為一種親水性色譜柱，對(duì)這3種成分的分離效果更好，但4-硝基苯酚鈉峰形較差。綜合考慮8種成分的分離效果及峰形，最終選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀中，流動(dòng)相通常使用乙腈作為有機(jī)相[13]，為增加離子化效率通常在水相中添加一定濃度甲酸、甲酸銨或乙酸銨等。筆者在本實(shí)驗(yàn)考察了0.1%甲酸、5 mmol·L-1甲酸銨-0.1%甲酸、5 mmol·L-1甲酸銨溶液和5 mmol·L-1乙酸銨溶液。結(jié)果5 mmol·L-1甲酸銨溶液比加入了甲酸的流動(dòng)相對(duì)赤霉素、氯吡脲的響應(yīng)更高，4-硝基苯酚鈉的響應(yīng)稍低，由于赤霉素是響應(yīng)值最低的成分，所以以其為參照最終選取5 mmol·L-1甲酸銨-乙腈作為流動(dòng)相。

3.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化 取混合對(duì)照品溶液(50 ng·mL-1)進(jìn)樣，自動(dòng)優(yōu)化離子源參數(shù)。由于赤霉素和4-硝基苯酚鈉是負(fù)模式，響應(yīng)值較低，進(jìn)行了分段，在第二段加電壓300 V。

3.3提取方式的選擇 本研究同時(shí)考察QuEChERS方法，該法是一種快速、簡便的凈化方法，已被廣泛應(yīng)用于食品中植物生長激素的前處理[14-15]。筆者在本實(shí)驗(yàn)精密稱取知母粉末3 g，采用含有無水硫酸鎂、N-丙基乙二胺固相吸附劑、C18、石墨化炭黑的鹽包進(jìn)行凈化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丁酰肼、矮壯素、助壯素回收率較低，無法達(dá)到分析要求。采用溶劑提取后直接進(jìn)樣，回收率可達(dá)70%，干擾較少且操作簡便。

3.4結(jié)果分析 目前通行的植物生長調(diào)節(jié)劑限量標(biāo)準(zhǔn)主要有4個(gè)：歐盟標(biāo)準(zhǔn)、國際食品法典委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)、日本標(biāo)準(zhǔn)、美國標(biāo)準(zhǔn)[16-17]。我國農(nóng)藥類標(biāo)準(zhǔn)逐步細(xì)化完善，現(xiàn)行有效標(biāo)準(zhǔn)是GB.2763-2016，目前我國規(guī)定小麥、玉米、棉籽中矮壯素最高殘留量分別為5，5，0.5 mg·kg-1，日本規(guī)定茶葉中矮壯素最低殘留限量0.5 mg·kg-1，歐盟委員會(huì)規(guī)定矮壯素最低殘留限量為0.1 mg·kg-1，但均未對(duì)中藥飲片中殘留限量做出明確規(guī)定。參考以上限度規(guī)定，檢出樣品矮壯素含量較低，處于安全范圍內(nèi)。

3.5完善植物生長調(diào)節(jié)劑殘留標(biāo)準(zhǔn)的建議 近年來，植物生長調(diào)節(jié)劑在中藥材種植中被廣泛應(yīng)用，但其對(duì)中藥材質(zhì)量的影響復(fù)雜，也缺乏大量的相關(guān)安全性有效性研究。部分藥農(nóng)為追求高產(chǎn)量高效益，在中藥材種植過程中往往過量使用和不當(dāng)使用。為實(shí)現(xiàn)有效監(jiān)管，有必要對(duì)不同類別植物生長調(diào)節(jié)劑在中藥材中的殘留量帶來的安全性和有效性進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，分等級(jí)完善殘留量標(biāo)準(zhǔn)，科學(xué)指導(dǎo)藥農(nóng)合理應(yīng)用，在安全范圍內(nèi)增產(chǎn)增效。