劉愛瑜，宋艷磊，趙壽培，車大璐，趙俐辰，李曉宇，李伯森，郝云武，高玉紅*，張會(huì)文*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.承德市獸藥管理站，河北 承德 067000；3.寬城縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧工作站，河北 承德 067000）

豆腐渣是以豆類為原料加工豆制品所產(chǎn)生的副產(chǎn)品，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是寶貴的蛋白質(zhì)飼料資源，我國(guó)每年生產(chǎn)約280 萬(wàn)t［1］。因豆腐渣具產(chǎn)量大且營(yíng)養(yǎng)豐富的優(yōu)點(diǎn)，作為動(dòng)物蛋白飼料具有較高的開發(fā)價(jià)值。干豆腐渣替代羔羊精料中的胡麻餅和豆皮可提高其日增重和屠宰率，且降低了飼料成本［2］。但豆腐渣含抗?fàn)I養(yǎng)因子（胰蛋白酶抑制素、皂素等），且難貯存，容易氧化酸敗，導(dǎo)致目前其利用率不高，僅5%~15%，造成飼料資源的浪費(fèi)［1］。如何開發(fā)再利用豆腐渣成為當(dāng)下的研究熱門。

目前我國(guó)正面臨飼料原料尤其是蛋白質(zhì)原料緊缺的難題，豆腐渣作為蛋白飼料資源的開發(fā)和利用在某種程度上可以緩解飼料供應(yīng)不足的現(xiàn)狀。微生物發(fā)酵工藝可以提升豆腐渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，降解抗?fàn)I養(yǎng)因子。已報(bào)道的關(guān)于豆腐渣發(fā)酵研究均采用酵母菌、乳酸菌、光合菌和放線菌等復(fù)合菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵的產(chǎn)品飼喂豬［3］、牛［4］和羊［5］等家畜后顯著提高了其生產(chǎn)性能。酵母菌和乳酸菌是食品發(fā)酵工藝中常用的菌類。酵母菌能使豆腐渣中部分醛類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇、酸、酯等物質(zhì)，賦予豆渣特殊的香氣［6-7］，而乳酸菌具較強(qiáng)的代謝碳水化合物產(chǎn)酸能力，可提升豆腐渣纖維的品質(zhì)［8-9］。芽孢桿菌作為飼料發(fā)酵的另一種重要微生物，因其繁殖速度快，抗逆性比較強(qiáng)，且能夠分泌較為豐富的酶系，常被應(yīng)用于豆粕、玉米秸稈和小麥麩皮等的發(fā)酵工藝中［10-12］，但芽孢桿菌用于豆腐渣發(fā)酵的研究很少。本研究選用枯草芽孢桿菌、釀酒酵母菌和植物乳酸桿菌3 種來源廣泛、成本低且發(fā)酵效果好的菌劑，通過單一和兩兩復(fù)合、三種復(fù)合的發(fā)酵方式研究豆腐渣發(fā)酵的效果，篩選適宜的發(fā)酵菌劑及復(fù)合類型，為畜牧生產(chǎn)中豆腐渣的發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料

新鮮豆腐渣來源于河北省保定市豆腐加工廠，實(shí)測(cè)含水量94.10%。

1.1.2 發(fā)酵菌株

試驗(yàn)采用的發(fā)酵菌株為河北農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，Bs）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）和釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae，Sc）。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母菌的培養(yǎng)基選擇YEPD 固體培養(yǎng)基和YEPD 肉湯培養(yǎng)基；植物乳酸桿菌的培養(yǎng)基為MRS 固體培養(yǎng)基和MRS 肉湯培養(yǎng)基；枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B 固體培養(yǎng)基和LB 液體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 發(fā)酵菌的擴(kuò)增培養(yǎng)

根據(jù)培養(yǎng)基配方將培養(yǎng)基溶解并滅菌，然后進(jìn)行發(fā)酵菌的擴(kuò)增培養(yǎng)，操作步驟如下：

（1）制備MRS、YPD 和LB 固體斜面培養(yǎng)基；

（2）將保藏的Bs、Lp 和Sc 菌種轉(zhuǎn)移到斜面固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d；

（3）制備MRS、YPD 和LB 液體培養(yǎng)基；

（4）從斜面固體培養(yǎng)基挑取一環(huán)菌落轉(zhuǎn)移至5 mL 液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)1 d；

菌液變渾濁后，將液體培養(yǎng)基內(nèi)的菌液轉(zhuǎn)移至200 mL 三角瓶中進(jìn)行擴(kuò)增，適溫下震蕩培養(yǎng)1 d。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)8 組，7 組為加菌發(fā)酵組，其菌劑添加量為鮮豆腐渣重量的1%，各組菌劑添加量如表1所示，1 組為對(duì)照組，不添加任何菌劑組。豆腐渣發(fā)酵采用10 號(hào)（240 mm×340 mm）封口袋，排盡空氣后密封，于恒溫培養(yǎng)箱中30℃發(fā)酵5 d，每隔24 h 采集一次樣品進(jìn)行測(cè)定。每組均設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 袋，每次采樣取3 袋，每袋30 g 新鮮豆腐渣。

表1 試驗(yàn)分組及發(fā)酵菌劑添加量Table 1 The grouping of experiments and supplemental levels offermentation microbial

1.2.2 豆腐渣的發(fā)酵

豆腐渣發(fā)酵的操作過程如下：

（1）取新鮮豆腐渣于65 ℃烘箱中烘干至含水量60%，然后依試驗(yàn)設(shè)計(jì)分組；

（2）接種復(fù)壯后的Sc、Lp 和Bs（菌懸液濃度均約106CFU?mL-1），進(jìn)行單一、兩兩復(fù)配及三者復(fù)配發(fā)酵（復(fù)合菌種配比為1∶1 和1∶1∶1），接種量為鮮豆腐渣重量的1%；

（3）加菌發(fā)酵組按菌劑∶紅糖＝1∶1 的比例加入紅糖，均勻混合；

（4）將豆腐渣裝入密封袋，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱密封發(fā)酵5 d；

（5）每隔24 h 取豆腐渣樣品，4 ℃冷藏待測(cè)常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 發(fā)酵豆腐渣的物理評(píng)價(jià)

采用感官評(píng)價(jià)法對(duì)8 組發(fā)酵豆腐渣的顏色、氣味和滋味等物理指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)［13］。評(píng)價(jià)小組由10位（5 位男生和5 位女生）評(píng)價(jià)員組成，從非常好（8~10 分）、好（6~8 分）、較好（4~6 分）、一般（2~4分）、差（2 分以下）5 個(gè)等級(jí)進(jìn)行評(píng)分，各指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及權(quán)重見表2。

表2 發(fā)酵豆腐渣感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of fermented tofu residue

1.3.2 發(fā)酵豆腐渣營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

測(cè)定發(fā)酵豆腐渣樣品養(yǎng)分含量。干物質(zhì)（DM）、粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、鈣（Ca）、磷（P）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》［14］中的方法進(jìn)行測(cè)定。DM 含量測(cè)定采用烘干恒重法；CP 含量測(cè)定應(yīng)用半自動(dòng)凱氏定氮儀（Kjeltec 8400，F(xiàn)OSS，丹麥）采用凱氏定氮法；EE含量測(cè)定采用索氏提取法；Ca 含量測(cè)定采用高錳酸鉀法；P 含量測(cè)定采用鉬黃分光光度法；參照Van Soest 法［15］借 助 半 自 動(dòng) 纖 維 儀（ANK-OM A2000i，ANKOM，美國(guó)）測(cè)定NDF 和ADF 含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間豆腐渣的營(yíng)養(yǎng)成分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測(cè)量多因素方差分析，對(duì)豆腐渣發(fā)酵前后養(yǎng)分含量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，差異顯著采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐渣發(fā)酵后的物理特性

豆腐渣發(fā)酵前和發(fā)酵5 d 的顏色變化如圖1 所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，豆腐渣的顏色逐漸加深，由正常的乳白色逐漸變?yōu)樽攸S色，發(fā)酵第5 天豆腐渣顏色最深，加菌的試驗(yàn)組豆腐渣顏色均較對(duì)照組深。另外，從發(fā)酵第2 天開始，豆腐渣逐漸散發(fā)酸香味，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵香味越來越濃。發(fā)酵豆腐渣感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表3 所示。兩兩復(fù)合和三者復(fù)合的發(fā)酵菌組豆腐渣顏色、氣味和滋味評(píng)分均顯著高于單一菌組和對(duì)照組（P<0.01）。評(píng) 價(jià) 總 分 排 序 為：G 組>F 組>D 組>E 組>C 組>B 組>A 組>對(duì) 照 組，三 種 菌 復(fù) 合 組（G 組）總分均顯著高于其它組（P<0.01），對(duì)照組總分顯著低于其它組（P<0.01），單一菌發(fā)酵以C組效果好，顯著優(yōu)于A 組（P<0.01），兩兩復(fù)合發(fā)酵以F 組效果最好，顯著優(yōu)于E 組（P<0.05）。

表3 發(fā)酵豆腐渣感官評(píng)價(jià)Table 3 Sensory evaluation of fermented tofu residue 分

圖1 豆腐渣發(fā)酵前和發(fā)酵后的顏色變化Fig.1 Color change of tofu residue before fermentation and 5 days after fermentation

2.2 不同發(fā)酵時(shí)間豆腐渣營(yíng)養(yǎng)成分的變化

不同菌發(fā)酵對(duì)豆腐渣各種營(yíng)養(yǎng)含量的影響結(jié)果如圖2 所示。由圖2A、D、H 可見，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組CP、P 和DM 的含量均呈上升趨勢(shì)，以復(fù)合菌發(fā)酵效果最為顯著，E、F 和G 組CP 含量顯著高于其它組（P<0.01），而E 和G 組的P 含量顯著高于其它組（P<0.05），且表現(xiàn)為發(fā)酵2 d 后呈顯著性增加趨勢(shì)（P<0.05），尤其3 種菌發(fā)酵的G 組效果最好；從圖2B、C 可以看出，各組EE 和Ca的含量均呈上升趨勢(shì)，其含量最高分別可達(dá)5.62%和0.82%。其中，E、F、G 組的EE 和Ca 含量顯著高于其它組（P<0.05），且發(fā)酵2 d 和5 d 的EE 含量顯著增加（P<0.05），發(fā)酵3 d 的Ca 含量顯著增加（P<0.05）；由圖2E、F 可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各組ADF 和NDF 的含量呈下降趨勢(shì)，E、F、G 組 發(fā) 酵2~5 d 的NDF 和 發(fā) 酵3~5 d 的ADF 含量呈顯著降低趨勢(shì)（P<0.05）；從圖2G 可以看出，不同菌劑對(duì)發(fā)酵豆腐渣Ash 含量的影響較小，各組間Ash 含量未表現(xiàn)出顯著性差異（P>0.05）。

圖2 豆腐渣發(fā)酵過程中營(yíng)養(yǎng)成分的變化規(guī)律Fig.2 Nutrient change during tofu residue fermentation

豆腐渣發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分的比較如表4 所示。與發(fā)酵前（未發(fā)酵）新鮮豆腐渣相比，通過5 d 發(fā)酵，3 種菌單一或復(fù)合發(fā)酵的豆腐渣中DM、CP、EE、Ca 和P 含量均顯著提高（P<0.01），3 種菌復(fù)合發(fā)酵組（G 組）相比其他組發(fā)酵效果好，較發(fā)酵前分 別 提 高8.04%（DM）、1.85%（CP）、4.92%（EE）、0.49%（Ca）和0.38%（P）（P<0.05），而NDF 和ADF 含量均顯著降低（P<0.01），較發(fā)酵前分別降低16.43%和5.79%，Ash 含量發(fā)酵前后無顯著差異（P>0.05）。不加菌的對(duì)照組發(fā)酵前和發(fā)酵后相比，DM、CP、EE、Ca 和P 含量均顯著提高（P<0.01），較發(fā)酵前分別提高5.28%、0.41%、2.24%和0.21%，NDF 和ADF 含量均顯著降低（P<0.01），較發(fā)酵前分別降低7.25%和3.09%，對(duì)照組Ash 含量發(fā)酵前后無顯著差異（P>0.05）。

表4 豆腐渣發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分比較Table 4 Nutrients Comparison of tofu residue before and after fermentation

3 討論

復(fù)合菌的發(fā)酵效果優(yōu)于單一菌，很可能因?yàn)榘l(fā)酵豆腐渣是經(jīng)過復(fù)合菌混合厭氧發(fā)酵，其中的酵母菌和芽孢桿菌等好氧菌的存在為乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖創(chuàng)造了厭氧環(huán)境［16］，研究發(fā)現(xiàn)，酵母菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酒香味或蘋果芳香味，增加豆腐渣風(fēng)味，且豆腐渣顏色隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)不斷加深，酚類物質(zhì)是產(chǎn)生樣品黃色色調(diào)的主要來源，豆腐渣經(jīng)菌劑發(fā)酵后會(huì)產(chǎn)生酚類物質(zhì)，因此黃色不斷加深［17-18］。

豆腐渣由于抗?fàn)I養(yǎng)因子的存在，營(yíng)養(yǎng)成分的利用率并沒有達(dá)到理想效果，而微生物發(fā)酵作為一種新型的飼料處理方式，有利于豆腐渣CP、EE、Ca 和P 等養(yǎng)分的有效利用率提高。本實(shí)驗(yàn)中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，不管單一菌還是復(fù)合菌發(fā)酵，豆腐渣的營(yíng)養(yǎng)成分均發(fā)生了變化，豆腐渣發(fā)酵過程中，由于微生物的生長(zhǎng)繁殖需要一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，菌與原材料接觸時(shí)間越長(zhǎng)，作用時(shí)間越久，菌自身增殖越多，相互作用產(chǎn)生代謝產(chǎn)物越多，從而造成豆腐渣成分發(fā)生持續(xù)的改變［19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，經(jīng)發(fā)酵的豆腐渣中DM、CP、EE、Ca 和P 等含量均顯著提高，發(fā)酵5 d 后CP 含量顯著提高，由14.15%增至16.00%，提高了1.85%，可能的原因是由于發(fā)酵過程中微生物將豆腐渣中的CP 轉(zhuǎn)化為家畜更易利用的菌體蛋白，同時(shí)也消耗了碳水化合物，最終導(dǎo)致發(fā)酵CP 含量的升高，另外，發(fā)酵后豆腐渣的DM、Ca 和P 含量可表現(xiàn)出增加趨勢(shì)，也可能與糖和脂類等有機(jī)物在發(fā)酵過程中消耗而引起礦物質(zhì)累積有關(guān)。微生物在生長(zhǎng)代謝過程中消耗能量，使能量物質(zhì)減少，而豆腐渣中Ca 和P 在DM 中的比例則相對(duì)提高［20-21］，且發(fā)酵過程中Ca和P 元素借助菌劑發(fā)酵固化于飼料原料中，因此其含量增加［22］，而豆腐渣中纖維含量降低可能是因?yàn)榫鷦┓磻?yīng)中產(chǎn)生的纖維素酶以豆腐渣中的纖維為原料進(jìn)行降解，菌體在生長(zhǎng)繁殖過程中會(huì)產(chǎn)生

多種代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生了將纖維和碳水化合物降解為單糖的纖維素酶，因而脂肪含量下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，豆腐渣CP 含量在發(fā)酵2 d 后顯著增加，ADF 和NDF 分別在第2 d 和第3 d 顯著下降，羅文等［23］研究認(rèn)為，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h 時(shí)，豆腐渣和蘋果渣混合飼料CP 的含量增加，ADF 和NDF 含量降低，這與本研究結(jié)果一致，說明隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，微生物能夠利用基質(zhì)中不溶性纖維素進(jìn)行繁殖和代謝，蛋白質(zhì)含量逐漸增加。

不同菌劑發(fā)酵原理及發(fā)酵效果存在一定的差異。豆腐渣中添加枯草芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，一些代謝產(chǎn)物如高活性的蛋白酶和纖維素酶將會(huì)產(chǎn)生，將豆腐渣中的CP、NDF、ADF 等大分子養(yǎng)分酶解成還原糖、功能性小肽和氨基酸，而且微生物會(huì)在發(fā)酵過程中利用糖類物質(zhì)合成菌體蛋白，且其分解產(chǎn)物的重新組合和微生物菌體的自溶作用可以產(chǎn)生新的營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［24］。乳酸菌作為一種革蘭氏陽(yáng)性菌，在有氧和無氧條件下均能生長(zhǎng)繁殖，常被用作飼料工業(yè)中的發(fā)酵菌劑。利用乳酸菌發(fā)酵飼料時(shí)，除具有降解大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，還能降低pH，使有害微生物的生長(zhǎng)受到抑制，利于飼料中養(yǎng)分的保存［25］。王寧等［26］研究認(rèn)為，豆腐渣在發(fā)酵前期可以快速形成酸性環(huán)境，有效抑制霉菌、梭菌和腐敗菌等有害微生物的繁殖，可抑制CP 的降解，減少CP 損失，這與本研究結(jié)果一致。也有研究認(rèn)為［27］，乳酸菌發(fā)酵飼料還可以產(chǎn)生多肽、有機(jī)酸、維生素、氨基酸、功能性活性肽以及未知生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以提升飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。另外，本研究中采用的另外一種發(fā)酵菌—釀酒酵母菌也是食品和飼料加工中比較受歡迎的發(fā)酵菌劑，采用該菌對(duì)飼料進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，可將糖類分解為酒精和二氧化碳，產(chǎn)生酒香味，刺激動(dòng)物采食欲望，還可通過自身繁殖來增加飼料原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，進(jìn)而提升飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［18］。也有研究指出［28-29］，發(fā)酵飼料過程中酵母菌可以吸收飼料表面氧氣，促進(jìn)厭氧真菌生長(zhǎng)繁殖，增加纖維降解菌的數(shù)量，提高飼料中NDF 和ADF 的降解率，這與本研究中豆腐渣發(fā)酵后NDF 和ADF 含量顯著下降相吻合。雖然單菌發(fā)酵在某種程度上可以改善飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，但多菌復(fù)合發(fā)酵可以發(fā)揮不同菌的各自優(yōu)勢(shì)，彌補(bǔ)單菌發(fā)酵的不足，甚至可能會(huì)有一定的加和效應(yīng)，進(jìn)而更好地提升飼料品質(zhì)。本研究中3 種菌來源廣泛，成本較低，且發(fā)酵過程簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，便于畜牧場(chǎng)/養(yǎng)殖戶的現(xiàn)場(chǎng)操作，具有一定的實(shí)用性，且隨著2020 年國(guó)家啟動(dòng)的“飼料端禁抗、養(yǎng)殖端減抗限抗”政策，畜禽的健康水平已經(jīng)受到諸多關(guān)注，發(fā)酵豆腐渣可能會(huì)由于其含益生菌、酶及其他生物活性物質(zhì)從而改善畜禽消化道環(huán)境，提升畜禽的健康水平，這將是我們下一步要開展的研究。

4 結(jié)論

新鮮豆腐渣添加1% Bs、Lp 和Sc 進(jìn)行單一或復(fù)合發(fā)酵明顯改善了其感官指標(biāo)，表現(xiàn)為顏色變黃、氣味酸香；發(fā)酵顯著提高了豆腐渣的CP、EE、Ca 和P 等 養(yǎng) 分 含 量，降 低 了NDF 和ADF 含 量，且復(fù)合菌較單一菌發(fā)酵效果好，尤其Bs+Lp+Sc 三菌聯(lián)合發(fā)酵豆腐渣效果最佳。