楊 凡，牛莉莉，唐艷領(lǐng)，馬 凱，王晨陽，米國全，孫天梅，史宣杰*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南鄭州 450002；3.鄧州市農(nóng)技推廣中心，河南鄧州 474150）

黃瓜具有良好的藥用和食用價值，在我國有悠久的種植歷史。目前，黃瓜種植已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)中的主要組成部分和實現(xiàn)農(nóng)民增收、農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展及鄉(xiāng)村振興的重要支柱，保障了市民“菜籃子”的生態(tài)健康、豐富多彩和有效供給。隨著產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和人們需求的增多，黃瓜種植面積和范圍不斷擴(kuò)大，由此引發(fā)的連作頻率增加，土傳病害日趨嚴(yán)重，成為阻礙黃瓜生產(chǎn)的主要因素。黃瓜枯萎病素有“植物癌癥”之稱，具有全球性，是威脅黃瓜的主要土傳病害之一[1]，在黃瓜整個生長期均能發(fā)病，發(fā)病率一般在10%～30%，嚴(yán)重時可達(dá)85%，甚至絕收，極大地制約了黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[2-3]。目前，生產(chǎn)上主要以化學(xué)防治為主，但極易造成病原菌耐藥、產(chǎn)品及土壤殘留農(nóng)藥、微生物系統(tǒng)紊亂、生態(tài)環(huán)境遭破壞等諸多問題，嚴(yán)重地影響了黃瓜的安全生產(chǎn)和可持續(xù)發(fā)展。相比之下，利用微生物防治蔬菜病蟲害，因成本低、來源廣、環(huán)境友好等越來越受種植戶青睞[4]。

近年來，人們采用木霉菌、芽孢桿菌等微生物抑制黃瓜枯萎病取得顯著成效。高長敏等[5]研究發(fā)現(xiàn)木霉可以降低黃瓜幼苗膜脂過氧化，提高幼苗抵抗枯萎病的能力，促進(jìn)幼苗生長。趙文娟等[6]實驗結(jié)果表明，枯草芽胞桿菌和解淀粉芽胞桿菌對黃瓜枯萎病有明顯的防效，主要是抑制病原菌菌絲和芽管的生長。路丹丹[7]利用龜裂鏈霉菌防治黃瓜枯萎病，可使病情指數(shù)下降到20.0，防效達(dá)72.1%。Moharam 等[8]通過利用印度梨形孢處理黃瓜種子，發(fā)現(xiàn)其可顯著降低黃瓜枯萎病的發(fā)生率。叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能寄生在地球上90%以上的陸生植物，通過菌絲及代謝產(chǎn)物促進(jìn)植株發(fā)育、抵御病蟲害等。有研究表明接種叢枝菌根真菌可以降低黃瓜根腐病、根結(jié)線蟲的危害，但在黃瓜枯萎病及其苗期的研究鮮有報道[9-11]。

蔬菜育苗移栽是蔬菜生產(chǎn)上提高綜合效益的關(guān)鍵技術(shù)[12]。中央一號文件及國務(wù)院聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制多次強(qiáng)調(diào)要大力發(fā)展工廠化育苗，縮短蔬菜生長周期，夯實“菜籃子工程”[13]。本研究在育苗基質(zhì)中通過添加有益微生物菌劑，研究叢枝菌根真菌與鐮刀菌互作條件下黃瓜抗枯萎病及生理生化指標(biāo)變化情況，從而在源頭上探索抑制病害發(fā)生、提高商品苗率的措施，為叢枝菌根真菌防治黃瓜枯萎病及育苗壯苗技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試黃瓜品種為‘博杰605’，購自河南省慶發(fā)種業(yè)有限公司。

供試菌株AMF 為摩西球囊霉菌（Glomus mosseae，Gm3-2），黃瓜枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.,FOX37-8），菌種由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所蔬菜設(shè)施與栽培研究室保存。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）。育苗基質(zhì)由歐博亞泥炭、珍珠巖和蛭石自行配制，質(zhì)量比為6∶3∶1，添加不同濃度的Gm3-2。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2020 年6—10 月在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地育苗溫室車間內(nèi)進(jìn)行。試驗設(shè)5 個處理，具體見表1。

表1 實驗處理Table 1 Experimental treatment

黃瓜育苗采用40 穴穴盤育苗，30 盤為1 個處理，重復(fù)3 次?！┙?05’種子催芽露白以后，采用106孢子/mLFOX37-8菌液浸種5 min，然后一穴一粒播種，其中CK1對照的種子采用無菌水浸種5 min。

1.3 摩西球囊霉菌Gm3-2 孢子的制備

采用滅菌的育苗基質(zhì)（歐博亞泥炭∶珍珠巖∶蛭石=6∶3∶1），通過三葉草工廠化育苗擴(kuò)繁3 個月，收集培養(yǎng)的摩西球囊霉菌育苗基質(zhì)。取1 g 育苗基質(zhì)配制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板記錄懸浮液的孢子數(shù)，并將孢子懸浮液稀釋成105、106、107孢子/g。按照1∶100（V懸浮液∶V基質(zhì)）加入到配置好的育苗基質(zhì)中，待用。

1.4 病原菌FOX37-8 孢子懸浮液的制備

將黃瓜枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌FOX37-8在PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm 的菌餅3 塊，接種在含有100 mL PDB 培養(yǎng)基的250 mL 的三角瓶中，25 ℃下250 r/min 振蕩培養(yǎng)5 d，得到孢子懸浮液。用血球計數(shù)板記錄孢子懸液的孢子數(shù)，并將孢子懸浮液稀釋至106孢子/mL，備用。

1.5 測定指標(biāo)與方法

試驗于播種后15 d 取樣進(jìn)行黃瓜抗病性指標(biāo)、幼苗質(zhì)量指標(biāo)及相關(guān)防御性酶指標(biāo)的測定。

1.5.1 抗病性指標(biāo)

抗病性指標(biāo)包括植株發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。黃瓜苗期枯萎病參照張素平[14]、宿曉琳等[15]的分級標(biāo)準(zhǔn)，0 級：無癥狀；1 級：真葉、子葉黃化或萎蔫面積不超過總面積的50%；2 級：真葉、子葉黃化或萎蔫面積超過總面積的50%；3 級：葉片萎蔫或枯死，僅生長點存活；4級：全株嚴(yán)重萎蔫，以致枯死。

病情指數(shù)和防治效果參照宗兆鋒等[16]的計算方法，具體見式（1）（2）。

1.5.2 幼苗質(zhì)量指標(biāo)

幼苗質(zhì)量指標(biāo)包括莖粗、株高、根體積、地上部/地下部鮮質(zhì)量或干質(zhì)量、壯苗指數(shù)、葉綠素含量等。其中莖粗采用游標(biāo)卡尺測定子葉節(jié)下1 cm 處的粗度；株高采用直尺測定黃瓜幼苗莖基部到生長點之間的距離；根體積采用排水法測定。

地上部/地下部鮮質(zhì)量的測定：植株清洗干凈，吸干表面水分，用1/1 000 電子天平測定鮮質(zhì)量。植株鮮樣在105 ℃殺青15 min 后，70 ℃烘至恒質(zhì)量，用1/1 000 電子天平測定干質(zhì)量。

壯苗指數(shù)參照張凱等[17]計算方法，具體見式（3）。

采用分光光度法測定植株葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量。

1.5.3 相關(guān)防御性酶指標(biāo)

植株防御性保護(hù)酶如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）及丙二醛（MDA）等在植物抗逆抗病中起重要作用。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定；參照劉新[18]的方法測定植物防御性保護(hù)酶的酶活力，分別以D290nm、D470nm、D410nm值變化0.01 為1 個PAL、POD 和PPO 的酶活力單位，U；根系活力采用氯化三苯基四氮唑（TTC）還原法測定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行圖表制作，利用DPS 7.05 進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 叢枝菌根真菌對黃瓜枯萎病抑制效果的影響

由表2（見下頁）知，黃瓜播種15 d 后，接種摩西球囊霉菌Gm3-2孢子的黃瓜植株發(fā)病率、發(fā)病程度及防治效果和CK2 存在顯著性差異。CK2 組的患病植株最多，葉片萎蔫，莖部縊縮有水漬浸出，生長緩慢或枯死，發(fā)病率高達(dá)96.4%。而接種摩西球囊霉菌Gm3-2孢子的黃瓜植株生長迅速，莖桿粗壯，患病植株較少，發(fā)病程度較弱。從發(fā)病率的角度看，接種107孢子/gGm3-2基質(zhì)（A3）的黃瓜枯萎病發(fā)病率最低，僅有12.4%，對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)到80.3%；接種105孢子/g（A1）和106孢子/g（A2）Gm3-2基質(zhì)的黃瓜枯萎病發(fā)病率分別為26.9%和13.2%。

表2 叢枝菌根真菌不同濃度處理對黃瓜枯萎病抑制效果Table 2 Control effect of AMF different treatments on cucumber fusarium wilt

2.2 叢枝菌根真菌對黃瓜壯苗指標(biāo)的影響

從表3 可以看出，添加叢枝菌根真菌可以促進(jìn)黃瓜幼苗生長，使其莖粗和株高都有所增加。處理A1、A2 和A3 莖粗分別比對照CK2 提高了11.22%、29.76%和26.10%，株高則分別增加了25.76%、34.62%和33.14%。未接種叢枝菌根真菌CK1 和CK2 間莖粗和株高均無顯著性差異。處理A1、A2 和A3 壯苗指數(shù)皆高于對照CK1 和CK2，且均存在顯著性差異，和未接種叢枝菌根真菌的CK1處理相比，壯苗指數(shù)分別提高了24.39%、46.34%和46.34%。這說明接種叢枝菌根真菌可以促進(jìn)黃瓜幼苗生長。

表3 叢枝菌根真菌不同濃度處理對黃瓜幼苗質(zhì)量的影響Table 3 Effects of AMF different treatments on quality of cucumber seedlings

2.3 叢枝菌根真菌對黃瓜幼苗根系的影響

接種叢枝菌根真菌的處理A1、A2 和A3，最大側(cè)根長均大于10 cm，和未接種叢枝菌根真菌的CK1、CK2 處理存在顯著差異，見表4。與CK2 最大側(cè)根長相比，處理A1、A2、A3 和CK1 分別增加60.22%、62.45%、61.21%和20.57%。處理A2 根系活力最高，和CK1 和CK2 相比，顯著提高46.30%和102.56%，說明叢枝菌根真菌可以促進(jìn)黃瓜幼苗根系生長，提高黃瓜幼苗根系活力。

表4 叢枝菌根真菌不同濃度處理對黃瓜根系活力的影響Table 4 Effects of AMF different treatments on root activity of cucumber

2.4 叢枝菌根真菌對幼苗葉片色素含量的影響

接種叢枝菌根真菌處理的A1、A2 和A3，其黃瓜幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量均高于未接種叢枝菌根真菌處理的（見表5）。當(dāng)處理A2 接種濃度為106孢子/g 時，黃瓜幼苗葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素含量最高，且與對照相比差異顯著。這表明叢枝菌根真菌可以促進(jìn)葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的合成，以106孢子/g 處理的最好。

表5 叢枝菌根真菌不同處理對黃瓜葉片葉綠素含量影響Table 5 Effects of AMF different treatments on chlorophyll content of cucumber seedling leaves

2.5 叢枝菌根真菌對黃瓜防御性酶活性的影響

從表6 可以看出，接種叢枝菌根真菌的處理A1、A2和A3，其黃瓜幼苗防御性酶PAL、PPO、POD 的酶活均高于未接種叢枝菌根真菌處理的。與CK2 相比，處理A1、A2 和A3 的PAL 活性分別高58.16%、82.32%和77.56%。而MDA 則顯著低于未接種叢枝菌根真菌處理的，分別低42.31%、44.87%和44.13%。

表6 叢枝菌根真菌不同濃度處理對黃瓜防御性酶活性影響Table 6 Effects of AMF different treatments on activities of defensive enzymes in cucumber

3 討論與結(jié)論

近年來，采用生防菌劑抑制黃瓜枯萎病取得了顯著成效[5,15,19]。如朱廷恒等[20]試驗表明木霉菌可以有效防治黃瓜枯萎病，其防效高達(dá)76%左右。徐韶等[21]采用枯草芽孢桿菌和木霉菌劑混合，防治甜瓜枯萎病效果極佳。大量研究表明，叢枝菌根真菌利用菌絲侵染植物根部形成共生，可以促進(jìn)植物生長，增強(qiáng)其抗逆性和抗病性[9]。秦海濱等[22]接種叢枝菌根真菌后可以有效降低黃瓜苗期對立枯病的發(fā)病率，同時促進(jìn)植物地上部和地下部生長。

本試驗結(jié)果表明接種107孢子/g 的摩西球囊霉菌Gm3-2的黃瓜幼苗發(fā)病率僅有12.4%，對黃瓜枯萎病的防效達(dá)80.3%，防效和CK2 對照存在顯著性差異。接種叢枝菌根真菌的處理A1、A2 和A3 幼苗莖粗和株高顯著高于未接種叢枝菌根真菌的黃瓜幼苗，壯苗指數(shù)增加24.3%～87.5%。說明叢枝菌根真菌在和病原菌互作條件下，仍可促進(jìn)黃瓜幼苗生長和壯苗，提高黃瓜商品苗的質(zhì)量。

穴盤苗根系發(fā)育空間小，而黃瓜又屬于淺根作物，能否持續(xù)穩(wěn)定吸收基質(zhì)水肥是培育壯苗的關(guān)鍵。根系活力是衡量植株健康生長發(fā)育的主要指標(biāo)。接種不同濃度的叢枝菌根真菌均可以提高黃瓜幼苗的最大側(cè)根長、根體積和根系活力。處理A2 最大側(cè)根長和根系活力與CK2相比，分別增加了62.45%和102.56%，表明叢枝菌根真菌可以促進(jìn)幼苗的根系發(fā)育，增大根系接觸面積，提高黃瓜幼苗根系活力，加速根系對營養(yǎng)元素和礦物質(zhì)的吸收，這對于培育黃瓜壯苗非常有利。

苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、多酚氧化酶及丙二醛等酶的活性可作為植物抗逆和抗病能力的生理指標(biāo)。植株遭受逆境或受到病原菌攻擊后，會誘導(dǎo)植物發(fā)生防御性反應(yīng)，減少活性氧對植物細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，提高植物免疫力[23]。本研究得出，接種叢枝菌根真菌的黃瓜PAL、POD 和PPO 防御酶活性相比未接種菌劑的黃瓜處理都有不同程度的提高，說明叢枝菌根真菌可以緩解黃瓜幼苗遭受逆境和病原菌的脅迫，有效提高黃瓜幼苗抗逆抗病能力。這和季倩茹等[24]利用芽孢桿菌防治黃瓜枯萎病結(jié)果基本一致。本實驗接種叢枝菌根真菌的處理可以顯著降低MDA 含量，減少病原菌或逆境條件下對植物細(xì)胞的傷害，這和高長敏等[5]利用木霉抗黃瓜枯萎病、降低丙二醛含量的結(jié)果一致。

叢枝菌根真菌可以在侵染植物根部大量繁殖，調(diào)節(jié)微生物環(huán)境，促生抗病。本試驗?zāi)M黃瓜生產(chǎn)中的育苗環(huán)節(jié)，研究了叢枝菌根真菌對黃瓜抗枯萎病及促苗壯苗的作用，結(jié)果表明當(dāng)基質(zhì)中叢枝菌根真菌孢子濃度為106孢子/g 時，叢枝菌根真菌可顯著降低枯萎病原菌對黃瓜幼苗膜脂過氧化程度，抑制枯萎病的發(fā)生，促進(jìn)壯苗，這為合理利用生物技術(shù)培育壯苗提供了科學(xué)方法。下一步將加大對叢枝菌根真菌在育苗過程中調(diào)控根部微環(huán)境、促生抗病機(jī)理方面研究。