劉令令，段飛，杜巧婷，崔晨輝

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

幽門螺桿菌是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋線彎曲，定植于胃黏膜上皮細(xì)胞的一種需氧的革蘭陰性桿菌[1]，被世界衛(wèi)生組織列為第一類致癌因子[2]。幽門螺桿菌在全世界各地感染率高達(dá)50%[3]，傳播方式多樣且傳染力強(qiáng)[4]。幽門螺桿菌感染與多種消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生關(guān)系密切，如幽門螺桿菌陽性可導(dǎo)致消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌等[5-6]。因此，幽門螺桿菌感染是影響消化系統(tǒng)健康狀況的主要誘因。慢性胃炎是由各種病因引起的胃黏膜慢性炎癥，其中由幽門螺桿菌感染引起的慢性胃炎稱為幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎，幽門螺桿菌的感染是該病發(fā)生的主要誘因[7]。目前，臨床上幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的治療主要采用抗生素，療效確切，但是依賴抗生素會使得病菌耐藥性增強(qiáng)，用藥療效下降[8]。

中醫(yī)藥治療幽門螺桿菌感染有獨特的優(yōu)勢[9]。幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎屬中醫(yī)“胃脘痛”“痞滿”范疇[10]。其是由脾胃損傷，脾氣虛，脾不健運(yùn)，濕阻中焦，脾失升清，胃失和降，濕邪郁久化生為熱所致，病機(jī)主要為虛實相存、寒熱錯雜、升降失調(diào)，致心下痞滿、嘔吐、脘痛、反酸等[11]。因此，中醫(yī)治療應(yīng)以調(diào)暢氣機(jī)、平寒調(diào)熱、清熱和胃、降逆止嘔、消痞散結(jié)為主要治則[12]。有研究報道，加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎作用顯著[13]。

中藥具有多成分、多靶點、多途徑的復(fù)雜作用特征[14]。這種復(fù)雜性使得中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚，在臨床用藥以及在新藥的開發(fā)方面帶來了許多的局限性。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，從整體的角度探究藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)，在一定程度上解決了單靶點機(jī)制通路難以解釋中藥多成分、多靶點協(xié)同作用的問題，使中藥藥物研發(fā)具有可預(yù)測性[15]，為中醫(yī)從經(jīng)驗醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化為循證醫(yī)學(xué)提供新的范例[16]。因此，本研究根據(jù)世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會發(fā)布的《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價方法指南》[17]，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用進(jìn)行分析，預(yù)測其潛在作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫和軟件詳見表1。

表1 運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫和軟件

1.2 加減半夏瀉心湯化合物與靶標(biāo)獲取運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP)獲取中藥相應(yīng)的化合物。以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug likeness，DL)≥0.18，半衰期(half-life，HL)≥4 h為條件進(jìn)行化合物篩選。并運(yùn)用TCMSP查找篩選所得化合物對應(yīng)的靶標(biāo)信息，將所得靶標(biāo)信息中的PubChem CId搜索到Canonical SMILES，之后進(jìn)入Swiss Target Prediction將靶點的“相關(guān)靶點(Related targets)”統(tǒng)一轉(zhuǎn)化成基因名。

1.3 幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎基因獲取以“Helicobacter Pylori-Associated Gastritis”為關(guān)鍵詞從Gene Cards數(shù)據(jù)庫和疾病-基因組合DisGeNET 數(shù)據(jù)庫，搜索已發(fā)表過的與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎有關(guān)的基因，刪除重復(fù)基因和假陽性基因，與加減半夏瀉心湯中藥復(fù)方藥物基因進(jìn)行匹配，搜集兩數(shù)據(jù)的交集。

1.4 構(gòu)建“疾病-中藥-化合物-交集靶標(biāo)(基因)”網(wǎng)絡(luò)將中藥復(fù)方藥物有效成分、有效成分所對應(yīng)的靶點以及幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎疾病對應(yīng)的靶點輸入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。在網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(node)代表藥物以及其有效活性成分、疾病、靶點等；邊(edge)分別代表藥物與活性成分、活性成分與活性成分作用靶點、疾病與活性成分作用靶點等之間的相互關(guān)系；節(jié)點的度值(degree)代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點與節(jié)點相連的數(shù)目，度值越大，越有可能成為化合物的關(guān)鍵作用靶點。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein interaction，PPI)構(gòu)建將加減半夏瀉心湯-幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎共同作用靶點的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲取蛋白相互作用關(guān)系，分值越高說明蛋白相互作用置信度越高，數(shù)據(jù)可靠性越高，因此設(shè)置分值>0.9，篩選高置信度數(shù)據(jù)，將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出。將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行可視化，繪制PPI圖。

1.6 GO富集以及KEGG通路富集分析將關(guān)鍵靶點基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫功能注釋工具中Version 6.8，對加減半夏瀉心湯作用靶點進(jìn)行GO富集分析選擇生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細(xì)胞組成(cellular component，CC)3個模塊以及KEGG通路分析，設(shè)定P<0.05以確定關(guān)鍵靶點富集通路。采用GraphPad Prism 8.0軟件將圖富集結(jié)果繪制BP、MF、CC富集分析圖。借助微生信數(shù)據(jù)分析和可視化在線平臺進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，制成KEGG富集分析圖，以闡釋加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的生物功能及相關(guān)信號通路。

1.7 分子對接選取“有效成分-靶點”拓?fù)浞治鏊枚戎递^高的前10種成分，在 TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載其3D結(jié)構(gòu)，保存pbd格式。在拓?fù)湫再|(zhì)排名靠前的靶蛋白中挑選4個靶蛋白基因，并從PDB數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，保存pbd格式，利用Autodock Tools 1.5.6軟件刪除水分子、加氫及加電荷，保存為pdbqt格式，同樣利用Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行分子對接。將靶蛋白中的原配體抽離后與靶點對接，最后用PyMol 2.4軟件實現(xiàn)對接結(jié)果可視化，建立對接相互作用模式圖。

2 結(jié)果

2.1 加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎主要成分分析檢索TCMSP，輸入“半夏、黃連、黃芩、黃柏、大黃、延胡索、干姜、人參、甘草、大棗”，得到1 367個活性成分及相關(guān)信息，再以O(shè)B≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h作為篩選條件，最終篩選出255個活性成分，見表2。

表2 加減半夏瀉心湯藥物活性成分

2.2 加減半夏瀉心湯-幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎共同靶點的篩選在Gene Cards 數(shù)據(jù)庫中以“Helicobacter Pylori-Associated Gastritis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)871個潛在作用靶點的基因。在韋恩圖在線繪制平臺中分別錄入加減半夏瀉心湯藥物成分的344個靶點對應(yīng)的基因與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的871個基因，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點94個，見圖1。

圖1 加減半夏瀉心湯與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎交集靶點韋恩圖

2.3 構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。其中共有322個節(jié)點，103 362條邊，每條邊代表活性成分與治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎靶點的相互作用。綠色表示幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎，藍(lán)色表示藥物，橘色表示加減半夏瀉心湯藥物所含活性成分，紫色表示這些活性成分對應(yīng)的治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎作用的相關(guān)靶點。并根據(jù)Degree值進(jìn)行分析，度值越高，說明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、豆甾醇(Stigmasterol)、黃芩素(baicalein)在網(wǎng)絡(luò)中排名較高，可認(rèn)為是加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的主要活性成分。

圖2 加減半夏瀉心湯與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建PPI將加減半夏瀉心湯藥物成分對應(yīng)的靶點基因與疾病對應(yīng)的靶點基因所得的交集基因輸入STRING數(shù)據(jù)分析平臺，進(jìn)行蛋白互相作用分析后，下載其關(guān)系表格后，根據(jù)關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)(combined score)≥0.9進(jìn)行篩選，再運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件繪制PPI，見圖3。網(wǎng)絡(luò)圖中包含 77個節(jié)點，圖中圓形節(jié)點代表一個基因蛋白，邊代表連接著的兩個蛋白有相互作用關(guān)系。然后按照度值的多少，得到互作關(guān)系排名前4的蛋白為腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、JUN、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen activated protein kinases 1，MAPK1)、MAPK14，見表3。

表3 加減半夏瀉心湯與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的關(guān)鍵靶點及其拓?fù)湫再|(zhì)

圖3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO富集分析及KEGG通路富集分析把得到的47個共同靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO生物功能注釋，獲得GO條目482個(P<0.05)，分別包括生物過程(BP)383個，分子功能(MF)59個，細(xì)胞組成(CC)40個；其中生物過程包括對藥物反應(yīng)(response to drug)、對脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)(positive regulation of gene expression)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)等，分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合(protein binding)、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性(serine-type endopeptidase activity)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等，細(xì)胞組成主要包含細(xì)胞外液(extracellular space)、線粒體(mitochondrion)、基底外側(cè)質(zhì)膜(basolateral plasma membrane)、核質(zhì)(nucleoplasm)等。根據(jù)Count值選取各自排名前10的條目繪制條形圖，見圖4。

圖4 加減半夏瀉心湯藥物活性成分作用幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎靶點的GO富集分析

KEGG通路富集分析共富集101個條目(P<0.05)，篩選排名靠前20的條目進(jìn)行可視化分析，繪制氣泡圖，見圖5。主要包括TNF信號通路(signaling pathway)、P53信號通路(p53 signaling pathway)、T細(xì)胞受體信號通路(T cell receptor signaling pathway)、FoxO信號通路(Foxo signaling pathway)、Nf-kappa B信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、PI3k-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。

圖5 加減半夏瀉心湯藥物活性成分作用幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎靶點的KEGG通路富集分析

2.6 分子對接結(jié)果與分析將“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)中的10個化合物與靶蛋白基因進(jìn)行對接，DockThor在線對接結(jié)果具體信息見表4。當(dāng)結(jié)合能小于0時，蛋白和小分子便可以自發(fā)地進(jìn)行結(jié)合。分子對接結(jié)果表明，經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到的10個化合物與靶蛋白結(jié)合的結(jié)合能都遠(yuǎn)小于0，可能是治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎疾病的主要作用成分。選取與關(guān)鍵靶點結(jié)合能較好的化合物用Autodock Tools 1.5.6軟件進(jìn)行分析，然后將化合物與關(guān)鍵靶點的相互作用模式用PyMol 2.4軟件進(jìn)行展示，見圖6。

表4 10個主要化學(xué)成分與靶蛋白的結(jié)合能

圖6 加減半夏瀉心湯主要活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接圖

3 討論

中醫(yī)藥治療疾病機(jī)制復(fù)雜，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠從整體上系統(tǒng)研究中藥成分靶點與疾病靶點之間的作用關(guān)系，初步探討中藥復(fù)方治療疾病的內(nèi)在機(jī)制[12]。為了進(jìn)一步闡明加減半夏瀉心湯在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎中的藥效基礎(chǔ)與作用機(jī)制，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法進(jìn)行探討，以期為進(jìn)一步實驗研究和臨床應(yīng)用提供參考。

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行加減半夏瀉心湯成分的篩選及預(yù)測靶點，并與幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎靶點進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)94個共同靶點共對應(yīng)255個主要活性成分，其中槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、蘆薈大黃素(aloe-emodin)、豆甾醇(stigmasterol)、黃芩素(baicalein)在網(wǎng)絡(luò)中排名較高，且這3種成分均為黃酮類化合物，可能是加減半夏瀉心湯發(fā)揮治療作用的主要成分。黃連、甘草和大棗中均含有槲皮素。研究表明，槲皮素具有廣泛的抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[21]。黃芩的主要活性成分中漢黃芩素、黃芩素等均為黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用[22]。目前，針對黃芩抗炎機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，其抗炎作用的發(fā)揮依賴于減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及減少其與特異性受體結(jié)合、抑制啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)[23]。同時，漢黃芩素對胃癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，可誘導(dǎo)其凋亡并抑制其遷移和侵襲。研究表明，其作用機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin通路激活有關(guān)，從而抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[24]。黃芩素能夠通過干擾花生四烯酸的代謝通路、抑制細(xì)胞因子的活性產(chǎn)生抗炎效用[25]。蘆薈大黃素具有抗炎作用，對真菌、細(xì)菌、病毒有明顯的抑制作用[26]。β-谷甾醇通過誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901凋亡從而抑制細(xì)胞生長[27]，并且通過介導(dǎo)AMPK、PTEN、Hsp90等途徑在體內(nèi)體外抑制人胃癌AGS細(xì)胞的生長[28]。研究證明，豆甾醇通過增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽的活性發(fā)揮抗氧化作用，抑制環(huán)氧化酶-2、誘生型一氧化氮合酶的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[29]。

加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎共有94個共同靶點，進(jìn)行拓?fù)浞治龊蠊埠Y選出核心靶點22個，排名靠前的是TNF、JUN、MAPK1、MAPK14、IL-10等。這些靶點主要與炎癥、氧化應(yīng)激、新生血管生成及免疫相關(guān)。TNF是具有介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、參與免疫及內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等廣泛生物學(xué)作用的細(xì)胞因子[30]。研究證明，TNF-α表達(dá)與幽門螺桿菌感染和疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，TNF-α表達(dá)水平在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎進(jìn)展至胃癌過程中逐漸升高[31]。MAPK1、MAPK14屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，主要參與細(xì)胞生長、分化、應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等多種細(xì)胞活動。其介導(dǎo)的信號通路在幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[32-33]。MAPK1參與多細(xì)胞生理活動[34]，同時MAPK14在正常的免疫和炎癥反應(yīng)中非常重要[35]。MAPK14(p38α)的激活是一種氧化和觸發(fā)黏附蛋白的調(diào)節(jié)器[36]，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，可通過磷酸化激活MAPKAP2來增強(qiáng)炎性因子的表達(dá)和分泌。幽門螺桿菌感染胃上皮細(xì)胞后可激活多條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其中包括ERK1/2、JNK以及p38 MAPK，誘導(dǎo)TNF-α、IL-8、IL-1β和IL-17等炎性因子分泌[37-38]。因此，MAPK抑制劑可顯著抑制幽門螺桿菌感染觸發(fā)的炎性因子的產(chǎn)生。JUN由c-Fos和c-JUN組成，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[39]。同時JUN的顯性突變體減弱了各種人類腫瘤細(xì)胞系的生長行為，它們也干擾了與Ras通路相關(guān)的癌基因的轉(zhuǎn)化[40]。IL-10是一種具有抗炎特性的細(xì)胞因子，通過限制對病原體的免疫反應(yīng)，從而防止對宿主的損害，在感染中起著核心作用[41]。

對加減半夏瀉心湯治療幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎共有靶點進(jìn)行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，其作用機(jī)制主要與基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過程，酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子活性等分子功能，胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外間質(zhì)、細(xì)胞外液等細(xì)胞組成有關(guān)。KEGG富集分析之中，主要涉及T細(xì)胞受體信號通路、Toll樣受體信號通路、FoxO信號通路、NF-κB 信號通路、PI3k-Akt信號通路、HIF-1信號通路等。T細(xì)胞受體是由6種不同的多肽形成的蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過復(fù)合物之間的相互平衡，確保了T細(xì)胞對各種抗原刺激的有效反應(yīng)，同時防止自身免疫[42]。Toll樣受體在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。Toll的異常激活可能導(dǎo)致不受限制的炎癥反應(yīng)。因此，Toll家族可能在自身免疫性疾病的發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[43]。Foxo信號通路為多信號通路交匯作用通路，F(xiàn)oxo轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核生物中，上游信號通路，如PI3K/AKT信號通路[44]、MAPK信號通路[45]均能通過激活Foxo轉(zhuǎn)錄因子啟動下游靶點基因轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞周期調(diào)控以及細(xì)胞凋亡中起著重要作用。核因子-κB通路長期以來一直被認(rèn)為是一種典型的促炎信號通路，當(dāng)核因子-κB活化后，可激活下游細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等調(diào)節(jié)免疫或產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[46]。PI3K/Akt 信號通路是生物體中重要的信號傳導(dǎo)途徑，HIF-1 轉(zhuǎn)錄因子是一種由HIF-1α和一個穩(wěn)定的組成性表達(dá)的HIF-1β組成的異源二聚體。HIF-1 亞基屬于堿性-螺旋-環(huán)-螺旋和PER的蛋白家族-ARNT-SIM含結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子[47]。HIF-1是一種在機(jī)體缺氧條件下轉(zhuǎn)錄的活性核蛋白，與炎癥、血管舒張、血管生成和造血功能密切相關(guān)[48]。

DockThor在線分子對接結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)結(jié)合能的數(shù)值推出，10種主要活性成分(槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、豆甾醇、β-谷固醇、黃芩素、蘆薈大黃素、刺芒柄花素、異鼠李素)均能與TNF、JUN、MAPK1、MAPK14蛋白基因結(jié)合并形成氫鍵(以TNF and wogonin、MAPK1 and aloe-emodin、JUN and beta-sitosterol、MAPK14 and baicalein的分子對接可視化為例，說明這10種活性成分有潛在的成藥性，能發(fā)揮治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎作用，但也需要進(jìn)一步的藥效學(xué)研究。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對加減半夏瀉心湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為進(jìn)一步的實驗研究奠定了基礎(chǔ)。