劉艷峰

邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者最常見的并發(fā)癥之一，是引發(fā)終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要因素[1-2]。病理生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化是DKD的重要病理機(jī)制，也是導(dǎo)致DM患者腎功能降低的主要因素之一[3-4]。因此，以抑制纖維化為治療靶點(diǎn)對(duì)延緩DKD進(jìn)展至關(guān)重要。番茄為藥食兩用植物，其主要活性成分番茄紅素(lycopene，Lyc)，具有良好的抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[5-7]，對(duì)肝、肺纖維化具有抑制作用[8-9]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Lyc能夠通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激對(duì)DM模型大鼠腎損傷有保護(hù)作用[10-11]。本研究旨在探討Lyc對(duì)DKD模型大鼠腎臟纖維化的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物60只清潔級(jí)雄性SD大鼠，7周齡，體質(zhì)量210～240 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(冀)2018-004，適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d(室溫25 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，光照黑暗各 12 h 交替)后開展實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，倫理批號(hào)：HDZXLL(K)字2020-012。

1.2 藥物與試劑Lyc(南京澤朗生物科技有限公司，純度≥96%，批號(hào)：ZL201900837a)；二甲雙胍(metformin，Met)(河北天成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20200127)；鏈脲佐菌素(美國Sigma公司，批號(hào)：024K1211)；24 h尿蛋白量(urine protein，UPro)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，SCr)試劑盒(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號(hào)：201912017、202003009、202001013)；Masson染色試劑盒、ECL超敏發(fā)光試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：191230、190825)；膠原蛋白I(Collagen I)、Collagen III、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、Smad2、磷酸化Smad2(p-Smad2)和β-actin抗體(北京博奧森生物科技有限公司，貨號(hào)：bs-0578R、bs-0948R、bs-0086R、bs-52223R、bs-5618R、bs-0061R)。

1.3 儀器Sure Step Plus型血糖儀(美國強(qiáng)生公司)；BS-300型全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；CUT4062型石蠟切片機(jī)(德國SLEE公司)；DYCZ-24DN型電泳儀、DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀(北京六一生物科技有限公司)；Chem Doc XRS型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 分組、動(dòng)物模型制備與給藥將60只SD大鼠隨機(jī)選10只為正常對(duì)照組并給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)；其余大鼠均給予高糖高脂飼料(常規(guī)飼料67.5%加20%蔗糖、10%豬油、2.5%膽固醇)喂養(yǎng)4周后禁食禁水12 h，腹腔注射濃度1%的鏈脲佐菌素30 mg·kg-1，72 h后檢測(cè)血糖≥16.7 mmol·L-1，尿糖為+++或++++，即認(rèn)定造模成功[12]。然后將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、(低、中、高劑量)Lyc組(10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、40 mg·kg-1)組[13]和Met組(500 mg·kg-1)[14]，每組10只，每日1次，連續(xù)灌胃給藥8周，正常對(duì)照組和模型組灌胃同體積生理鹽水，療程8周。

2.2 檢測(cè)大鼠體質(zhì)量與血糖水平各組10只大鼠末次給藥24 h后，分別稱量體質(zhì)量；由尾靜脈采血，通過血糖儀測(cè)定空腹血糖水平。

2.3 檢測(cè)大鼠UPro和血清BUN、SCr含量各組大鼠末次給藥后，收集24 h尿液并采用磺基水楊酸法測(cè)定UPro水平；末次給藥24 h后，腹腔注射水合氯醛實(shí)施麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，2 000 rpm離心 10 min，取血清，參照試劑盒說明通過全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清BUN、SCr含量。

2.4 觀察大鼠腎臟病理學(xué)變化各組10只大鼠采集血標(biāo)本后，脊椎脫臼出死并取雙側(cè)腎臟，其中左腎置于40 ng·L-1甲醛溶液中固定72 h，石蠟浸潤包埋后行4 μm厚度連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯透明和梯度乙醇脫蠟后，行常規(guī)HE染色(蘇木素溶液染色 5 min、1%鹽酸乙醇分化30 s、0.5%伊紅水溶液染色 3 min)，梯度乙醇脫水和二甲苯透明后由中性樹膠封固，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察腎臟病理性形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

2.5 觀察并計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)水平取“2.4”步驟制備的石蠟切片，經(jīng)脫蠟水化后，高碘酸溶液氧化10min后PBS溶液沖洗，行Masson染色，PBS溶液沖洗蘇木素染核，梯度乙醇脫水和二甲苯透明后中性樹膠封片，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察腎臟纖維化程度(藍(lán)色為陽性著色)，通過圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)CVF。

CVF=(膠原面積/視野總面積)×100%

2.6 Western Blot法檢測(cè)大鼠腎臟相關(guān)蛋白表達(dá)取各組10只大鼠的右側(cè)腎臟剪碎后加入4 ℃預(yù)冷裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 rpm離心20 min提取總蛋白，并通過BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，然后進(jìn)行10% SDS-PAGE膠電泳行蛋白分離、濕法轉(zhuǎn)PVDF膜、5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后滴加目標(biāo)蛋白、β-actin抗體4 ℃孵育12 h，洗膜后滴加二抗37 ℃孵育1 h，洗膜后滴加ELC發(fā)光劑后通過凝膠成像儀顯示蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參，半定量目標(biāo)蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量Lyc組和Met組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05；P<0.01)；與Met組比較，高劑量Lyc組大鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.05)。見表1。

3.2 各組大鼠空腹血糖水平比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠空腹血糖水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中、高劑量Lyc組和Met組大鼠空腹血糖水平顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量和空腹血糖水平

3.3 各組大鼠UPro和血清BUN、SCr含量比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠UPro和血清BUN、SCr含量極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中、高劑量Lyc組和Met組大鼠UPro和血清BUN、SCr水平顯著降低(P<0.01)；與Met組比較，高劑量Lyc組大鼠UPro和血清BUN、SCr水平顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠UPro及血清BUN、SCr含量

3.4 各組大鼠腎臟病變比較正常對(duì)照組大鼠腎小管和腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)均未見異常；模型組大鼠腎小管可見蛋白管型和細(xì)胞管型，腎間質(zhì)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞腫脹并呈現(xiàn)空泡變性，腎小球明顯增大，可見系膜和基底膜增生、內(nèi)皮細(xì)胞泡沫樣變；與模型組比較，Lyc各劑量組和Met組腎小管和腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)病變不同程度改善，且高劑量Lyc組和Met組效果優(yōu)于其他組。見圖1。

注：A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量Lyc組；D：中劑量Lyc組；E：高劑量Lyc組；F：Met組

3.5 各組大鼠腎臟纖維化狀況比較正常對(duì)照組大鼠腎間質(zhì)可見少量膠原纖維；模型組腎小球內(nèi)和腎間質(zhì)可見大量膠原纖維沉積，腎小管基底膜可見膠原纖維；與模型組比較，Lyc各劑量組和Met組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)膠原纖維不同程度減少；高劑量Lyc組膠原纖維腎間質(zhì)可見少量膠原纖維，效果優(yōu)于其他組。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟CVF極顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，低、中、高劑量Lyc組和Met組大鼠腎臟CVF極顯著降低(P<0.01)；與Met組比較，高劑量Lyc組大鼠腎臟CVF極顯著降低(P<0.01)。見圖2、表3。

注：A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量Lyc組；D：中劑量Lyc組；E：高劑量Lyc組；F：Met組

表3 各組大鼠腎臟CVF

3.6 各組大鼠腎臟Collagen I、Collagen III、TGF-β、Smad、p-Smad蛋白表達(dá)及p-Smad/Smad比值比較與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟Collagen I、Collagen III、TGF-β、p-Smad蛋白表達(dá)上調(diào)且p-Smad/Smad水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，中、高劑量Lyc組和Met組大鼠腎臟Collagen I、Collagen III、TGF-β、p-Smad蛋白表達(dá)下調(diào)且p-Smad/Smad水平降低(P<0.01)；與Met組比較，高劑量Lyc組Collagen I、Collagen III、TGF-β、p-Smad蛋白表達(dá)下調(diào)且p-Smad/Smad水平顯著降低(P<0.05；P<0.01)。見圖3、表4。

注：A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：低劑量Lyc組；D：中劑量Lyc組；E：高劑量Lyc組；F：Met組

表4 各組大鼠腎臟Collagen I、Collagen III、TGF-β、Smad、p-Smad蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-Smad/Smad水平比較

4 討論

我國DM患病人數(shù)約1.4億，其中30%～50%DM患者并發(fā)不同程度DKD，已成為威脅人們生命健康的主要慢性疾病之一[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟纖維化在DKD進(jìn)展過程中發(fā)揮著重要作用，也是導(dǎo)致腎功能障礙和DKD患者死亡的主要原因[17-18]。因此，以抑制腎纖維化為治療靶點(diǎn)抗DKD至關(guān)重要。

隨著中醫(yī)藥發(fā)展戰(zhàn)略的實(shí)施以及中藥現(xiàn)代化研究的深入，中醫(yī)藥在DM防治方面應(yīng)用逐漸廣泛[19-21]。番茄為藥食兩用植物，其主要活性成分Lyc具有多種生物學(xué)活性。本研究發(fā)現(xiàn)，DKD模型大鼠腎小管可見蛋白管型和細(xì)胞管型，間質(zhì)區(qū)可見炎性細(xì)胞浸潤，上皮細(xì)胞腫脹并呈現(xiàn)空泡變性；腎小球內(nèi)和腎間質(zhì)可見大量膠原纖維沉積，腎小管基底膜可見膠原纖維，與鄭小鵬等[22]和祁珊珊等[23]研究報(bào)道一致；給予Lyc或Met治療8周能夠明顯提高DKD大鼠體質(zhì)量、降低空腹血糖水平、改善腎功能指標(biāo)(降低UPro和血清BUN、SCr含量)，改善腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)病變和腎臟纖維化，且高劑量Lyc(40 mg·kg-1)組優(yōu)于Met組。

高血糖誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)過量生成是DKD腎纖維化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，從而改變腎臟結(jié)構(gòu)并降低腎功能，Collagen I和 Collagen III是細(xì)胞外基質(zhì)的主要構(gòu)成成分[24-26]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads通路在DM誘發(fā)腎纖維化過程中具有關(guān)鍵作用[27]。TGF-β 能夠誘導(dǎo)Smads磷酸化(p-Smads)而被活化，刺激細(xì)胞外基質(zhì)過量產(chǎn)生并抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解[28]。研究發(fā)現(xiàn)，通過藥物抑制TGF-β/Smads通路能夠明顯降低肌成纖維細(xì)胞增殖和分化，下調(diào)Collagen I、Collagen III蛋白表達(dá)，從而緩解DKD腎纖維化[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予Lyc或Met治療8周能夠明顯下調(diào)DKD模型大鼠腎臟Collagen I、Collagen III、TGF-β、p-Smads蛋白表達(dá)并降低Smad磷酸化水平(p-Smad/Smad比值)，并且高劑量Lyc組(40 mg·kg-1)對(duì)Collagen I、Collagen III、TGF-β、p-SMAD表達(dá)和p-Smad/Smad比值的調(diào)控作用優(yōu)于Met組，本研究結(jié)果與李青云等[29]和劉宗亮等[28]研究報(bào)道一致。提示Lyc對(duì)DKD大鼠腎纖維化的抑制作用可能與調(diào)控TGF-β/Smads信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，Lyc對(duì)DKD大鼠腎纖維化具有抑制作用，可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路、下調(diào)Collagen I和Collagen III表達(dá)有關(guān)。但相關(guān)分子機(jī)制還需更加深入地研究。