周穎，劉蕾，袁柳媚，蔣佳，馬雁鴻，陳成，潘江，石文英，章薇，婁必丹

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

隨著全世界人口老齡化程度日益加深，腦中風成為我國乃至世界面臨的重大公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。近年來興奮性神經(jīng)毒性作為導致腦缺血后腦細胞壞死與凋亡的重要始因，已成為重點研究方向之一[3]。有文獻報道，電針可抑制腦組織缺血區(qū)胞外興奮性氨基酸水平，調控N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic Acid，NMDA)受體不同亞基表達水平，降低細胞內Ca2+濃度，拮抗缺血導致的興奮性神經(jīng)毒性，促進神經(jīng)功能恢復[4-5]。D-絲氨酸(D-serine，D-Ser)作為NMDA受體重要的協(xié)同激動劑，通過與NMDA受體亞單位NR1亞基位點結合，參與興奮性神經(jīng)毒性[6-7]。研究表明，電針心包經(jīng)穴具有促進腦缺血后神經(jīng)修復的作用[8-9]。本課題組前期表明，電針局灶性腦缺血損傷模型大鼠心包經(jīng)、肺經(jīng)后，大鼠缺血側腦組織 D-Ser 含量、NR1蛋白表達下降[10-11]，神經(jīng)功能缺損癥狀明顯改善，提示電針心包經(jīng)穴可能對 D-Ser、NR1表達具有調節(jié)作用，而腦缺血后不同時期的神經(jīng)損傷呈現(xiàn)不同程度的變化。故本研究擬進一步探討電針心包經(jīng)穴在局灶性腦缺血后不同時相點(1 d、3 d、7 d、14 d、21 d)調控腦缺血損傷模型大鼠缺血側腦組織D-Ser含量、NR1蛋白表達的作用。

1 材料

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠，體質量280～300 g，120只，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002。安靜環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫22～26 ℃，相對濕度50%～70%。

1.2 試劑甲醇(美國Thermo Fisher公司，貨號：67-56-1)；乙腈(美國Thermo Fisher公司，貨號：75-05-8)；甲酸(美國Sigma Aldrich公司，貨號：67-56-1)，乙酸(美國Sigma Aldrich公司，貨號：75-05-8)；D-Ser(美國Sigma Aldrich公司，貨號：312-84-5)；硼酸緩釋液(美國Sigma Aldrich公司)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀生物有限公司，貨號：CW0014S)；丙烯酰胺(阿拉丁，貨號：J173005)；Marker(美國Thermo Fisher公司，貨號：#26617)；PVDF膜(美國Millipore公司，貨號：IPVH00010)；一抗：Rabbit Anti NR1(江蘇新科生物研究中心有限公司，貨號：AF6407)；二抗：辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZB-2301)；內參一抗：MM Anti-Actin(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：TA-09)；內參二抗：辣根酶標記山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號：ZB-2305)。

1.3 儀器尼龍線栓[頭直徑(0.38±0.02)mm，北京西濃科技有限公司]；華佗牌毫針(0.2 mm×15 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；韓式電針治療儀(型號：HANS-200A，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；高效液相色譜儀[(配有熒光檢測器)，美國Waters公司]；C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Agilent ZROBAX)；冷凍高速離心機(型號：TGL-16D，常州中捷實驗儀器制造有限公司)；紫外分光光度計(型號：UV-1600PC，上海美譜達儀器有限公司)；蛋白垂直電泳儀(型號：DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：Chemi DocTM XRS+，美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 動物分組將120只大鼠隨機分為2組，即模型組和電針組，每組60只，造模后每組再分為1 d、3 d、7 d、14 d和21 d五個時相點，每個時相點12只大鼠。

2.2 造模方法采用持久性腦缺血損傷模型大鼠模型，造模參考Zea Longa、Koizumi[12-13]報道的方法，并在實驗過程中對具體操作進行適應性修改[14]，大鼠麻醉后頸部正中作2 cm長切口，沿筋膜鈍性分離左側胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌間肌間隙，直至充分暴露左側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，結扎頸外動脈及頸總動脈近心端，同時夾閉頸內動脈，在頸總動脈近分叉處剪口，將線栓插入，松開動脈夾，輕推使其沿頸內動脈入顱，至大腦中動脈，插入深度由分叉處計(18.5±0.5)mm，固定、間斷線栓，縫合肌肉和皮膚。

2.3 造模成功標準參考Zea Longa[9]的5分制評分標準，待大鼠麻醉清醒后評分。無偏癱肢體功能缺失，計0分；不能完全伸展右前肢，提尾懸吊時右前肢屈曲，計1分；爬行時向右轉圈，追尾，計2分；爬行時向右傾倒，計3分；不能自主行走，意識障礙，計4分。1～3分納入實驗，其余剔除。

2.4 處理方法電針組：據(jù)參照《實驗動物針灸穴位圖譜》[15]及擬人比照法確定穴位定位，選取癱側心包經(jīng)不同節(jié)段的四個穴位：天泉、曲澤、內關、大陵。定位如下：天泉：前肢內側中央距腋前紋頭約 3 mm 左右；曲澤：肘彎橫紋偏尺側凹陷中；內關：前肢內側離腕關節(jié)3 mm左右的尺橈骨縫間；大陵：前肢內側腕橫紋之中央凹陷處。于造模成功24 h后開始行針刺治療，每天1次。將大鼠捆綁后用毫針刺入穴位，深度3～4 mm，連接韓式電針治療儀，取天泉、曲澤穴一組，內關、大陵一組，刺激參數(shù)：連續(xù)波，輸出電流0.5～1 mA，頻率15 Hz，強度以局部組織輕顫為度，時間30 min。模型組大鼠僅捆綁處理，每次30 min，每天1次。

2.5 觀察指標及檢測方法

2.5.1 神經(jīng)功能缺損評分采用Feeney[16]提出的走橫木實驗(beam walking test，BWT)，綜合評價大鼠腦缺血后運動功能、平衡功能及身體協(xié)調功能。各組大鼠均于造模成功后6 h進行第一次評分，于最后一次處理后30 min進行第二次評分。大鼠完全不能爬過橫木，且無法將后肢放在水平位，計1分；大鼠完全不能爬過橫木，但可將癱瘓側后肢放在水平位并保持平衡，計2分；大鼠不能爬過橫木，跌倒概率>50%，計3分；大鼠不能爬過橫木，跌倒概率<50%，計4分；大鼠能爬過橫木，其患側肢體起作用<50%，計5分；大鼠能爬過橫木，其癱瘓側肢體起作用>50%，計6分；大鼠順利爬過橫木，癱瘓肢體完全起作用，計7分。

2.5.2 檢測大鼠腦組織D-Ser定量應用高效液相色譜儀熒光檢測法(high performance liquid chromatography，HPLC)進行定量分析：操作結束后，斷頭取腦，切取缺血側腦組織，凍存?zhèn)溆?。統(tǒng)一稱缺血側腦組織質量，經(jīng)過勻漿、樣品前處理、上機檢測。樣品加入4倍體積鹽酸緩沖液(0.1 mol·L-1)，勻漿后，12 000 r·min-1離心5 min，取1 mL上清液，加入 3 mL 乙腈去除樣品中的蛋白質和大分子物質后，再次離心，完成前處理后取10 μL樣品，加入190 μL衍生化試劑(OPA和3-巰基丙酸溶于0.4 mol·L-1硼酸鹽緩沖溶液中，各10 g·L-1)，渦旋混勻后反應 5 min，過濾頭上機檢測，進樣量為10 μL，流動相A(0.1%甲酸-水溶液)，流動相B(乙腈)，熒光檢測波長為λex=345 nm，λem=435 nm。以標準溶液繪制標準曲線，以D-Ser含量(X)為橫坐標，其峰面積(Y)為縱坐標，所得線性方程為：Y=3.79e+6×-1.07e+5(R=0.999668)，將樣品在高效液相色譜儀下測得的峰面積代入方程式，即可算出樣品的D-Ser含量。

2.5.3 Western Blot法檢測大鼠腦組織中NR1蛋白表達水平如前操作結束后，切取腦組織備用。液氮將研缽預冷，取0.2 g腦組織研缽研磨，加入500 μL細胞裂解液，研磨至勻漿無明顯顆粒，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用BCA法進行蛋白定量，計算蛋白濃度，加入緩沖溶液，煮沸5 min。樣品丙烯酰胺凝膠電泳(60 V壓縮蛋白，80 V 分離蛋白)后，轉至PVDF膜(300 mA，2 h)，將PVDF膜放入3%的脫脂牛奶封閉液，室溫封閉1 h，加入一抗孵育過夜后，TBST浸洗3次，加入二抗孵育2 h，再次TBST浸洗3次，最后發(fā)光液浸濕PVDF膜后放置于超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)樣品放置區(qū)運行顯影成像。以NR1蛋白表達量與內參蛋白表達量的比值表示NR1的表達水平。

3 結果

3.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較與處理前比較，模型組大鼠14 d、21 d神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05)，電針組3 d、7 d、14 d、21 d大鼠神經(jīng)功能缺損評分均顯著升高(P<0.05)。與處理后同一時相點模型組比較，電針組大鼠神經(jīng)功能缺損評分在3 d、7 d、14 d、21 d四個時相點均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠BWT評分比較 分)

3.2 各組大鼠腦組織D-Ser含量比較與同一時相點模型組比較，電針組在3 d、14 d、21 d時大鼠腦組織D-Ser含量顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠缺血側腦組織D-Ser含量比較

3.3 各組大鼠腦組織NR1蛋白表達水平比較與同一時相點模型組比較，電針組大鼠在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d時腦組織NR1蛋白表達均顯著下調(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠缺血側腦組織NR1蛋白表達水平比較

圖1 各組大鼠缺血側腦組織NR1蛋白表達

4 討論

興奮性神經(jīng)毒性是腦缺血所引發(fā)的諸多神經(jīng)損傷級聯(lián)反應的重要始因之一，在腦缺血缺氧的病理狀態(tài)下，興奮性神經(jīng)遞質谷氨酸濃度異常升高，NMDA受體過度激活，造成細胞內Ca2+超載，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性[17]。D-Ser作為NMDA受體重要的內源性協(xié)同激動劑[18]，在哺乳動物腦內由絲氨酸消旋酶(serine racemase，SR)催化形成，其通過與NR1亞基上的位點結合，參與缺血發(fā)生后NMDA受體介導的興奮性神經(jīng)毒性。NR1亞基作為NMDA受體的主要功能單位[19]，可單獨調節(jié)NMDA受體離子通道的開閉[20]。因此，通過調控腦內D-Ser含量和NR1表達，可作為腦缺血發(fā)生后的一種神經(jīng)保護和治療策略[21-22]。

在本實驗中，處理后電針組各時相點BWT評分均較模型組同時相點顯著升高，其中3 d、7 d、14 d、21 d改善明顯，表明電針心包經(jīng)穴對大鼠的運動、平衡功能具有明顯的改善作用，并隨治療時間增長效果更為顯著。目前研究認為，腦缺血后急性期腦內D-Ser水平顯著升高，加劇興奮性神經(jīng)毒性，SR基因敲除鼠或運用SR抑制劑均可使腦缺血損傷模型大鼠興奮性神經(jīng)毒性減輕[23-26]，這是通過降低 D-Ser含量而對神經(jīng)產(chǎn)生保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織D-Ser含量呈現(xiàn)波動下降趨勢，而電針組下降趨勢更穩(wěn)定，且3 d、7 d、14 d、21 d大鼠腦內D-Ser含量均較模型組低。大多數(shù)NMDA受體是NR1亞基(結合協(xié)同激動劑)和NR2A-D(結合谷氨酸)亞基不同組合構成的異四聚體[27-28]，NR1可作為觀測NMDA受體功能及狀態(tài)的窗口。研究認為，NR1蛋白表達在缺血早期應激性升高，在1～3 d逐漸下降，針刺干預在早期即可顯著降低NR1表達，從而減輕興奮性神經(jīng)毒性[29]。在本研究中，電針組大鼠缺血側腦組織NR1蛋白表達均較模型組明顯降低。這些結果與電針處理3 d、7 d、14 d、21 d后運動功能逐漸改善的趨勢一致，說明電針心包經(jīng)穴改善腦缺血損傷模型大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀可能與其降低D-Ser含量、NR1蛋白表達有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠缺血側腦組織D-Ser含量與NR1表達均呈現(xiàn)明顯波動變化，D-Ser含量在1～3 d平穩(wěn)，7 d明顯降低，14 d有所回升，21 d又出現(xiàn)下降，同時NR1表達在1～3 d呈現(xiàn)下降，7 d、14 d呈現(xiàn)回升，21 d又出現(xiàn)小幅下降。D-Ser在7 d、14 d的變化與在永久腦缺血損傷模型小鼠觀察到的D-Ser在6～10 d延遲性降低和10～15 d逐漸回升一致，其延遲性降低是對缺血后 NMDA 受體過度表達的一種保護性反饋，主要是由甘氨酸濃度升高[30]，但D-Ser在缺血急性期后整體上呈現(xiàn)為下降趨勢。本研究結果顯示，D-Ser 在14 d有所回升，但并未超過急性期水平，且在21 d繼續(xù)保持下降趨勢。根據(jù)相關研究，NR1表達在早期應激性升高后會逐漸下降[29]，但本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦組織NR1蛋白表達在7 d、14 d反而呈現(xiàn)上調，并在21 d亦保持較高水平，這與Que等[31]研究大鼠在局灶性腦缺血后損傷側腦組織NMDA受體增長延遲14 d相類似，還發(fā)現(xiàn)缺血發(fā)生后NMDA受體表達和功能上調狀態(tài)可達30 d。NR1表達延遲性升高可能與D-Ser生成降低導致受體超敏性有關[23]，這個觀點支持在SR活性抑制導致D-Ser含量降低的基礎上，刺激NR1表達增強。因此，認為D-Ser與NR1間存在一種雙向反饋，這也證明了缺血后神經(jīng)功能修復往往還取決于多環(huán)節(jié)間的相關作用，而與模型組比較，電針組有效抑制了D-Ser含量的波動變化，使其在1～21 d整體呈現(xiàn)穩(wěn)定下降趨勢，也降低了NR1蛋白表達水平。本研究電針組NR1表達在1～3 d下降趨勢明顯考慮為缺血急性期后電針心包經(jīng)穴能迅速降低NR1表達，而7 d又呈現(xiàn)短暫回升趨勢，一方面是對D-Ser含量下降的反饋，另一方面缺血后期NR1表達過低反而會影響信號傳遞，不利于神經(jīng)恢復[32]。提示電針改善腦缺血損傷模型大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，可能也與其穩(wěn)定缺血后D-Ser的波動以及調控NR1表達變化有關。

綜上所述，本研究認為，對于腦缺血導致的興奮性神經(jīng)毒性，電針心包經(jīng)穴可同時調控D-Ser/NR1這一損傷環(huán)節(jié)的兩端，促使激動劑與受體同步下調，通過降低D-Ser含量、調控其與NR1的結合，從而達到降低神經(jīng)毒性、保護神經(jīng)功能的作用。