徐琦 楊新燕 楊燦 沃恩康 郭潮潭

杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院與生物工程學(xué)院，杭州 310013

每年全球有超過20萬的流感死亡病例，流感病毒感染至下呼吸道引起肺炎和組織損傷是患者出現(xiàn)重癥及死亡的重要原因。肺泡巨噬細(xì)胞是肺部抵御病原體入侵的第一道屏障，廣泛分布在肺泡腔內(nèi)，介導(dǎo)并調(diào)控肺部抗病毒免疫應(yīng)答，但不同于肺上皮細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞表面缺少可被甲型流感病毒識別結(jié)合的唾液酸（SA）殘基，但目前針對流感病毒是否可以感染肺泡巨噬細(xì)胞，或其感染途徑尚未得到證實(shí)。本研究選取3株代表性甲型流感病毒株，用RT-PCR及熒光定量PCR的方法檢測巨噬細(xì)胞胞內(nèi)外病毒載量、胞內(nèi)病毒相關(guān)模式識別受體及對抗病毒細(xì)胞因子表達(dá)的影響，為進(jìn)一步明確甲型流感病毒與巨噬細(xì)胞之間的生物學(xué)關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.儀器

儀器包括PCR儀（Applied Biosystem）、核酸電泳儀（JUNYI）、高速離心機(jī)（Eppendorf）、凝膠成像分析系統(tǒng)（上海培清科技有限公司）、Olympus倒置顯微鏡、7500熒光定量PCR儀（ABI）、激光共聚焦顯微鏡（ZEISS）、Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)（賽默飛）、超凈工作臺(tái) （蘇凈安泰）、生物安全柜（ESCO）。

2.試劑

試劑包括：DMEM培養(yǎng)液 （BI）、胎牛血清（Gibco）、Trizol（北京康為試劑有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄及嵌合熒光檢測試劑盒（TAKARA），DNA聚合酶預(yù)混液 （賽默飛）、DNA Marker（DL2000）、 瓊 脂糖（Biowest）。引物合成委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司。甲型流感病毒qPCR引物序列見表1。

表1 甲型流感病毒qPCR引物序列

注：TLR3:Toll樣受體3

?

3.實(shí)驗(yàn)用毒株及細(xì)胞系

A/Aichi/1968（H3N2）毒株、A/Memphis/1/1971（H3N2）毒株、A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）毒株（以下簡稱Aichi、Memphis和PR8）均為本實(shí)驗(yàn)室保存毒株。MDCK狗腎上皮細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。MHS小鼠肺泡巨噬細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

二、研究方法

1.細(xì)胞表面SA鑒定

MDCK細(xì)胞和MHS細(xì)胞4%多聚甲醛固定5 min，0.1%吐溫20的5%牛血清白蛋白封閉。FITC-接骨木凝集素（美國加利福尼亞州矢量實(shí)驗(yàn)室）與細(xì)胞表面SA孵育2 h。4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）對細(xì)胞進(jìn)行DNA染色，共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞表面SA表達(dá)水平。使用Image J軟件對熒光水平進(jìn)行量化處理。

2.病毒接種巨噬細(xì)胞

Aichi、Memphis和PR8分別接種于MDCK細(xì)胞，TCID確定病毒感染滴度。MHS肺泡巨噬細(xì)胞以10密度種植6孔板，每孔對應(yīng)加入10TCID病毒稀釋液，對照組（NC）加入100μL的PBS，每組樣本設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔。吸附細(xì)胞1 h后PBS洗去多余病毒顆粒，用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

3.樣本采集

利用倒置顯微鏡拍照觀察接種病毒24 h后的巨噬細(xì)胞形態(tài)及病變情況。每孔收集上清以1 500轉(zhuǎn)/min離心3 min（離心半徑為13.5 cm），去除細(xì)胞碎片，吸取100μL加入1 mL Trizol裂解-80℃凍存?zhèn)溆?。貼壁細(xì)胞則經(jīng)PBS清洗3遍，每孔1 mL Trizol裂解-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

4.RT-qPCR法檢測上清及細(xì)胞樣本病毒拷貝數(shù)

將-80℃凍存的樣本充分平衡至室溫，氯仿抽提RNA后，異丙醇-20℃沉淀RNA，75%乙醇清洗，上清樣本用10μL RNase Free水溶解RNA，細(xì)胞樣本用20μL RNase Free水溶解RNA，Nanodrop測定RNA濃度及純度。以1μg RNA為模板量，詳細(xì)操作步驟參照TAKARA試劑盒說明書。

5.病毒相關(guān)模式識別受體及抗病毒IFN檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對感染病毒24 h后4組巨噬細(xì)胞胞內(nèi)Toll樣受體3（TLR-3）、IFN-β和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測。以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA 2μL為模板量，詳細(xì)操作步驟參照TAKARA試劑盒說明書。各因子Ct值以GAPDH為內(nèi)參歸一化為ΔCt，2計(jì)算與對照組的相對表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

GrapadPrism軟件對相對熒光定量的數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用雙側(cè)

t

檢驗(yàn)，

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、甲型流感病毒在低SA豐度肺泡巨噬細(xì)胞中的復(fù)制

圖1可見，SA在MHS肺泡巨噬細(xì)胞表面呈弱陽性表達(dá)，表達(dá)水平明顯低于MDCK上皮細(xì)胞。Aichi、Memphis及PR8感染的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)及上清中流感病毒基因擴(kuò)增結(jié)果均為陽性，但三者之間的拷貝數(shù)存在顯著的差異（詳見圖2），Aichi胞內(nèi)Ct=14.93，上清Ct=19.05；Memphis胞內(nèi)Ct=17.15，上清Ct=21.39；PR8胞內(nèi)Ct=26.86，上清Ct=29.31。

圖1 MDCK和MHS細(xì)胞表面唾液酸表達(dá)情況（×400）

圖2 巨噬細(xì)胞胞內(nèi)（A）及上清（B）Aichi、Memphis及PR8流感病毒檢測結(jié)果

二、甲型流感病毒對巨噬細(xì)胞的侵染

圖3顯示，與NC相比，PR8侵染的巨噬細(xì)胞在24 h內(nèi)雖未出現(xiàn)明顯的濁斑，但細(xì)胞間隙略有增大；Memphis侵染的巨噬細(xì)胞則可在視野中見到數(shù)個(gè)大小不等的濁斑，且部分細(xì)胞已死亡脫落導(dǎo)致視野中貼壁數(shù)量略有減少；Aichi侵染的巨噬細(xì)胞可見大部分細(xì)胞已脫落，少許貼壁細(xì)胞中也有明顯濁斑。宿主細(xì)胞形態(tài)學(xué)的結(jié)果顯示，受Aichi感染的巨噬細(xì)胞在三者之中的病變反應(yīng)最嚴(yán)重也最迅速，PR8感染則最弱，這種形態(tài)學(xué)上的差異趨勢與圖2侵染病毒數(shù)量一致。

圖3 Aichi、Memphis及PR8流感病毒侵染致巨噬細(xì)胞病變(倒置顯微鏡×100)

三、甲型流感病毒侵染對巨噬細(xì)胞IFN及相關(guān)模式識別受體表達(dá)的影響

圖4可見，4組間巨噬細(xì)胞TLR3表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=28.51，

P

<0.001），與NC相比，Aichi侵染的巨噬細(xì)胞24 h后TLR3表達(dá)量升高5倍左右，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=6.40，

P

=0.031）；而PR8和Memphis侵染組與NC相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=1.88，

P

=0.134；

t

=1.96，

P

=0.122）。3株病毒均誘導(dǎo)了IFN-β的高表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=224.00，

P

<0.001)，不同病毒的升高倍數(shù)呈現(xiàn)階梯狀（Aichi/NC=210、Memphis/NC=93、PR8/NC=33），差異均 具 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （

t

=23.63，

P

=0.002；

t

=7.20，

P

=0.012；

t

=6.48，

P

=0.030）。Ⅱ型IFN-γ的表達(dá)則均被抑制，4組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=2 637.00，

P

<0.001），經(jīng)兩兩比較，Aichi、Memphis和PR8與NC間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=140.00、79.00和59.60，

P

均＜0.001）。

圖4 Aichi、Memphis及PR8對巨噬細(xì)胞TLR3受體（A）及IFN-β（B）、IFN-γ（C）表達(dá)的影響

討 論

肺泡巨噬細(xì)胞雖然在抵御外來病原微生物侵襲中具有重要作用，但由于它表面缺乏甲型流感病毒可結(jié)合的SA殘基，因此能否被甲型流感病毒侵染尚存爭議。本實(shí)驗(yàn)選取H1N1的實(shí)驗(yàn)室代表毒株——PR8和H3N2兩株代表毒株——Memphis和Aichi分別侵染巨噬細(xì)胞，其中Memphis和Aichi毒株都在巨噬細(xì)胞及上清中檢測到了高拷貝數(shù)，顯示2株毒株可侵染巨噬細(xì)胞并在其中復(fù)制，釋放子代病毒至上清中，而相同條件下PR8的拷貝數(shù)明顯低于前兩者。3株毒株感染巨噬細(xì)胞的能力有較大差異，提示其途徑和機(jī)制可能與肺上皮細(xì)胞存在不同，它們并非通過SA受體，可能通過跨膜的其他模式識別受體，但仍需要進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

流感病毒侵染可引起宿主細(xì)胞形態(tài)學(xué)上一系列的改變。細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞融合形成濁斑，甚至部分或全部死亡脫落。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Memphis和Aichi侵染可引起小鼠巨噬細(xì)胞病毒或死亡，這種巨噬細(xì)胞死亡、大量釋放炎癥因子的現(xiàn)象可大大提高機(jī)體對病毒的免疫應(yīng)答效率。另外，與毒株之間感染能力有差異類似，不同毒株之間誘導(dǎo)細(xì)胞病變及死亡的能力也有差異。本研究發(fā)現(xiàn)，感染能力弱的病毒株導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞病變較輕，感染能力強(qiáng)的病毒株導(dǎo)致巨噬細(xì)胞病變較重甚至引起細(xì)胞破裂死亡。另有研究表明，滅活的流感病毒可通過凋亡途徑引起淋巴結(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞大量死亡，因此本實(shí)驗(yàn)中3株甲型流感病毒毒株導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞死亡原因，除病毒出芽被動(dòng)破裂死亡外，是否還存在自身誘導(dǎo)機(jī)制，也需進(jìn)一步探討。

巨噬細(xì)胞TLR3位于巨噬細(xì)胞溶酶體膜上，是識別胞內(nèi)流感病毒RNA的重要受體之一，結(jié)合了RNA的TLR3可激活I(lǐng)FN-βTIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白誘導(dǎo)NF-κB抑制蛋白激酶ε/TANK結(jié)合激酶1的募集，干擾素調(diào)節(jié)因子3磷酸化入核誘導(dǎo)IFN-β高表達(dá)，以發(fā)揮抗病毒功能。本文結(jié)果顯示，甲型流感病毒侵染可導(dǎo)致巨噬細(xì)胞TLR3和IFN-β高表達(dá)，但I(xiàn)FN-γ則明顯受抑制，表明在感染甲型流感病毒24 h內(nèi)可激活巨噬細(xì)胞TLR3抗病毒促炎通路，抑制免疫修復(fù)通路，與現(xiàn)有研究結(jié)果相類似。不同毒株誘導(dǎo)TLR3及相關(guān)炎癥因子表達(dá)水平上也有較為明顯的差異，這與病毒對巨噬細(xì)胞侵染能力呈正相關(guān)。值得注意的是，本文中的Aichi誘導(dǎo)TLR3表達(dá)較對照組升高5倍，Memphis和PR8則無組間差異，而3株病毒誘導(dǎo)的IFN-β水平卻有組間差異，說明除了TLR3通路以外還存在其它炎癥因子激活相關(guān)通路。

綜上所述，甲型流感病毒可通過非SA受體依賴途徑感染肺泡巨噬細(xì)胞，且影響巨噬細(xì)胞的一些生物學(xué)功能，不同毒株之間的侵染能力存在較大差異，因此進(jìn)一步探討甲型流感與肺泡巨噬細(xì)胞之間的作用機(jī)制對于甲型流感病毒感染及防治具有重要的理論意義。

利益沖突

所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

徐琦：論文撰寫及修改；楊新燕、楊燦、沃恩康：論文修改；郭潮潭：論文指導(dǎo)和工作支持