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        一株假單胞菌的分離鑒定及其在青海地區(qū)堆肥中的應(yīng)用潛力

        2022-03-03 13:18:58張鑫鵬伊國云李松齡
        浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2022年2期
        關(guān)鍵詞:堆體菌劑油菜

        張鑫鵬,王 信,孫 健,伊國云,李松齡

        (青海大學(xué) 農(nóng)林科學(xué)院,青海 西寧 810016)

        油菜是青海省的第三大種植作物,目前種植面積在14.67萬hm左右。油菜秸稈既含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),又含有較多的纖維素,而纖維素在堆肥過程中較難降解。在利用油菜秸稈堆肥時,向其中加入纖維素降解菌劑,利用微生物降解纖維素,是解決這一問題的有效措施之一。近年來,國內(nèi)外學(xué)者已篩選出部分纖維素高效降解菌株,并將其應(yīng)用到玉米、水稻、小麥秸稈上。例如:王洪媛等篩選出3株纖維素降解真菌,其中,W4菌株表現(xiàn)出較好的秸稈降解能力;于慧娟等篩選出5株真菌,以綠色木霉作為對照菌株,進行小麥秸稈降解試驗,發(fā)現(xiàn)篩選出的真菌的降解率比綠色木霉高2倍以上;Abdel-Rahman等向水稻秸稈堆肥中添加纖維素降解菌,發(fā)現(xiàn)添加菌劑的處理,堆肥腐熟快,且產(chǎn)品質(zhì)量高;謝宇新等從環(huán)境中分離到一株低溫降解菌,在-20 ℃的低溫堆肥中加入此菌能使堆溫迅速升高,堆肥1~2 d后堆溫可達55~65 ℃;孟建宇等從內(nèi)蒙古地區(qū)的土壤中分離出36株纖維素降解菌,其中,屬于假單胞菌屬(sp.)的有10株,且這些菌在10 ℃以下環(huán)境中的酶活相對較高。

        基于上述研究,本文首先在青海當(dāng)?shù)胤蛛x土著菌,從中篩選出纖維素降解能力強的菌株,制成微生物菌劑,然后以豬糞、油菜秸稈為原料,加入制成的微生物菌劑,研究堆肥理化指標(biāo)的動態(tài)變化,以期篩選出適宜青海當(dāng)?shù)貧夂驐l件堆肥發(fā)酵的微生物菌劑,為實現(xiàn)當(dāng)?shù)赜筒私斩挼绒r(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用提供理論依據(jù)和實踐參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 菌種來源

        土壤樣品于2019年4月在青海省西寧市北山土樓觀(36°38′28″N,101°46′18″E,海拔2 380 m)采集,采樣時的環(huán)境溫度為20 ℃。取樣地土壤類型為灰鈣土,土壤顏色為紅色,pH值為7.5,質(zhì)地為黏土,砂石含量30%,植被類型為常綠針葉林油松林。采樣區(qū)氣候冷涼,屬高原大陸性半干旱氣候,年平均氣溫6 ℃,晝夜溫差大。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        富集液體培養(yǎng)基:酵母粉2 g,NaCl 0.1 g,KHPO1.0 g,CaCl0.1 g,NaNO2.5 g,F(xiàn)eCl0.01 g,MgSO0.3 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。

        細菌培養(yǎng)基:酵母粉5.0 g,NaCl 10.0 g,蛋白胨10.0 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。

        羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基:羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)10.0 g,KNO1.0 g,KHPO0.5 g,MgSO0.5 g,NaCl 1.5 g,剛果紅0.2 g,瓊脂16 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。

        液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基:油菜秸稈粉10 g(粉碎后過2 mm篩),KHPO1 g,MgSO0.3 g,NaNO2.5 g,CaCl·6HO 0.1 g,NaCl 0.1 g,F(xiàn)eCl0.01 g,蒸餾水1 000 mL,pH值7.0。

        1.1.3 堆肥原料

        堆肥原料中的豬糞取自青海泰和源農(nóng)牧科技有限公司,秸稈由互助縣青海昱青生物科技有限責(zé)任公司提供。油菜秸稈截成3~5 cm小段。將上述2種堆肥原料的部分理化性質(zhì)整理于表1。

        表1 堆肥原料的部分理化性質(zhì)

        1.2 微生物菌劑制備

        1.2.1 纖維素降解菌株初篩

        取10 g土壤樣品加入90 mL裝有濾紙的富集液體培養(yǎng)基中,置于恒溫搖床振蕩,待濾紙斷裂后,取5 mL樣品轉(zhuǎn)接至富集液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),持續(xù)轉(zhuǎn)接3次。取10 mL經(jīng)富集的樣品于90 mL無菌水中,置于恒溫搖床振蕩30 min,得到10濃度梯度的菌懸液,然后依次制成10~10濃度梯度的菌懸液。取0.1 mL的各濃度梯度的菌懸液涂布于CMC-Na固體平板上,每一梯度重復(fù)3次,25 ℃培養(yǎng)24~72 h后,挑選單菌落反復(fù)劃線于CMC-Na固體平板上,25 ℃培養(yǎng)48 h,然后向培養(yǎng)皿中加入剛果紅進行染色,測量菌株的菌落透明圈直徑(,cm)與菌落直徑(,cm),計算二者的比值,選擇比值較大的菌株進行保存。

        1.2.2 纖維素降解菌株復(fù)篩

        將初篩得到的菌株接種到細菌培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r·min培養(yǎng)24 h,制成孢子懸浮液。按照2%(體積分數(shù))的接種量接種到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r·min培養(yǎng)24 h,4 ℃、6 000 r·min離心10 min,上清液即為測定纖維素酶活所需的粗酶液。用DNS法測定纖維素酶活,具體包括羧甲基纖維素(CMC)酶活、濾紙酶活和外切--葡聚糖酶活。

        CMC酶活測定:向試管中加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的CMC-Na溶液、0.5 mL粗酶液、0.5 mL pH值為4.5的檸檬酸緩沖液,混合均勻后,放置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min,取出后加入1.5 mL二硝基水楊酸(DNS),搖勻,100 ℃水浴10 min,待冷卻后,加入10 mL蒸餾水,測定波長540 nm處的吸光值。

        濾紙酶活測定:向試管中加入50 mg的濾紙、0.5 mL粗酶液、1.5 mL pH值為4.5的檸檬酸緩沖液,其余方法同CMC酶活測定。

        外切--葡聚糖酶活測定:向試管中加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的微晶素底物溶液,其余方法同CMC酶活測定。

        基于測定的各菌株的纖維素酶活,對降解菌株進行復(fù)篩。

        1.2.3 菌株鑒定

        菌株形態(tài)觀察和生理生化特性檢測參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行。

        菌株的16S rDNA基因檢測:采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取菌株DNA。采用細菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系(20 μL):10×PCR緩沖液2 μL,引物(10 μmol·L)各0.5 μL,Plus DNA Polymerase(5 U·μL)0.5 μL,dNTP(10 mmol·L)0.5 μL,模板DNA 2 μL,ddHO 14 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃變性 30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸 8 min。將PCR擴增后的產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對,應(yīng)用MEGA 5.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Bootstrap進行檢驗,重復(fù)次數(shù)為1 000次。

        1.2.4 微生物液體菌劑的制備

        將篩選出的纖維素降解菌株接種于細菌培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)36 h,待菌液濃度達到1×10CFU·mL,即為液體微生物菌劑。

        1.3 堆肥試驗設(shè)計

        堆肥試驗于2020年6月1日—7月20日在青海大學(xué)教學(xué)實踐基地溫室大棚中進行,共持續(xù)50 d。試驗設(shè)置2個處理,分別為試驗組和對照組,每組均設(shè)置3個重復(fù)。

        堆肥時,用新鮮豬糞和油菜秸稈按體積比3∶1的比例進行混合。同時,分別按照物料總質(zhì)量的0.1%和1%的比例添加麩皮和麻渣?;靹蚝?,建成長、寬、高分別為1.8、1.5、0.6 m的條垛式堆體,堆體的C/N在(25~30)∶1,水分含量控制在55%~60 %。試驗組按照10 mL·kg的比例添加液體微生物菌劑,對照組不添加微生物菌劑,其他物料添加量均與試驗組相同。

        各組中的物料攪拌均勻后,用塑料覆蓋保溫,成堆進行發(fā)酵。采用人工翻堆的方式補充堆內(nèi)的新鮮空氣。自堆制開始,第3天進行第一次翻堆,之后每隔3 d翻堆一次。

        取樣時,采用五點取樣法于四周和中心分別取樣,取樣高度為堆高的1/2處,每樣點取500 g樣品,混合后分為2份:一份于4 ℃保存;一份風(fēng)干后粉碎,過40目篩。自制堆開始,分別于0、7、16、24、32、40、50 d取樣。

        1.4 指標(biāo)測定

        自堆肥開始,于每日10:00和16:00各測量1次堆體溫度,在堆體中上部(30 cm)隨機選取5個點,各使用1只LCD-105型插入式數(shù)字溫度計(衡水正旭電子科技有限公司)進行測量,以5個點的平均值作為該時間點堆體的實際溫度,以每日2個時段堆體溫度的平均值作為當(dāng)日的堆體溫度,同時記錄堆肥周圍的環(huán)境溫度。

        稱取樣品5 g,用50 mL蒸餾水(經(jīng)煮沸驅(qū)除CO)浸提,160 r·min振蕩30 min,后靜置10 min,用雷磁PHS-3E型pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)和DDS-307A型電導(dǎo)率儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定樣品pH值和電導(dǎo)率(EC)。

        參照文獻[12]中的方法測定種子發(fā)芽指數(shù)(GI),參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012《有機肥料》測定樣品的全氮含量和有機質(zhì)含量。

        稱取一定質(zhì)量的樣品裝于鋁盒(質(zhì)量已知)中,放入105 ℃烘箱烘干,直到前后2次稱量(間隔2 h)的質(zhì)量差小于0.01 g為止,再次稱量。根據(jù)樣品的質(zhì)量變化,計算含水率。

        堆肥開始前,向堆體中放入12個裝有20 g油菜秸稈的尼龍袋,分別在堆肥的1、15、30、50 d各取出3個尼龍袋(每袋作為1個重復(fù)),測定剩余秸稈的質(zhì)量,基于油菜秸稈的質(zhì)量變化計算降解率。

        1.5 數(shù)據(jù)分析

        用SPSS 25.0軟件進行方差分析,對有顯著(<0.05)差異的,采用Student’stest進行檢驗。采用Origin 2019軟件制圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 纖維素降解菌的篩選與鑒定

        從采集的土壤樣本中分離純化得到5株濾紙降解能力較強的菌株,分別將其編號為HK-15-4、HK-15-5、HK-15-6、HK-15-7、HK-15-8?;趧偣t染色法測定的菌株透明圈()和菌落直徑()(表2),選擇值較高的3株菌(HK-15-6、HK-15-7、HK-15-8)進行復(fù)篩。經(jīng)檢測,HK-15-6菌株的纖維素酶活在供試菌株中最高(表3)。綜合上述結(jié)果,選擇菌株HK-15-6作為后續(xù)研究的對象。

        表2 供試菌株的透明圈直徑(D)與菌落直徑(d)

        表3 部分供試菌株的纖維素酶活性

        2.2 菌株鑒定

        2.2.1 形態(tài)與生理生化鑒定

        菌株HK-15-6在細菌培養(yǎng)基平板上于25 ℃培養(yǎng)24 h,呈黃色半透明圓形菌落,表面光滑且濕潤,質(zhì)地均勻,有光澤,邊緣整齊呈地毯狀。

        生理生化測試結(jié)果表明:菌株HK-15-6為好氧性細菌,可分解葡萄糖產(chǎn)酸,但不能分解蔗糖產(chǎn)酸,革蘭氏染色、VP試驗、甲基紅試驗、檸檬酸鹽試驗均為陰性,菌株具有運動力。

        2.2.2 分子鑒定

        用細菌通用引物擴增菌株HK-15-6,測序后,經(jīng)Blast比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示,該菌株與sp.(MW936631)的親緣關(guān)系最近。

        圖1 菌株HK-15-6的系統(tǒng)發(fā)育樹

        綜合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定和分子鑒定結(jié)果,將菌株HK-15-6鑒定為假單胞菌屬(sp.)。

        2.3 堆肥過程中堆體理化性質(zhì)的變化

        2.3.1 溫度

        一般來說,堆肥過程會經(jīng)歷升溫期、高溫期、降溫期、腐熟期。與對照組相比,試驗組的堆體溫度上升較快,在堆肥第1天就達到51.5 ℃,而對照組在第2天才升至50 ℃。對照組和試驗組堆體溫度維持在50 ℃以上的時間分別為14 d和26 d,最高溫度分別為66.8 ℃和69.2 ℃。進入降溫期后,對照組和試驗組的堆體溫度差值縮小,分別在36 d和32 d堆體溫度降至50 ℃以下。與對照組相比,試驗組堆體升溫較快,且高溫(>50 ℃)期的持續(xù)時間長,堆體進入降溫期的時間較早,說明添加菌劑加快了堆肥的腐熟進程。

        國家標(biāo)準(zhǔn)GB 7959—2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》指出,堆肥過程中堆體溫度達50 ℃以上并至少持續(xù)10 d才可殺死糞便中的致病菌及其有害物質(zhì)。對照此標(biāo)準(zhǔn),對照組和試驗組均滿足要求。

        圖2 堆肥過程中的溫度變化

        2.3.2 pH值

        堆肥過程中,微生物活性與pH值密切相關(guān),當(dāng)pH值為7.0~8.5時,堆肥中微生物的活性和繁殖力最優(yōu)。同時,pH值也是評價堆肥是否腐熟的重要指標(biāo)。本研究中,試驗組和對照組的pH值總體來說均呈先升高后降低再上升最后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(圖3):在堆肥升溫期,堆體的pH值穩(wěn)定在8左右;當(dāng)堆肥進行到24 d時,pH值迅速下降,之后又急劇上升,于32 d時達到峰值,之后又緩慢下降;至堆肥腐熟階段,堆體的pH值穩(wěn)定在7.8~8.1。2個處理的pH值均達到行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012《有機肥料》對pH值的要求(pH值為5.5~8.5)。

        點上無相同小寫字母的表示同一測定時間不同處理下差異顯著(P<0.05),無相同大寫字母的表示同一組不同測定時間下差異顯著(P<0.05)。下同。

        2.3.3 EC值

        EC值可反映堆肥中可溶性鹽的含量,若EC值過高,說明堆肥中鹽類過多,對植物生長會有抑制作用。隨堆肥時間延長,試驗組和對照組堆體的EC值均呈逐漸增加的趨勢,到腐熟階段趨于穩(wěn)定(圖4)。在堆肥的16—50 d,試驗組的EC值顯著(<0.05)低于對照組。至堆肥結(jié)束時,試驗組、對照組的EC值分別為0.88、1.02 mS·cm。研究表明,堆體的EC值小于4 mS·cm,說明堆肥已腐熟,達到安全使用標(biāo)準(zhǔn)。本研究堆肥結(jié)束時,試驗組和對照組的EC值均符合此要求。

        圖4 堆肥過程中電導(dǎo)率(EC)的變化

        2.3.4 發(fā)芽指數(shù)(GI)

        GI是評價堆肥腐熟的重要指標(biāo)。當(dāng)GI達80%~85%時,說明堆肥已基本腐熟。隨堆肥時間延長,試驗組和對照組的GI均呈上升趨勢(圖5)。堆肥前期(0—16 d),試驗組和對照組的GI值差異較小,僅7 d時差異達顯著水平(<0.05);隨后,兩組的差值逐漸擴大,試驗組的GI顯著(<0.05)高于對照組。至50 d時,僅試驗組的GI達85%以上,為90%,比對照組高出12百分點。這說明,添加菌劑對堆肥的促腐效果明顯。

        圖5 堆肥過程中種子發(fā)芽指數(shù)(GI)的變化

        2.3.5 含水率

        堆體含水率是影響堆肥進行的重要因素。堆肥開始時,堆體含水率在55%~65%較為適宜,超過65%時,堆肥會變成厭氧發(fā)酵。由于堆肥過程中堆體的含水量調(diào)節(jié)成本高且不易控制,為此,本研究特在堆肥初期將含水率控制在58%。隨著堆肥時間推進,無論是試驗組還是對照組,堆體的含水率均顯著(<0.05)下降(圖6)。兩組相比,除0、16 d外,其他時間對照組的含水率均顯著(<0.05)高于試驗組。至堆肥結(jié)束時,試驗組含水率為24.29%,對照組含水率為28.75%,均符合行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 525—2012《有機肥料》的相關(guān)要求。

        圖6 堆肥過程中含水率的變化

        2.3.6 全氮和有機質(zhì)

        堆肥前后相比,無論是試驗組還是對照組,其全氮含量均無顯著差異;但兩組相比,堆肥結(jié)束后,試驗組的全氮含量顯著(<0.05)高于對照組。與全氮含量變化不同的是,無論是試驗組還是對照組,堆肥后的有機質(zhì)含量均較堆肥前顯著(<0.05)降低,降幅分別為27.8%和18.4%;堆肥結(jié)束后,試驗組的有機質(zhì)含量顯著(<0.05)低于對照組。這說明,添加菌劑更有利于堆體物料中有機質(zhì)的降解。

        2.3.7 降解率

        整體來看,隨著堆肥進行,試驗組和對照組的降解率均顯著(<0.05)升高,且在堆肥期間(15—50 d)試驗組和對照組的降解率差異顯著(<0.05)。這說明,菌劑的加入在堆肥過程中加速了纖維素的降解。堆肥結(jié)束時,對照組的降解率僅為30.8%,而試驗組達45.6%,較對照組提高14.8百分點。

        表4 堆肥過程中全氮和有機質(zhì)含量的變化

        圖7 堆肥過程中降解率的變化

        3 討論

        篩選出適合青藏高原冷涼氣候條件,且纖維素降解能力強的菌株,對于青海地區(qū)數(shù)量巨大的油菜秸稈和豬糞等廢棄物的資源化利用來說十分關(guān)鍵。目前,已經(jīng)篩選出的纖維素降解菌數(shù)目龐大,但適宜青海地區(qū)堆肥發(fā)酵的菌株相對較少。本研究在常溫條件下篩選得到1株纖維素降解能力強的菌株HK-15-6,經(jīng)鑒定為假單胞菌屬。該菌屬于常溫菌,在30 ℃的培養(yǎng)條件下可生產(chǎn)、制作成微生物菌劑。經(jīng)檢測,HK-15-6菌株的濾紙酶活為20.58 U·mL,低于尚曉瑛等篩選的B6-15菌株(同為假單胞菌屬)的濾紙酶活(24.94 U·mL),這可能是因為本研究未對該菌株的產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化。后續(xù)試驗可考慮對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化,這樣將更有利于該菌株在青海地區(qū)堆肥發(fā)酵中的應(yīng)用。

        將分離得到的菌株制成液體微生物菌劑,用于豬糞和油菜秸稈的堆肥試驗,結(jié)果表明,添加菌劑的試驗組,堆溫升至高溫期的用時較短且高溫持續(xù)時間長,至堆肥結(jié)束時,其全氮含量和種子發(fā)芽指數(shù)都更高。李曉宇等篩選出3株芽孢桿菌,研究其在牛糞堆肥上的效果,結(jié)果表明,添加菌劑的處理在堆肥第3天即進入高溫期并持續(xù)了16 d,最高堆溫為65.4 ℃;李昌寧等的堆肥試驗,在堆肥第2天即進入高溫期,高溫期持續(xù)25 d;孫元烽等的堆肥試驗中,55 ℃以上的高溫期維持10 d。與上述研究相比,本研究在堆溫方面的表現(xiàn)最好,堆體很快地進入高溫期(2 d),高溫持續(xù)時間長(26 d),且最高溫度為69.2 ℃。雖然青海地區(qū)晝夜溫差大,但該菌株仍表現(xiàn)出較好的堆肥效果,顯示出較強的應(yīng)用潛力。

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