樊利虹，王之盛，左之才，*，才冬杰，易 軍，馬曉平，茍麗萍，王 巍

(1.四川農業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130；2.四川農業(yè)大學 動物營養(yǎng)研究所，四川 成都 611130；3.四川省畜牧科學研究院，四川 成都 610066)

皮特不動桿菌()屬于莫拉菌科，不動桿菌屬，不運動的革蘭氏陰性球桿菌，其廣泛存在于自然界，可定植在土壤、污水、蔬菜、皮膚、醫(yī)療器械等環(huán)境中。該菌的營養(yǎng)需求不高，能夠在以乙酸為唯一碳源，氨為唯一氮源的礦物介質中生長，并且在25～41℃之間都能生長；其生化特性與大部分不動桿菌相似，嚴格好氧，氧化酶陰性，過氧化氫酶陽性，葡萄糖非發(fā)酵型，吲哚陰性。近年來，皮特不動桿菌的臨床分離率逐漸升高。在引起人類的感染中，皮特不動桿菌被報道為院內感染重要的條件致病菌，可導致院內病人菌血癥、肺部和尿路感染等；還可引起水生動物武昌魚、泥鰍和斑馬魚的菌血癥，也可能與犬貓呼吸道疾病(化膿性鼻炎和支氣管炎)有關。但目前關于肉牛源皮特不動桿菌相關的報道極少。

隨著肉牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，因長途運輸所致的肉牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease complex，BRDC)時有發(fā)生，給肉牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經濟損失。因導致該病的病原種類繁多，防控難度加大，深入研究其繼發(fā)或伴發(fā)感染細菌的生物特性利于提高對發(fā)生BRDC的新認識。2018年來，我們多次從發(fā)生BRDC且病情反復的病牛鼻拭子中分離到不動桿菌，包括有鮑曼不動桿菌、皮特不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌等，本文對5株皮特不動桿菌的分離情況、生化特性、16S rDNA和基因序列同源性分析及多位點序列分型(MLST)進行了研究，以期對該菌的生物特性有新的認識，為臨床皮特不動桿菌感染的重視和用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

皮特不動桿菌分離自2018年7月四川南充(ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6和ZZCNC1807-7)、宜賓(ZZCJL1807-8)、什邡(ZZCSF1807-9)等地發(fā)生呼吸道疾病肉牛的鼻腔拭子。發(fā)病牛表現(xiàn)有體溫升高(達41℃)、流鼻液、呼吸困難、口有泡沫、部分牛有口腔潰瘍等癥狀，但蹄部、關節(jié)等無異常，有阿莫西林、青霉素、頭孢喹肟、氟苯尼考、替米考星、板藍根等用藥史，但病情總是反復。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯(NB)、革蘭氏染色液、血液瓊脂基礎(青島高科園海博生物技術有限公司)；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂(北京奧博星生物技術有限責任公司)；微量生化管(杭州微生物試劑有限公司)；瓊脂粉、GoldView Ⅰ核酸染色劑(北京索萊寶科技有限公司)；細菌基因組提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker(天根生化科技北京有限公司)；Premix Taq(寶生物工程大連有限公司)。

1.3 引物的設計與合成

參照文獻[18]設計細菌16S rDNA基因通用引物和引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，稀釋至10 μmol·L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實驗用引物序列

1.4 細菌的培養(yǎng)特性

將5株皮特不動桿菌分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌生長情況。再分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、兔血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況；并挑取單個菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)。

1.5 生化特性

對菌株進行氧化酶、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、甘露醇、側金盞花醇、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽、硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、硫化氫、吲哚、MR-VP和明膠等生化試驗。依據細菌微量生化管說明書判定生化試驗結果，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》進行結果分析。

1.6 16S rDNA和gyrB序列擴增及遺傳進化分析

提取菌株的基因組DNA，進行16S rDNA和基因序列擴增，產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序結果與GenBank數(shù)據庫進行BLAST比對分析，并構建系統(tǒng)進化樹和進行同源性分析。

1.7 MLST分型

參照文獻[21-22]，根據MLST(Pasteur)數(shù)據庫公布的7個看家基因(60、、、、、、)的引物序列對分離細菌基因組DNA進行PCR擴增，產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將所得序列提交至MLST數(shù)據庫比對，進行序列型(sequencetype，ST)分析。

2 結果與分析

2.1 革蘭氏染色形態(tài)

5株皮特不動桿菌菌體形態(tài)相似，均為球桿狀的革蘭氏陰性菌(圖1)。

圖示A、B、C、D、E分別代表菌株ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

2.2 菌落形態(tài)觀察

37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，5株菌在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)大小均相似。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上呈圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、微隆起、不透明的白色菌落(圖2 A1-E1)；在血平板上培養(yǎng)均無溶血現(xiàn)象，菌落呈白色圓形，邊緣半透明(圖2 A2-E2)；在麥康凱培養(yǎng)基上呈圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、微隆起、不透明的淡橘色菌落(圖2 A3-E3)；在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈圓形、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、微隆起、不透明的淡紫色菌落(圖2 A4-E4)。

圖示1、2、3、4分別代表各菌株在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

2.3 生化試驗結果

5株菌的氧化酶、覃糖、血清菊糖、側金盞花醇、水楊素、硝酸鹽還原、苯丙氨酸、七葉苷、吲哚、硫化氫、明膠和VP試驗均為陰性；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、DNA酶、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氨基酸脫羧、動力試驗均為陽性。各菌株間比較發(fā)現(xiàn)，部分菌株的部分生化特性與其他菌株完全不同，表現(xiàn)在ZZCNC1807-6蔗糖、甘露醇、丙二酸鹽、MR試驗為陽性；ZZCNC1807-7的乳糖、蔗糖、丙二酸鹽、甘露醇試驗為陽性；ZZCSF1807-9的枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解試驗為陽性，丙二酸鹽試驗為陰性；ZZCNC1807-4和ZZCJL1807-8的生化特性完全一致。綜上可見，來自于牛源的5株菌表現(xiàn)出4種不同的生化類型，其中ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCSF1807-9的部分生化特性如乳糖、MR試驗、枸櫞酸鹽、精氨酸雙水解試驗等發(fā)生了變化(表2)。

表2 部分生化試驗結果

2.4 菌株16S rDNA序列分析

5株菌的16S rDNA基因擴增產物片段大小約為1 500 bp(圖3)，其測序結果經Blast比對分析，結果顯示，與皮特不動桿菌的同源性為99%。系統(tǒng)進化樹(圖4)顯示：5株菌均與皮特不動桿菌(NR117930和NR117621)同在一個分支，表明與皮特不動桿菌親緣關系最近。16S rDNA序列同源性分析結果(圖5、表3)顯示：5株菌的同源性為100%，均與來源于血液(人)、太陽鳥泄殖腔液皮特不動桿菌的同源性為100%，與豇豆源皮特不動桿菌的同源性為99.9%，與痰液、城市污水、泥鰍皮特不動桿菌的同源性達99.5%，與麥田、根際土壤、武昌魚、鰱魚、白紋伊蚊幼蟲源的同源性為90%以上，而與石油污染土壤中分離的皮特不動桿菌同源性僅達81%。

M，DNA 分子質量標準；1，陰性對照；2～6，ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8、ZZCSF1807-9。下同。

圖4 16S rDNA基因系統(tǒng)進化分析

圖5 16S rDNA基因同源性分析

表3 皮特不動桿菌的16S rDNA參考序列

2.5 菌株gyrB基因序列分析

5株菌的基因擴增產物片段大小約為700 bp(圖6)，其測序結果經Blast比對分析，結果顯示，與皮特不動桿菌的同源性為99%?；蛳到y(tǒng)進化樹(圖7)顯示：5株菌均與皮特不動桿菌(LC102633)聚類在一起，而ZZCSF1807-9與另4株菌并未完全聚集在同一分支?；蛐蛄型葱苑治鼋Y果(圖8、表4)顯示：ZZCSF1807-9與另4株菌的同源性僅為97.1%，而其余4株菌之間的同源性為100%；ZZCSF1807-9與澳大利亞(CP042364)、韓國(CP017938)、馬來西亞(CP014477)人源皮特不動桿菌的同源性分別為99.7%、98.5%、97.4%，另4株菌與其同源性分別為97.4%、97.1%、99.7%；ZZCSF1807-9與河南魚源(CP035109)皮特不動桿菌的同源性為97.9%，另4株菌與其同源性為99.1%；而5株菌與表中其他來源的皮特不動桿菌的同源性均低于50%。根據上述結果，可初步將5株菌分為兩類：ZZCNC1807-4、ZZCNC1807-6、ZZCNC1807-7、ZZCJL1807-8為一類，ZZCSF1807-9為另一類。

圖6 分離菌株gyrB序列PCR擴增

圖7 gyrB基因系統(tǒng)進化分析

圖8 gyrB基因同源性分析

表4 皮特不動桿菌的gyrB參考序列

2.6 MLST分型

將上述7個管家基因PCR產物交由上海生工測序，測序結果經整理后上傳MLST數(shù)據庫進行比對，再將5株菌與其他ST型菌株進行聚類分析。結果顯示(圖9)，菌株ZZCSF1807-9為ST214型，其余4株菌分型結果一致，與ST321型最為接近。

圖9 MLST聚類分析結果

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，不動桿菌感染發(fā)病率呈一個全球季節(jié)性模式，發(fā)病率峰值出現(xiàn)在夏季/溫暖月份，而低谷出現(xiàn)在冬季/寒冷月份。本實驗中的皮特不動桿菌來源于高溫多雨的夏季從患有呼吸道疾病的肉牛鼻拭子中分離得到。通過對5株菌進行菌體形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化特性研究，以及16S rDNA和基因序列聚類等研究發(fā)現(xiàn)，該5株菌的菌體形態(tài)和培養(yǎng)特性與大部分不動桿菌一致。將生化結果與不同來源菌株之間比較顯示，來自患呼吸道疾病肉牛的5株皮特不動桿菌和印度淡水魚源皮特不動桿菌均可以利用葡萄糖和阿拉伯糖，而Li等報道的3株武昌魚源皮特不動桿菌的葡萄糖和阿拉伯糖試驗均為陰性；5株來自肉牛呼吸道的皮特不動桿菌與武昌魚源菌株的賴氨酸脫羧酶均為陽性，而印度淡水魚源皮特不動桿菌為陰性。同時，5株分離菌之間比較發(fā)現(xiàn)，ZZCSF1807-9與其余4株菌的部分生化特性存在不同。其中，ZZCSF1807-9的枸櫞酸鹽利用試驗結果為陽性、丙二酸鹽為陰性，而另4株菌枸櫞酸鹽為陰性、丙二酸鹽為陽性；且菌株ZZCSF1807-9的精氨酸雙水解試驗結果與引起武昌魚發(fā)生敗血癥死亡的皮特不動桿菌一致，為陰性，而另4株菌為陽性。這可能因生活環(huán)境的不同，部分菌株為增強其環(huán)境適應力而導致細胞壁增厚，阻礙了某些酶的分泌，使其生化反應發(fā)生改變。

因皮特不動桿菌與醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合體中的其他成員的基因組和表型特征非常接近，16S rDNA基因序列的多態(tài)性不足以將其完全區(qū)分開，因此進一步對5株菌進行了基因序列分析和MLST分型。結果發(fā)現(xiàn)，ZZCSF1807-9與其余4株菌存在進化距離，同源性僅為97.1%。同時，將5株菌與其它來源的皮特不動桿菌進行同源性分析顯示，ZZCSF1807-9與人源皮特不動桿菌之間的同源性較高，為99.7%；而其余4株菌與分離自患病魚類皮特不動桿菌的同源性較高，為99.1%。MLST分型結果顯示，ZZCSF1807-9為ST214型，與2012年和2017年院內病人痰液、尿液分離株為同一型；其余4株與ST321型最為接近，而目前報道的ST321型分離株主要來自院內病人的血液和下呼吸道。但該5株菌的MLST型均與被報道可能為引起魚類感染的優(yōu)勢菌株ST839型皮特不動桿菌不同。上述情況發(fā)生可能因宿主不同或地域環(huán)境差異，以及抗菌藥物的大量使用，而導致不同來源菌株的基因發(fā)生改變。

綜上可見，牛源皮特不動桿菌在部分生化特性表型(如葡萄糖、阿拉伯糖、枸櫞酸鹽、丙二酸鹽和精氨酸雙水解等)和基因以及MLST分型出現(xiàn)了變化；揭示了在不同地域或養(yǎng)殖場環(huán)境的影響下，皮特不動桿菌的生化特性以及毒力強弱會發(fā)生一些適應性的變化。同時，本實驗結果可為探究該養(yǎng)殖場皮特不動桿菌的感染來源及其傳播途徑提供一定的參考，然而關于該菌是否與肉牛呼吸道疾病的發(fā)生有關，還有待進一步研究。