樊帥，金紅，高美云，高敏香，齊泰煜，梁瑩，錢家坤，謝雨虹，李光英，張敏

（1.長春中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腦病中心，長春 130117；4.長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院針灸臨床中心，長春 130021）

抑郁癥作為一種常見的神經(jīng)精神障礙疾病，受此病影響的人數(shù)約占世界人口的10%，并呈現(xiàn)日益增長的趨勢[1]，除其可致殘、致死之外，因抑郁癥并發(fā)癥導致患者過早死亡的風險亦有增加[2]。因患者的個體差異、病情的強隱匿性及致病因素的多樣性導致臨床誤診漏診率高，加之現(xiàn)有診療手段單一，缺乏統(tǒng)一的客觀標準，且藥物治療效果差強人意，不良反應多，復發(fā)率高，因此，抑郁癥的診療手段亟待提高。此病發(fā)生發(fā)展的分子機制目前仍不明，現(xiàn)有多種假說指出其病因可能是由環(huán)境、基因、機體異質(zhì)等多種具有重疊的因果途徑相互作用產(chǎn)生，相關研究亦表明[3]此病發(fā)生發(fā)展可能與機體的神經(jīng)營養(yǎng)、炎癥因子、生物代謝密切相關。近些年，現(xiàn)代科學指導下的蛋白質(zhì)組學技術平臺的搭建為進一步認識此疾病提供了新切入點，生物標志物的研究作為區(qū)別于傳統(tǒng)行為學的生物學研究方法，可以針對蛋白質(zhì)、基因和腦部組織等進行標定測量，為抑郁癥的診斷提供明確的客觀依據(jù)[4]。因此，生物標志物的選取對于抑郁癥發(fā)病的風險評估、病種分類、病情診斷、用藥指導及預后康復顯得非常重要[5]。本文對蛋白質(zhì)組學在不同樣本中篩選抑郁癥生物標志物的研究情況作簡要論述。

1 腦組織

1.1 腦脊液 腦脊液（CSF）與脊神經(jīng)和顱神經(jīng)的腦膜鞘相接[6-7]，可作為潛在生物標記物的候選來源。時寶林等[8]選取8 例抑郁癥患者與正常組對照，提取試驗對象的腦脊液分析，結(jié)果提示試驗組與對照組相比，抑郁癥患者腦脊液中Apo D 和血漿視黃醇結(jié)合蛋白種蛋白表達下調(diào)，poAI 蛋白表達上調(diào)。李惠珍等[9]通過大鼠腦脊液對藥物抗遲發(fā)性抑郁癥神經(jīng)發(fā)生障礙的機制進行探究，分析發(fā)現(xiàn)在實驗大鼠中共檢測出蛋白2 620 個，對照組與遲發(fā)性抑郁癥與實驗組比較，共有差異蛋白176 個；其中GhR、GDF11、NrCAM、NTRK2 與神經(jīng)密切相關。

實驗研究指出腦脊液（CSF）中蛋白有望成為抑郁癥的候選生物標志物[10]，目前在腦脊液中的蛋白質(zhì)組學研究中已經(jīng)明確有1 個以上被鑒定出有效差異蛋白的生物標記物已有42 個，這些蛋白生物標記物的診斷潛力以及其與指向的抑郁癥病理學有直接的關聯(lián)性[11]。在未來使用生物信號檢測手段可能是一個對抑郁癥進行確診或者區(qū)分抑郁癥與其他神經(jīng)精神障礙疾病較好的策略，但由于抑郁癥患者的異質(zhì)性，迄今為止，抑郁癥患者腦脊液提取物中蛋白變化的直接證據(jù)和報道甚少，在不同實驗對照中亦體現(xiàn)出一些相互矛盾的結(jié)果[12]，所以人體腦脊液的提取手段及蛋白篩選方式值得關注。

1.2 海馬組織 海馬體是腦邊緣系統(tǒng)中的一部分，位于丘腦與內(nèi)側(cè)顳葉之間，側(cè)腦室下角的下壁和側(cè)壁上，與情緒相關的大腦區(qū)域（如前額葉皮層）的神經(jīng)纖維相連接[13]。海馬神經(jīng)元的凋亡或衰退可造成學習記憶、情緒調(diào)節(jié)功能的損傷。動物實驗中，對大白鼠和猴子長期慢性應激后，可觀察到其海馬神經(jīng)元樹突萎縮凋亡[14-15]，神經(jīng)影像學亦提示，抑郁癥患者和造模成功的動物模型的海馬體積均有出現(xiàn)縮小的現(xiàn)象[16]。胡永波[17]在有效提取2 組抑郁癥大鼠的海馬突觸蛋白后，采用凝膠電泳和質(zhì)譜檢測手段對差異蛋白質(zhì)組學進行分析。試驗組得到表達中上調(diào)的蛋白質(zhì)共6 個，下調(diào)的蛋白共10 個，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)在遞質(zhì)釋放、能量代謝、物質(zhì)代謝、囊泡調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮著重要作用。胡永波[18]在此基礎上對后續(xù)與抑郁癥相關蛋白功能進行預測，發(fā)現(xiàn)了6 個與突觸傳導功能障礙可能相關的蛋白質(zhì)：網(wǎng)格蛋白輕鏈A、網(wǎng)格蛋白輕鏈B、發(fā)動蛋白1、突觸素2 及囊泡融合ATP 酶、囊泡ATP 合酶亞單位E1；2 個興趣蛋白：網(wǎng)格蛋白輕鏈A、網(wǎng)格蛋白輕鏈B。經(jīng)驗證，本研究同之前雙向電泳試驗結(jié)果基本相同。曹莉莎等[19]運用絕對定量（iTRAQ）蛋白質(zhì)組學技術結(jié)合LC-MS/MS 分析抑郁癥大鼠的海馬組織內(nèi)差異蛋白質(zhì)，共發(fā)現(xiàn)33 個差異蛋白，其中表達上調(diào)蛋白8 個，表達下調(diào)蛋白25個。高耀等[20]亦使用此技術對抑郁癥造模成功的大鼠海馬組織蛋白進行功能富集分析后采用Western blot探究大鼠海馬體的蛋白表達，共鑒別出下調(diào)的蛋白11個：Pmm2、RGD1311899、Ndufs6、Cplx1、Krt10、Ndufab1、Fkbp8、Pafah1b3、Sh3bgrl3、Tbca、Fth1。廖偉[21]使用iTRAQ 和平行反應監(jiān)測（PRM）技術檢測海馬突觸受損后前額葉皮層的蛋白變化，共鑒別出差異蛋白212 個，其中PRM 鑒定到Gfap、Grm2、Spred1、Ppp1r1a、Uqcrh、Tubb6、Ppp1r1b、Gnai2、Urod、Cul1、Gpcpd1、Acadl、Mtor、Lsm8、Cplx2、Rhog、Tsta3 具有顯著差異，對海馬體神經(jīng)的關聯(lián)性進行了驗證。

總的來說，目前已收集了大量抑郁癥海馬體應激相關的差異蛋白并構(gòu)建了基礎框架，為探索抑郁或焦慮的抵抗性、敏感性分子潛在生物標志物提供了參考[22]。盡管iTRAQ 技術與LC-MS/MS 技術作為目前主流的組學蛋白檢測手段為探究抑郁癥的生理病理分子機制提供了有力支持[23]。但因動物與人體差異巨大，人體活體海馬取材條件苛刻，抑郁癥個體異質(zhì)性強的特點等限制，很難通過一個單一的、不分層次的對海馬體整體的研究來清晰的闡述抑郁癥與海馬體之間的關聯(lián)性。若從抑郁癥核心癥狀的病理角度出發(fā)，將不同癥狀的病理機制整合后對其個體化、類別化，將有利于篩選典型生物標志物和闡明海馬組織病變與抑郁癥的關系。

1.3 下丘腦 下丘腦是調(diào)控機體應激反應的核心腦區(qū)和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)的關鍵樞紐，臨床及動物實驗中發(fā)現(xiàn)抑郁癥發(fā)病時常累及此區(qū)域[24]。饒承龍[25]選取抑郁模型組與對照組小鼠各15 只。行為學評價后對其中9 只小鼠的下丘腦進行差異蛋白鑒定，共獲得37 個差異蛋白，其中表達上調(diào)蛋白13 個，表達下調(diào)蛋白24 個，分析提示這37 個差異蛋白主要與氨基酸代謝、糖代謝及谷氨酸能神經(jīng)突觸的異常相關。另有研究[26]基于iTRAQ 和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術對脂多糖（LPS）誘導下的模型小鼠的下丘腦蛋白質(zhì)進行分析。共篩選出具有差異表達的蛋白質(zhì)187種、代謝物27 種，發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、下丘腦突觸后密度蛋白-95（PSD-95）、p-AKT 可能與突觸可塑性的調(diào)節(jié)相關；EPHB2 蛋白可能與谷氨酸能傳遞功能障礙具有一定關聯(lián)性。

下丘腦病變可導致神經(jīng)突觸功能異常，可能是炎癥型抑郁癥患病的重要因素，但在目前的抑郁癥發(fā)病病理機制研究中，下丘腦的生物標志物挖掘少有報道。所以闡明抑郁癥患者下丘腦結(jié)構(gòu)功能的改變，挖掘潛在生物標志物可能為揭示其與蛋白表達譜聯(lián)動的關系提供新的理論依據(jù)。

2 體液

2.1 外周血 徐紅波[27]選取抑郁癥患者與健康對照組各21 例，抽取抑郁癥患者外周循環(huán)血液后使用凝膠電泳和iTRAQ 技術對血漿進行檢測分析，試驗發(fā)現(xiàn)差異蛋白9個，其中5個表達上調(diào)的蛋白：α白蛋白（AFM），載脂蛋白D（Apo D），α1B 糖蛋白（A1BG），載脂蛋白B100（Apo B100），維生素D 結(jié)合蛋白（VDP）。4 個表達下調(diào)的蛋白：信號素3F（S3F），富含組氨酸的糖蛋白（HRG），銅藍蛋白（Cp），以及α2 巨球蛋白（A2M），ApoB100 和A2M 兩個蛋白表現(xiàn)出的高特異性值得我們進一步挖掘。詹遠[28]選取卒中后抑郁癥患者及健康者對照組各15 例，去除高豐度蛋白后對3 組受試者的血液樣本進行分析，篩選出表達顯著下調(diào)蛋白3 個：LRG、ApoC-IICRP、haptoglobin。表達上調(diào)蛋白1 個：gelsolin。提示gelsolin 蛋白表達量上調(diào)與haptoglobin 蛋白表達量下調(diào)可能會是診斷卒中抑郁癥患者潛在的生物標志物。詹遠等[29]在前期研究基礎上再次對載脂蛋白A-IV（ApoA-IV）和富含亮氨酸的α-2-糖蛋白（LRG）、載脂蛋白C-II（ApoC-II）、C-反應蛋白（CRP）、凝溶膠蛋白、觸珠蛋白進行蛋白檢驗分析。發(fā)現(xiàn)與中風受試者相比，卒中后抑郁患者ApoA-IV 蛋白表達上調(diào)；卒中后抑郁患者和健康受試者血漿中ApoC-II、CRP 和LRG 蛋白表達下調(diào)，表明免疫調(diào)節(jié)和脂質(zhì)代謝的紊亂可能是導致卒中后抑郁癥發(fā)病的重要因素。有研究[30]選取7 名抑郁癥患者和7 名健康者，采用生物信息學結(jié)合機器學習方法篩選出高特異性蛋白ITIH4 蛋白和VDB 蛋白，認為其可作為抑郁癥患者血液中潛在的生物標志物。Ryan等[31]基于電休克療法（ECT）對抑郁癥患者與抑郁癥造模成功的大鼠外周血蛋白質(zhì)組變化的分子機制進行探究，質(zhì)譜鑒定出顯著改變的蛋白質(zhì)36 個，其中PEDF 蛋白表達顯著上調(diào)，評估大鼠腦和血液中mRNA 蛋白水平發(fā)現(xiàn)PEDF 蛋白亦有變化，提示PEDF 蛋白可作為評估抑郁癥病情變化的生物標志物。有研究[32]利用微陣列技術在抑郁癥患者外周血中探索lncRNA 與mRNA的共表達模式，篩選出具有差異表達的lncRNA 蛋白2 007 個、mRNA 蛋白1 667 個，發(fā)現(xiàn)mRNA 與基本代謝、神經(jīng)發(fā)育密切相關。通過使用質(zhì)譜分析抑郁癥患者血清后篩選出2個下調(diào)蛋白：鋅-α-2-糖蛋白（ZA2G）和角蛋白II 型細胞骨架1（K2C1），發(fā)現(xiàn)其與色氨酸代謝相關，色氨酸代謝作為激肽釋放酶系統(tǒng)中合成血清素的重要途徑，K2C1 參與其中，該系統(tǒng)可產(chǎn)生緩激肽抗炎介質(zhì)，而MDD 與炎癥因子高度相關，提示ZA2G、K2C1 可作為外周血潛在生物標志物進行探究[33]。有研究[34]對血清中凝血酶進行探究時發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者血清中的蛋白酶原受體受到凝血酶的激活后進一步誘導血小板的過度激活，而活化的血小板分泌出與抑郁癥相關的腦源性親神經(jīng)因子和血清素，這也驗證了外周血可作為炎癥因子的介導物質(zhì)參與抑郁癥分子機制的理論。通過采集99 例帕金森病抑郁癥患者空腹血漿樣品后對其進行鑒定，篩選出17個差異蛋白，富集了12 個與葡萄糖代謝相關的途徑，其中強特異性NOTCH2 蛋白的變化與抑郁癥發(fā)病輕重為正相關，提示其可能是的抑郁癥患者潛在血液生物標志物[35]。

外周血的采集成本低，痛苦小，可重復性高，且其中蘊含大量蛋白信息，涉及到蛋白酶、炎癥因子，神經(jīng)營養(yǎng)因子、血清素等多個抑郁癥相關生物標志物熱點領域[36]，但因其信息的重疊性和復雜性，目前尚不能清晰的對其分子機制進行完整地闡釋，一些作者試圖建立針對血液的整體網(wǎng)絡架構(gòu)，從多角度檢測血漿中蛋白變化對抑郁癥生物體的影響和干擾，這為縮小篩選血漿中潛在生物標志物范圍提供了方向。

2.2 尿液 彭揚[37]采集了試驗組和對照組各30 例的尿液樣品。解離分析后選取興趣蛋白進行Western blotting 驗證。共得到差異蛋白35 個，其中表達上調(diào)蛋白22 個，表達下調(diào)蛋白13 個。經(jīng)質(zhì)譜分析篩選出蛋白29個，對其中5個興趣蛋白：α-烯醇化酶（ENO1）、選取精氨酸琥珀酸合酶（ASS1）、絲氨酸蛋白酶抑制劑B3（SERPINB3）、多配體聚糖結(jié)合蛋白亞型2（SDCBP）、神經(jīng)節(jié)苷脂GM2 激活物（GM2A）進行進一步驗證后，結(jié)果均提示存在顯著差異，可作為候選生物標志物。研究[38]通過采集首發(fā)抑郁癥患者和對照組的尿液樣本，篩選出27 個差異蛋白，分析后得出了與研究[37]相同結(jié)論。有研究[39]基于核磁共振波譜對44名首發(fā)抑郁受試者和52名健康者進行對照試驗，篩選出3 種尿液代謝標志物：丙氨酸甲酸鹽、羥苯乙酸鹽丙二酸鹽、n-甲基煙酰胺。經(jīng)特征曲線（AUC）尿蛋白驗證后證明可作為是診斷MDD的潛在標志物。

尿液樣本相對提取其他生物標志物來說取樣簡便快捷、成本低、無痛苦，試驗[40]表明抑郁癥患者的尿液中去甲腎上腺素指標與腦脊液、血液變化為正相關。因此尿液可作為潛在生物標記物挖掘點對抑郁癥病理機制進行闡釋。

2.3 腸道菌群 諸多試驗結(jié)果表明，腸道菌群與抑郁癥生理病理機制具有一定相關性[41]，腦腸軸中的蛋白質(zhì)改變亦與生物的代謝及炎癥反應密切相關，腸道中的能量代謝可能是導致蛋白質(zhì)網(wǎng)絡發(fā)生改變的重要因素。通過將抑郁癥患者的腸道菌群轉(zhuǎn)移到實驗動物小鼠體內(nèi)，對造模成功的小鼠進行蛋白組學分析后發(fā)現(xiàn)，腸道微生物可導致腦腸軸中多個組織的蛋白表達發(fā)生改變[42]。選取129 名活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者、49 例抑郁焦慮患者與62 例健康人進行對比觀察，并對受試者腸道菌群進行蛋白組學測序分析后發(fā)現(xiàn)，伴有抑郁或焦慮的潰瘍性結(jié)腸炎患者比不伴抑郁或焦慮的潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便內(nèi)微生物菌群豐富度和多樣性降低，血清中免疫球蛋白亦有減少，提示腸道內(nèi)菌群、代謝產(chǎn)物與蛋白質(zhì)的改變密切相關[43]。

腸道菌群失調(diào)和代謝功能紊亂在行為學上已被證實是抑郁癥病理表現(xiàn)和發(fā)病誘因之一，近期的生物學研究亦表明抑郁癥患者腦腸軸中相關蛋白發(fā)生了聯(lián)動式改變[44]，雖然其對應關系在分子機制角度目前并沒有被清晰地闡明，但此發(fā)現(xiàn)為使用蛋白組學技術從腦腸軸中挖掘潛在生物標志物提供了思路。

3 小結(jié)與展望

本研究通過使用蛋白質(zhì)組學方法對生物組織中潛在標志物進行探析，此技術能夠更加直觀、準確的觀察抑郁癥患者各組織中的相關蛋白變化，以便對臨床上單一診斷手段進行革新與補充。生物的腦組織、尿液、血液、糞便中攜有大量的蛋白信息，使用蛋白組學技術可對其中的糖代謝、氨基酸代謝、神經(jīng)營養(yǎng)、活血酶、炎癥因子等生物標志物的結(jié)構(gòu)功能和聯(lián)動關系進行探析歸類，豐富了蛋白組學領域的研究成果，同時也提高了抑郁癥確診工作的準確性，對抑郁癥患者病情進展的監(jiān)控、個體化用藥指導、研制新抗抑郁藥物等提供了生物學方向。

蛋白質(zhì)組學檢測平臺的搭建及檢測理論的日益完善，為挖掘和闡明單個興趣蛋白的作用機制提供了基礎。酶聯(lián)免疫吸附測定法、放射免疫測定法、基質(zhì)輔助激光解吸電離技術等已被證明可對生物標志物進行快速篩選的手段，已被廣泛應用于差異蛋白的遴選工作中。與此同時，基因組學、神經(jīng)生理學、神經(jīng)成像學、代謝組學等技術與蛋白質(zhì)組學技術相互驗證配合，在生物標志物探究領域取得了一定成果。多種手段相結(jié)合對蛋白進行篩選及驗證日益成為篩選興趣蛋白的主流思想。但因目前蛋白組學技術在抑郁癥臨床及實驗領域應用尚不廣泛，故篩選具有特異性興趣蛋白時，受影響于樣本數(shù)量、工具精度、實驗人員技術等無關變量，導致測定結(jié)果波動較大，且介于實驗方式、研究角度、臨床入組樣本量參差不齊，獲得的生物標志物之間功能結(jié)構(gòu)分歧頗多，甚至一些結(jié)論相互矛盾，給不同生物標志物間功能的相互印證制造了一定困難，雖然技術的發(fā)展為其提供了更好的探索環(huán)境，但這種外界環(huán)境的提升并沒有高效率地轉(zhuǎn)化為實驗和臨床成果，所以臨床工作者不僅需要根據(jù)患者的癥狀、體征，結(jié)合量表及生化等相關輔助檢查，對患者盡早診斷治療，減少抑郁癥給患者及家庭帶來的痛苦與損失，更應從多角度對抑郁癥狀與差異蛋白的相關性并詳細記錄，以期能夠從中獲得更具有代表性的相關標記物，為抑郁癥及相關精神類疾病的診斷和治療開辟新思路、新方法。值得肯定的是，從大量的臨床與動物實驗中篩查出的特異性蛋白證據(jù)看來，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展確與腦組織、腦脊液、海馬組織、下丘腦、外周血、尿液、腸道菌群等生物組織結(jié)構(gòu)的蛋白升降存在密切相關性。因此，整合性的構(gòu)建生物標記物網(wǎng)絡架構(gòu)，而不是單獨的關注某一差異蛋白的功能結(jié)構(gòu)，并采用多種方法聯(lián)合，探析差異蛋白及蛋白間的相關性，可能是未來探索人體潛在生物標志物更好的突破點。