王文昌 ,徐 猛 ,趙益菲 ,張玉芬 ,張曉芳*

(1.河北晨光檢測技術服務有限公司,邯鄲 057250;2.晨光生物科技集團股份有限公司,邯鄲 057250)

陳皮為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮[1],具有理氣健脾、燥濕化痰等功效,在許多中藥復方制劑中均有添加。陳皮的活性成分主要為黃酮類化合物,包括橙皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷以及多甲氧基黃酮(如川陳皮素和紅橘素等)[2-5]。目前,陳皮的質量控制主要集中在單一物質即橙皮苷的定性、定量上,如《中華人民共和國藥典》2015年版(ChP 2015)將橙皮苷含量作為衡量陳皮質量的一項重要指標。但是采用單一指標成分無法全面評價陳皮飲片質量,無法體現(xiàn)陳皮多成分、多功效的特點。陳皮提取物主要含有揮發(fā)油、黃酮等活性成分,作為功能食品基料和藥品原料,具有廣闊的應用和開發(fā)前景。

目前,陳皮及其制品中黃酮類化合物的測定方法主要有薄層色譜法[6]、紫外分光光度法[7]、高效液相色譜法[8-9]和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[10-11]等。其中,薄層色譜法主要用于鑒別橙皮苷,紫外分光光度法的專屬性較差。高效液相色譜法在黃酮類化合物含量測定方面的應用較多,所用流動相主要為乙腈-水體系[1,12-13]和甲醇-水體系[8,14-15],但以甲醇-水體系作流動相時,色譜峰峰形較差,且分析時間長。而鮮有文獻對陳皮提取物中活性成分的測定進行報道。

鑒于此,本工作以含乙酸的乙腈溶液作流動相,采用超高效液相色譜法測定陳皮及陳皮提取物中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量,以期為陳皮及陳皮提取物中相應成分的分析檢測和質量控制提供方法指導。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

WATERS ACQUITY Arc型超高效液相色譜儀,配2489型紫外-可見檢測器;TH-600型超聲波清洗器;AUY220型分析天平;DK-98-IIA 型電熱恒溫水浴鍋;FW100型萬能粉碎機。

單標準儲備溶液:0.4 g·L-1,分別取0.01 g蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標準品,用甲醇超聲溶解后定容至25 mL容量瓶中。

混合標準溶液系列:取適量蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標準儲備溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成質量濃度分別為2.5,12.5,25,50,100,200,400 mg·L-1混合標準溶液系列。

蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷標準品的純度大于98%;甲醇和乙腈為色譜純;冰乙酸為優(yōu)級純;試驗用水為超純水,電阻率不小于18.2 MΩ·cm。

陳皮購買于藥店,陳皮提取物由本公司自制。

1.2 儀器工作條件

Waters Cortecs C18色譜柱(100 mm×3 mm,2.7μm);柱溫35 ℃;流動相為體積比17∶83的乙腈-1%(體積分數(shù),下同)乙酸溶液;洗脫方式為等度洗脫;流量0.5 mL·min-1;進樣量3μL;檢測波長283 nm;檢測時間8 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 陳皮提取物

取0.04 g(精確至0.000 1 g)陳皮提取物,用甲醇超聲溶解并定容至100 mL容量瓶中,過0.22μm濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

1.3.2 陳 皮

將陳皮樣品粉碎,使至少95%(質量分數(shù))樣品能通過孔徑為0.425 mm(40目)的篩網。取篩下物于專用樣品袋中,搖晃混勻5 min 以上。取0.5 g(準確至0.000 1 g)樣品于具塞錐形瓶中,加入甲醇100 mL,稱取質量。于70℃水浴回流90 min,再次稱取質量,并用甲醇補足減失的質量,搖勻后靜置15 min,取上清液過0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性試驗

按照儀器工作條件測定100 mg·L-1混合標準溶液,分別于1 d內連續(xù)測定6次和每天測定1次、連續(xù)測定6 d,計算測定值的相對標準偏差(RSD),蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷等4種黃酮類化合物的日內、日間RSD 分別為0.44%～0.46%和0.42%～0.92%,說明儀器的精密度較好,所得色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

由圖1可知,柚皮苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的分離度均較好(分離度均大于1.5,拖尾因子為1.0),說明方法的系統(tǒng)適應性良好。

2.2 陳皮取樣量的選擇

當提取劑甲醇的用量為100 mL 時,考察了陳皮取樣量分別為0.5,1.0,1.5,2.0 g時對其中4種黃酮類化合物峰面積的影響。結果顯示,陳皮樣品中僅檢出了蕓香柚皮苷和橙皮苷,二者的峰面積均隨取樣量的增加而降低。因此,試驗選擇的取樣量為0.5 g。

2.3 回流時間的選擇

試驗考察了回流時間分別為30,60,90,120,150,180 min時對陳皮樣品中蕓香柚皮苷和橙皮苷峰面積的影響,結果見圖2。

圖2 回流時間對蕓香柚皮苷和橙皮苷峰面積的影響Fig.2 Effect of reflux time on the peak areas of narirutin and hesperidin

由圖2可知:兩種黃酮類化合物的峰面積隨回流時間的延長先增加后減小;當回流時間為90 min時,二者的峰面積均較大。因此,試驗選擇的回流時間為90 min。

2.4 標準曲線和檢出限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以4種黃酮類化合物的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示,4種黃酮類化合物標準曲線的線性范圍為2.5～400 mg·L-1,其他線性參數(shù)見表1。

以3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),所得結果見表1。

表1 線性參數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度試驗

按照試驗方法平行制備6份陳皮及陳皮提取物的樣品溶液,并分別在1 d和連續(xù)6 d(1 d測一個)對其中4種黃酮類化合物進行測定,計算檢出成分測定值的RSD。結果顯示:陳皮提取物中蕓香柚皮苷的日內、日間RSD 分別為0.32%和0.38%,橙皮苷的日內、日間RSD 分別為0.41%和0.43%;陳皮中蕓香柚皮苷的日內、日間RSD 分別為0.83%和0.56%,橙皮苷的日內、日間RSD 分別為0.88%和0.60%,說明本方法的精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

按照試驗方法制備陳皮及其提取物的樣品溶液,均放置0,4,8,12,16,20,24 h后對其中黃酮類化合物進行測定。結果顯示,僅檢出蕓香柚皮苷和橙皮苷,這兩種黃酮類化合物測定值的RSD 均小于1.5%,說明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.7 回收試驗

按照試驗方法分析陳皮,其中蕓香柚皮苷和橙皮苷的質量濃度依次為0.020 8,0.136 7 mg·L-1,色譜圖見圖3。對該樣品進行加標(加標量為100倍檢出物含量)回收試驗,計算回收率,二者的回收率分別為98.7%,99.4%。

圖3 陳皮樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of the dried tangerine peel sample

本工作采用甲醇提取結合超高效液相色譜法測定陳皮及其提取物中蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量。該方法精密度和準確度均較好,可用于陳皮及其提取物中蕓香柚皮苷、橙皮苷的日常分析和質量控制。