高 進(jìn)，王永波，劉金葉，郭一蘭，符書源,3

1.海南熱帶海洋學(xué)院/熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點實驗室，海南 三亞 572022

2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 ?？?571126

3.海南省熱帶海水養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，海南 ?？?571126

豹紋鰓棘鱸 (Plectropomus leopardus) 俗稱東星斑，是一種廣泛分布于熱帶和亞熱帶海域的暖水性礁棲魚類[1]。因色彩艷麗、肉質(zhì)細(xì)嫩、經(jīng)濟(jì)價值較高，豹紋鰓棘鱸的市場前景廣闊，養(yǎng)殖發(fā)展?jié)摿薮骩2]。生長性狀為水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的主要經(jīng)濟(jì)性狀，主要受基因、環(huán)境以及兩者間相互作用的影響[3]。闡明生長發(fā)育過程中遺傳因子與環(huán)境因子協(xié)同作用的調(diào)控機(jī)理，將為豹紋鰓棘鱸生長相關(guān)性狀的進(jìn)一步遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。迄今，國內(nèi)外針對豹紋鰓棘鱸的研究多集中于人工繁育[4]、養(yǎng)殖技術(shù)[5]、營養(yǎng)[6]、免疫[7]和生態(tài)[8]等方面。目前豹紋鰓棘鱸的主要養(yǎng)殖模式有工廠化流水養(yǎng)殖和網(wǎng)箱養(yǎng)殖兩種，工廠化流水養(yǎng)殖由于具有可控性強(qiáng)、水體穩(wěn)定和管理方便等優(yōu)勢而成為主要養(yǎng)殖模式[9]，流速是該養(yǎng)殖模式下影響豹紋鰓棘鱸生長的重要環(huán)境因子[10-12]。然而，流速差異對豹紋鰓棘鱸生長發(fā)育的分子作用機(jī)制尚未見報道。

受多變的水流速度甚至湍流的影響，自然界中的魚類特別是洄游性和礁棲性魚類，通常需要選擇合適的棲息環(huán)境以平衡適應(yīng)環(huán)境的能量消耗與自身生長發(fā)育之所需[10]。隨著陸基水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)的快速發(fā)展，流速作為魚類養(yǎng)殖環(huán)境中一個極為重要的環(huán)境因子被廣泛研究。Ogata和Oku[11]開展了流速對日本牙鲆 (Paralichthys olivaceus) 幼魚生長性能的影響實驗，結(jié)果表明流速能夠改變?nèi)毡狙丽业捏w脂肪含量。Merino等[12]在研究差異流速對北美牙鲆 (P.californicus) 幼魚生長的影響時發(fā)現(xiàn)，差異流速會顯著影響其的飼料轉(zhuǎn)化率和生長速度。對循環(huán)流水水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 幼魚進(jìn)行差異流速下生長性能和水質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，在4種流速養(yǎng)殖實驗中，大菱鲆的比生長速率會隨著流速的增加顯著提高，而氨氮總量和弧菌總數(shù)對魚體的影響及其在水體中的累積卻隨之下降，進(jìn)而改善了大菱鲆的養(yǎng)殖環(huán)境[13]。此外，流速同樣影響其他水生生物的生長發(fā)育過程，在差異流速下對全緣馬尾藻 (Sargassum integerrimum) 幼孢子的體質(zhì)量、葉綠素a含量、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶 (Catalase,CAT) 和蛋白質(zhì)濃度等生理指標(biāo)進(jìn)行比對研究，發(fā)現(xiàn)流速對其體質(zhì)量增長和各種生化指標(biāo)均產(chǎn)生了顯著影響[14]。因此，研究流速對水生生物的影響有助于提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和促進(jìn)流水健康養(yǎng)殖的可持續(xù)發(fā)展。

基于二代高通量測序的RNA-Seq是分析不同組織在特定生理狀態(tài)下基因表達(dá)情況的技術(shù)，由于轉(zhuǎn)錄組會隨著生長發(fā)育階段和外界環(huán)境變化而改變，其被廣泛應(yīng)用于生長發(fā)育、應(yīng)激生理和抗病免疫等生物學(xué)過程中與某些特定功能相關(guān)的差異表達(dá)或未知基因的發(fā)掘研究[15-17]。隨著測序技術(shù)的日臻成熟和成本下降，RNA-Seq被應(yīng)用于多種水產(chǎn)動物的關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究[18-19]，如在光周期影響尼羅羅非魚 (Oreochromis niloticus) 腦組織[20]、卵形鯧鲹 (Trachinotus ovatus) 鹽度脅迫[21]和幼體克氏海馬 (Hippocampus kelloggi) 溫度脅迫[22]研究中的應(yīng)用均表明，該技術(shù)已成為闡明水產(chǎn)動物環(huán)境適應(yīng)性分子作用機(jī)制的重要手段，為開展目標(biāo)性狀調(diào)控機(jī)制和育種實踐研究提供了參考。Wang等[23]利用RNA-Seq對豹紋鰓棘鱸的體色差異進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，共篩選到38個參與體色差異調(diào)控的候選基因。Mekuchi等[24]采用RNA-Seq和代謝組方法對豹紋鰓棘鱸的代謝調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果表明支鏈氨基酸在豹紋鰓棘鱸禁食期間的能量代謝中發(fā)揮重要作用，為豹紋鰓棘鱸的代謝機(jī)制解析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持。本文基于RNA-Seq技術(shù)，比較了高、低流速下豹紋鰓棘鱸肝臟的基因表達(dá)差異，探究了豹紋鰓棘鱸對于不同流速水文環(huán)境的適應(yīng)性分子調(diào)節(jié)機(jī)制，為開展豹紋鰓棘鱸“陸海接力”、網(wǎng)箱養(yǎng)殖和增殖放流等提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用豹紋鰓棘鱸為同一繁育批次的平均體質(zhì)量100 g、平均體長約20 cm的6月齡幼魚，養(yǎng)殖于海南海研熱帶海水魚類良種場 (110°68'00''E,19°37'12''N) 的工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖車間。豹紋鰓棘鱸在循環(huán)水養(yǎng)殖車間中的流速一般控制在約0.1 m·s?1，海區(qū)養(yǎng)殖的流速介于0.2～0.8 m·s?1，在主要海區(qū)養(yǎng)殖的平均流速約為0.4 m·s?1。因此，本研究將規(guī)格一致的豹紋鰓棘鱸幼魚分別在正常流速 (0.1 m·s?1,Low flow velocity, LFV) 和高流速 (0.4 m·s?1, High flow velocity, HFV) 下養(yǎng)殖5個月，在LFV和HFV組中分別選取相同規(guī)格的實驗魚各3尾，取肝臟組織，液氮速凍后?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織學(xué)觀察

將實驗魚麻醉后沿排泄孔前部剪開，打開腹腔，切取肝臟組織塊，用4%多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，Leica RM 2135型切片機(jī)切片，厚度為5 μm，常規(guī)H.E染色和油紅O染色，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并攝影。

1.3 文庫構(gòu)建和測序

取冷凍的豹紋鰓棘鱸實驗用魚肝臟組織，按照TRIzol Reagent操作流程提取總RNA，利用DNaseI (RNaseFree) 去除RNA酶污染和殘留的基因組DNA。分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop和Qubit RNA檢測提取的總RNA的完整性、純度和濃度，判定其是否符合下一步文庫構(gòu)建的質(zhì)量要求。分別取高、低流速組中實驗魚各1.0 μg的RNA構(gòu)建兩個RNA樣品池，在兩個樣品池中各取1.5 μg總RNA構(gòu)建cDNA文庫。利用AMPure XP beads純化cDNA，再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，經(jīng)片段大小選擇后通過PCR富集得到cDNA文庫，使用Q-PCR方法對已構(gòu)建文庫的有效濃度 (>2 nmol) 進(jìn)行準(zhǔn)確定量?；诒本┌龠~客生物科技有限公司的 Illumina NovaSeq 高通量測序平臺，以雙末端測序模式完成庫檢合格cDNA文庫的轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控和組裝

為確保后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析的準(zhǔn)確性，需要對原始下機(jī)數(shù)據(jù) (Raw Data) 進(jìn)行過濾，包括去除含有接頭、N (無法確認(rèn)的堿基信息) 比例大于10%以及低質(zhì)量 (Qphred≤10的堿基數(shù)占整條read的50%以上) 的reads，經(jīng)一系列嚴(yán)格質(zhì)控步驟獲得高質(zhì)量測序數(shù)據(jù) (Clean Data)。利用HISAT2軟件[25]將測序reads高效比對到豹紋鰓棘鱸參考基因組 (https://db.cngb.org/search/project/CNP0000859)，用StringTie軟件[26]將比對到基因組上的reads組裝為轉(zhuǎn)錄本，實現(xiàn)基因或轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)估計。

1.5 基因功能注釋

為獲取全面的基因功能注釋信息，比對到參考基因組上的基因和轉(zhuǎn)錄本以參考基因組注釋為準(zhǔn)，而未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū)則被發(fā)掘為該物種的新基因和新轉(zhuǎn)錄本。使用BLAST軟件[27]將新基因與Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam和KEGG數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行序列比對，預(yù)測新基因的氨基酸序列，通過HMMER軟件[28]與Pfam數(shù)據(jù)庫比對獲得注釋信息。

1.6 差異基因GO和KEGG富集

基于R語言GOseq程序包的Wallenius noncentral hyper-geometric數(shù)學(xué)模型，對篩選的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析[29]。以KEGG數(shù)據(jù)庫中Pathway為單元，使用KOBAS 2.0軟件[30]的超幾何檢驗方法檢測差異表達(dá)基因中顯著性富集的Pathway。

1.7 差異表達(dá)基因篩選

將組織樣品中比對到參考基因組的reads數(shù)目和轉(zhuǎn)錄本長度進(jìn)行歸一化，采用FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped) 法[31]計算轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)量。利用DESeq2軟件[32]對各組樣本中的基因表達(dá)進(jìn)行差異顯著性分析，獲取高低流速組之間的差異表達(dá)基因集，具體標(biāo)準(zhǔn)為Fold Change≥2且FDR (False Discovery Rate)<0.05。

1.8 實時熒光定量 PCR (qPCR) 驗證

利用qPCR對14個差異表達(dá)基因在不同流速下豹紋鰓棘鱸肝臟中的表達(dá)水平進(jìn)行定量驗證 (引物見表1)。RT-qPCR的反應(yīng)體系共15 μL，其中包含 7.5 μL 2×Power Green qPCR Mix (東盛生物，廣州)，0.6 μL 上下游引物 (10 μmol·L?1)，1.5 μL cDNA，4.8 μL ddH2O。對每個樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)，并將反應(yīng)置于Roche LightCycler 96 (羅氏，瑞士) 定量儀上運行。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)，CT通過溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性。以β-actin為內(nèi)參基因 (F: CACCACAGCCGAGAGGGA；R: TCTGGGCAACGGAACCTCT)，采用 2?ΔΔCT方法[33]分析定量基因相對表達(dá)水平。使用R語言對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 本研究所用引物及其序列Table 1 Sequences of primers used in this study

1.9 SNP檢測

采用GATK軟件對HISAT2比對結(jié)果進(jìn)行單核苷酸變異 (Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)位點檢測。根據(jù)SNP位點在參考基因組上的位置以及參考基因組上的基因位置信息，利用SnpEff軟件對檢測到的SNPs進(jìn)行注釋和變異影響預(yù)測。SNP位點按照堿基替換方式不同分為轉(zhuǎn)換和顛換2種類型，而按照等位數(shù)目差異則可以劃分為純合型和雜合型。

2 結(jié)果

2.1 不同流速下肝臟組織觀察

實驗魚肝臟H.E染色顯示 (圖1) ，LFV和HFV兩組魚肝臟組織的形態(tài)差異不大，其最外層均有由一層扁平上皮和結(jié)締組織構(gòu)成的漿膜層組成，漿膜層上均附有大的脂肪顆粒，肝細(xì)胞呈不規(guī)則橢圓形排列，細(xì)胞核大而圓，一般為一個，胞質(zhì)豐富，多呈嗜酸性，胞質(zhì)內(nèi)含大量脂肪，占據(jù)肝細(xì)胞的大部分空間，細(xì)胞核被空泡狀脂滴擠到一側(cè)。處于肝臟結(jié)締組織分支之間的部分為肝實質(zhì)，其主要成分是肝細(xì)胞和竇狀隙。彼此相連的肝細(xì)胞排列組成放射狀的細(xì)胞索，而細(xì)胞索又互相連接形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀間隙里則是由內(nèi)皮細(xì)胞、星形的枯否氏細(xì)胞和脂肪細(xì)胞組成的肝血竇。實驗魚肝臟油紅O染色顯示 (圖2) ，LFV和HFV兩組實驗魚肝臟組織中脂肪含量差異明顯，LFV實驗組肝臟中的脂肪含量明顯高于HFV實驗組。

圖1 不同流速下豹紋鰓棘鱸肝臟組織 (H.E染色)Fig.1 Liver tissues (H.E staining) of P.leopardus with different flow velocities

圖2 不同流速下豹紋鰓棘鱸肝臟組織 (油紅O染色)Fig.2 Liver tissues (Oil red O staining) of P.leopardus with different flow velocities

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計及質(zhì)量分析

本研究分別構(gòu)建了差異流速組中各3尾豹紋鰓棘鱸實驗用魚的cDNA文庫，并進(jìn)行RNA-Seq分析。Raw Reads經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)量控制后獲得50.20 Gb 的Clean reads，且各樣品的Q30堿基占比均≥94.80%，GC含量介于50.44%～51.54%，具體統(tǒng)計數(shù)據(jù)見表2。測序數(shù)據(jù)整體質(zhì)量可靠性高，能夠滿足后續(xù)分析的要求。

表2 豹紋鰓棘鱸肝臟文庫測序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計Table 2 Output statistics of P.leopardus liver library sequencing

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組的比對

利用HISAT2軟件將Clean reads與豹紋鰓棘鱸參考基因組進(jìn)行序列比對，獲取reads在參考基因組或是相應(yīng)基因中的位置信息。從比對效率即比對到參考基因組上的reads占Clean reads百分比的統(tǒng)計結(jié)果 (表2) 來看，各樣品的reads與參考基因組的比對效率在92.77%～93.78%，且唯一比對位置的reads占比≥85.54%，基于參考基因組的比對和組裝能夠滿足相應(yīng)分析的需求。

2.4 差異基因GO功能分類和KEGG富集分析

GO (Gene Ontology) 數(shù)據(jù)庫是一個結(jié)構(gòu)化的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)注釋系統(tǒng)，能夠?qū)Ω魑锓N進(jìn)行基因和蛋白功能的限定和描述。將所有與參考基因組比對獲得的基因與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，共有12146個基因被歸屬到56個類別，其中高低流速組差異表達(dá)基因 (DGEs) 有1124個(圖3)。GO分類結(jié)果顯示，生物學(xué)過程共涉及23個功能分類，參與細(xì)胞過程(Cellular process, 530)、單組織過程 (Single-organism process, 460) 和代謝過程 (Metabolic process,430) 的差異基因最多；細(xì)胞成分涉及16個功能分類，細(xì)胞 (Cell, 447)、細(xì)胞組分 (Cell part, 440) 和膜(Membrane, 386) 的差異基因最多；分子功能涉及16個功能分類，結(jié)合 (Binding, 581)、催化活性(Catalytic activity, 442) 和轉(zhuǎn)運活性 (Transporter activity, 72) 差異基因最多。

圖3 豹紋鰓棘鱸基因GO分類圖Fig.3 Gene ontology (GO) assignment of genes of P.leopardus

將基因序列與KEGG數(shù)據(jù)庫中的通路進(jìn)行比對注釋，結(jié)果顯示573個差異表達(dá)基因參與了154條KEGG通路 (圖4)，其中最顯著的PPAR信號通路內(nèi)包括差異表達(dá)基因20個，其次顯著的氨基酸生物合成通路內(nèi)包括差異表達(dá)基因21個，涉及其中的基因富集效果都極顯著 (P<0.01)。此外，包含精氨酸合成、初級膽汁酸合成、碳代謝、甘油酯代謝和脂肪細(xì)胞因子信號通路在內(nèi)的7個最為顯著的通路均直接或間接涉及脂肪合成代謝及沉積、相關(guān)酶的活性、基因表達(dá)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。為了明確豹紋篩棘鱸不同流速下肝臟組織之間的差異性，本研究制備了肝臟組織切片進(jìn)行組織學(xué)觀察 (圖1和圖2)，其觀察結(jié)果與RNA-Seq分析中篩選到最為顯著的差異基因富集通路有相當(dāng)高的一致性。

圖4 豹紋鰓棘鱸差異表達(dá)基因KEGG富集圖Fig.4 KEGG enrichment of differentially expressed genes of P.leopardus

2.5 差異基因表達(dá)分析

對6個轉(zhuǎn)錄測序樣品比對到參考基因組上的基因采用FPKM法定量，利用DESeq2進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，獲取高低流速組兩個生物學(xué)條件之間的差異表達(dá)基因 (Different expression gene,DEG) 集。在LFV-HFV的DEG分析過程中，共篩選到DEGs 1 977個，999個基因在低流速組魚肝臟上調(diào)，978個基因在高速組魚肝臟上調(diào)。在不同流速下豹紋鰓棘鱸肝臟差異表達(dá)基因中篩選顯著富集通路包含的部分基因，如cpt1a、cyp7b1、irs2、socs3、adpgk、kmt5c和acsbg2等 (表3)。本研究選擇RNA-Seq分析中的14個差異表達(dá)基因，通過RT-qPCR技術(shù)對RNA-Seq結(jié)果進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示挑選的基因表達(dá)模式與RNA-Seq分析一致，表明RNA-Seq分析結(jié)果可信 (圖5)。

表3 豹紋鰓棘鱸不同流速顯著差異通路中部分候選基因表達(dá)模式Table 3 Expression pattern of partial candidate genes of P.leopardus in significant pathways with different flow velocity

圖5 RT-PCR驗證RNA-Seq結(jié)果Fig.5 Validation of RNA-Seq data by using RT-qPCR

2.6 SNP注釋分析

單核苷酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphisms, SNP) 是指在基因組上由單個核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)記，變異位點豐富，是一種重要的輔助育種標(biāo)記。對豹紋鰓棘鱸肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP的篩選和注釋將為豹紋鰓棘鱸分子標(biāo)記的開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有助于其目標(biāo)性狀的分子遺傳機(jī)制解析和新品種選育。對各樣品中注釋的SNP位點數(shù)目、轉(zhuǎn)換類型和顛換類型占比進(jìn)行統(tǒng)計 (表4) 發(fā)現(xiàn)，各項統(tǒng)計指標(biāo)在樣品間差距較小，表明基于本研究數(shù)據(jù)的SNP信息挖掘結(jié)果可靠性高，具有進(jìn)一步分析的意義。SNP突變類型統(tǒng)計結(jié)果 (圖6) 顯示，主要的突變類型為A(G)/G(A)和C(T)/T(C)，占據(jù)所有突變類型的65%以上。

表4 SNP位點統(tǒng)計表Table 4 Output statistics of SNP loci

圖6 SNP突變類型統(tǒng)計分布圖Fig.6 Statistical distribution of type of SNP mutations

3 討論

3.1 流速變化對魚類生長的影響

水流速度是魚類生活環(huán)境中最為重要且復(fù)雜的生態(tài)因子之一，主要通過刺激魚類感覺器官來影響其新陳代謝和生理生態(tài)反應(yīng)，最終影響魚類的生長發(fā)育、肉纖維組成、體營養(yǎng)成分和免疫功能[34]。婁宇棟等[35]開展了美國紅魚 (Sciaenops ocellatus) 的流速脅迫肝臟轉(zhuǎn)錄組實驗，篩選出大量參與各類重要生物學(xué)過程和代謝途徑的顯著性差異表達(dá)基因，對美國紅魚應(yīng)對流速脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制有了新的認(rèn)識。而拉氏鱥 (Rhynchocypris lagowskii) 幼魚生長、非特異性免疫能力及脂肪酸組成受流速差異影響的研究[36]也表明，相較于低流速，高流速會增加魚體能量的消耗，多不飽和脂肪酸含量更高。目前，豹紋鰓棘鱸在工廠化流水養(yǎng)殖中的流速多控制在0.1 m·s?1左右，而海區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的平均流速在0.4 m·s?1左右。對豹紋鰓棘鱸養(yǎng)殖過程的長期觀測發(fā)現(xiàn)，流速差異并不會導(dǎo)致體長或體質(zhì)量等生長性狀表型產(chǎn)生直接變化。然而，肝臟油紅O染色結(jié)果 (圖2) 顯示，光學(xué)顯微鏡下LFV組 (圖2-d) 的脂滴細(xì)胞定位區(qū)域和密度明顯高于HFV組 (圖2-c)，這與RNA-Seq分析篩選到大量參與脂肪合成代謝相關(guān)顯著通路的結(jié)果相對應(yīng)?；谏鲜霰y鰓棘鱸不同流速環(huán)境中的養(yǎng)殖情況，本研究開展了高、低差異流速的養(yǎng)殖實驗，通過肝臟組織轉(zhuǎn)錄組測序分析差異流速組個體之間的基因表達(dá)量變化，探究豹紋鰓棘鱸對流速變化適應(yīng)性的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。

3.2 豹紋鰓棘鱸肝臟RNA-Seq分析

魚類肝臟是維系其生理機(jī)能最重要的器官之一，在魚腦 (各種神經(jīng)內(nèi)分泌因子)-腦垂體 (分泌生長激素)-肝臟 (產(chǎn)生類胰島素生長因子) 軸的調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用[37]。而膽固醇合成和脂肪酸氧化也主要在肝臟中進(jìn)行，且經(jīng)由腸道吸收的營養(yǎng)物質(zhì)能夠被肝臟轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育和物質(zhì)代謝[38-39]。由于肝臟在動物機(jī)體活動中發(fā)揮著重要作用，基于肝臟組織的RNA-Seq被廣泛應(yīng)用于各種目標(biāo)性狀和環(huán)境對機(jī)體影響的分子生理機(jī)制研究[40-42]。本研究利用 0.1 和 0.4 m·s?1兩種流速下豹紋鰓棘鱸的肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，LFV-HFV上調(diào)基因富集最顯著的生物學(xué)過程為心臟發(fā)育和微管相關(guān)進(jìn)程，而LFV-HFV下調(diào)基因富集最顯著的生物學(xué)過程則為基因表達(dá)的節(jié)律調(diào)控和三羧酸循環(huán)。魚類心臟是形成較早且發(fā)揮重要功能的器官之一，其發(fā)育過程會直接影響血管的發(fā)生和生成[43]。微管存在聚合和解聚的動力學(xué)特性，在細(xì)胞形態(tài)維持、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)輸送等過程中具有重要作用[44]。參與表達(dá)節(jié)律調(diào)控的基因在轉(zhuǎn)錄過程中和轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，通過節(jié)律調(diào)控提高生物機(jī)體對環(huán)境變化的適應(yīng)性[45]。三羧酸循環(huán)是糖類、脂類和氨基酸的最終代謝通路，是它們之間相互聯(lián)系的樞紐。差異表達(dá)基因富集最顯著的PPRA信號通路則在調(diào)控皮下脂肪與肌內(nèi)脂肪差異沉積等方面發(fā)揮作用[46]，結(jié)合組織切片結(jié)果 (圖2) ，本研究表明流速差異可能導(dǎo)致豹紋鰓棘鱸脂肪的代謝形成產(chǎn)生顯著變化。此外，本研究還檢測到了446928個潛在的SNP位點。這些差異表達(dá)基因和SNP位點的篩選為豹紋鰓棘鱸基因資源挖掘提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.3 豹紋鰓棘鱸差異流速適應(yīng)性相關(guān)基因

為探究豹紋篩棘鱸不同流速環(huán)境下適應(yīng)性分子機(jī)理，本研究在RNA-Seq分析中通過KEGG分析，從豹紋篩棘鱸肝臟轉(zhuǎn)錄組中篩選出多個可能涉及差異流速適應(yīng)性的顯著通路 (圖5) 和參與其中的候選基因 (表3)。在上述顯著通路和候選基因中，氨基酸生物合成通路在控制脂肪細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要作用，氨基酸調(diào)控脂肪代謝的機(jī)制研究結(jié)果[47]發(fā)現(xiàn)，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和甲硫氨酸這4種必需氨基酸是脂肪合成代謝過程中起重要調(diào)控作用的營養(yǎng)調(diào)控因子。精氨酸合成通路對脂類代謝具有調(diào)節(jié)作用[48]，精氨酸經(jīng)過一氧化氮合酶的催化生成NO，繼而促進(jìn)葡萄糖和脂肪酸的氧化分解和脂肪細(xì)胞脂解作用，抑制脂肪組織沉積。初級膽汁酸合成通路主要涉及膽酸、鵝脫氧膽酸及相應(yīng)結(jié)合型膽汁酸，初級膽汁酸在一定條件下可轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸，膽汁酸合成是膽固醇和脂代謝的主要途徑，其主要功能是促進(jìn)脂質(zhì)和脂溶性維生素的消化和吸收[49-50]。甘油酯代謝過程則主要涉及甘油磷脂代謝、磷脂酸合成、脂肪酸的合成與降解。Hao等[51]對一種特殊類型的短鏈脂肪酸 (丁酸) 進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，cpt1a活性經(jīng)丁酸鹽可增強(qiáng)進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸氧化，cpt1更被認(rèn)為是影響脂肪酸氧化的決定因素。山羊cpt1a基因克隆表達(dá)分析則表明，cpt1a的基因表達(dá)量與各肌肉組織肌內(nèi)脂肪含量均顯著正相關(guān)，其可能在脂肪沉積過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[52]。cyp7b1在膽汁酸合成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[53]，作為膽汁的重要成分，膽汁酸在脂肪代謝中起重要作用。irs2是胰島素促進(jìn)肝糖原合成和一致葡萄糖輸出的重要中間因子[54]，而miR-33a在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化研究則表明miR-33a靶向irs2抑制綿羊體脂肪細(xì)胞分化和脂滴沉積[54]。kmt5c是一種賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，Zhao等[55]在棕色脂肪前體細(xì)胞分化過程中敲除kmt5c發(fā)現(xiàn)，kmt5c會抑制脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱功能，且kmt5c可以通過調(diào)控ucp1基因表達(dá)控制白色脂肪棕色化。D'Andre等[56]對雞脂肪發(fā)育基因的鑒定和描述研究發(fā)現(xiàn)，acsbg2基因與腹脂重和腹脂率顯著相關(guān)，在脂肪形成過程中起重要作用。綜上，筆者推測豹紋鰓棘鱸肝臟在差異流速養(yǎng)殖環(huán)境中可能通過調(diào)節(jié)脂類合成代謝來調(diào)控流速變化適應(yīng)性的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本文在轉(zhuǎn)錄水平初步探討了差異流速情況下豹紋鰓棘鱸個體之間相關(guān)基因表達(dá)水平的變化情況，通過肝臟組織學(xué)觀察、量化基因表達(dá)水平以及差異表達(dá)基因分析，對豹紋鰓棘鱸流速變化適應(yīng)性機(jī)制開展了探索研究。本研究不僅為豹紋鰓棘鱸經(jīng)濟(jì)性狀的分子遺傳機(jī)制解析和新品種選育提供了理論依據(jù)，也為其進(jìn)一步的分子標(biāo)記開發(fā)、良種選育和養(yǎng)殖海區(qū)選址奠定了基礎(chǔ)。