徐 豪，梁緒虹，王叢叢,2，李 綱,2

1.上海海洋大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306

2.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心/大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306

莖柔魚 (Dosidicus gigas) 隸屬于槍形目、柔魚科、莖柔魚屬，是柔魚科體型最大、資源量最為豐富的種類之一[1-2]。莖柔魚廣泛分布于東太平洋 (140°W以東, 40°N—47°S)，加利福尼亞灣至智利北部是其主要分布區(qū)域，特別是秘魯和加利福尼亞灣海域是其重要漁場(chǎng)[3]。目前，莖柔魚已成為世界頭足類產(chǎn)量最高的種類之一，也是中國(guó)魷釣漁業(yè)重要的捕撈對(duì)象。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織 (FAO) 統(tǒng)計(jì)，2018年莖柔魚產(chǎn)量已占中國(guó)頭足類產(chǎn)量的30%以上[4]。根據(jù)性成熟時(shí)胴長(zhǎng)，Nigmatullin等[3]將東南太平洋莖柔魚分為3個(gè)群體：大表型群[成年雄性的胴長(zhǎng) (ML) 400～500 mm、雌性550～650 mm至1 000～1 200 mm]，中表型群[分別為240～420 mm和280～600 mm]和小表型群[分別為130～260 mm和140～340 mm]。研究表明，莖柔魚個(gè)體繁殖力與其個(gè)體大小密切相關(guān)，體型越大，其繁殖力也會(huì)越強(qiáng)[5-6]，了解不同表型莖柔魚間的群體結(jié)構(gòu)是對(duì)其進(jìn)行資源評(píng)估和管理必不可少的方面。同時(shí)，魷魚類又處于生態(tài)系統(tǒng)中承上啟下的中間地位，其資源的變動(dòng)直接影響到整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[7]。因此，作為南太平洋區(qū)域漁業(yè)管理組織重要的管理對(duì)象，科學(xué)有效地對(duì)莖柔魚資源進(jìn)行評(píng)估管理是維持莖柔魚漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重中之重，種群是漁業(yè)管理的基本單位，對(duì)莖柔魚種群結(jié)構(gòu)及其時(shí)空分布變動(dòng)的認(rèn)知將直接影響資源評(píng)估結(jié)果及后續(xù)的資源管理。

東南太平洋莖柔魚分布非常廣泛，跨越不同氣壓帶、洋流系統(tǒng)和生態(tài)系統(tǒng)，棲息環(huán)境復(fù)雜多變，單一的形態(tài)學(xué)手段無(wú)法科學(xué)有效地將不同區(qū)域、不同大小以及不同環(huán)境條件下的莖柔魚群體進(jìn)行劃分，而種群遺傳學(xué)研究則可通過一定的DNA標(biāo)記識(shí)別離散的亞種群，從而了解種群結(jié)構(gòu)、種內(nèi)變異性和基因流。由于莖柔魚在漁業(yè)及生態(tài)系統(tǒng)中的重要性，近年來對(duì)莖柔魚群體遺傳學(xué)的研究也逐漸增多，如利用線粒體DNA標(biāo)記COI[8]對(duì)不同區(qū)域莖柔魚群體遺傳差異的研究，Sanchez等[9]利用線粒體DNA標(biāo)記ND2 和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)東太平洋的莖柔魚種群歷史動(dòng)態(tài)的研究，以及劉連為等[10]利用線粒體DNA標(biāo)記Cyt b和微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)秘魯外海莖柔魚大型群與小型群體進(jìn)行群體遺傳學(xué)的研究。中國(guó)遠(yuǎn)洋魷釣漁業(yè)在東南太平洋的主要作業(yè)海域?yàn)槌嗟兰懊佤斖夂９：Ｓ颍煌Ｓ虻男猿墒烨o柔魚的漁獲物胴長(zhǎng)存在顯著差異 (3種表型)，而目前國(guó)內(nèi)尚未見對(duì)大、中、小3種表型以及主要作業(yè)海域莖柔魚遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行評(píng)估，為此本研究選取進(jìn)化速率適中的線粒體NADH脫氫酶亞基2 (ND2) 基因來分析東南太平洋不同表型莖柔魚的群體遺傳結(jié)構(gòu)，以期為莖柔魚漁業(yè)資源的管理和可持續(xù)開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和DNA提取

實(shí)驗(yàn)樣本源自于舟山寧泰遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)觀察員計(jì)劃信息船及觀察員于2018年和2019年在東南太平洋公海隨機(jī)采集的莖柔魚樣本，主要的3塊采樣區(qū)域 (A、B、C)見圖1。莖柔魚樣本經(jīng)速凍、冷藏后運(yùn)回上海海洋大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。選擇性成熟個(gè)體，根據(jù)胴長(zhǎng)將樣本分成大、中、小3種表型組，并取其胴體肌肉，利用標(biāo)準(zhǔn)酚氯仿抽提法提取基因組DNA[11]，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，-20 ℃保存?zhèn)溆?。樣本采集時(shí)間、區(qū)域、數(shù)量以及對(duì)應(yīng)體長(zhǎng)組見表1。

表1 樣本采集區(qū)域與數(shù)量Table 1 Area and number of samples

1.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

反應(yīng)體系為25 μL，其中DNA模板0.3 μL、PCRMix 12.5 μL、上下游引物各 1 μL、雙蒸水 10.2 μL。PCR擴(kuò)增引物序列根據(jù)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)，參考序列為莖柔魚線粒體ND2序列 (Gene ID 5 469 438)，由生工生物工程(上海) 有限公司合成，具體引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

擴(kuò)增ND2序列的反應(yīng)條件為95 ℃ 2 min；95 ℃ 60 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，26 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程(上海) 有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

測(cè)序后的ND2基因序列在MEGA 7.0[12]軟件中選用Clustal W比對(duì)后進(jìn)行裁剪得到可用的序列，并根據(jù)鄰接法(Nighbour-joining, NJ) 以鳶烏賊 (Symplectoteuthis oualaniensis)ND2基因序列作為外群繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。通過軟件DnaSP 6.12[13]分析核苷酸組成、單倍型數(shù) (H)、單倍型多樣性指數(shù) (Hd)、核苷酸多樣性指數(shù) (Pi) 并計(jì)算得到用于后續(xù)分析的單倍型數(shù)據(jù)。利用獲得的ND2單倍型數(shù)據(jù)在Network 4.0[14]軟件中制作單倍型網(wǎng)絡(luò)圖，并在Arlepuin 3.5.2.軟件[15]中通過AMOVA分析計(jì)算遺傳分化系數(shù) (Fst)和基因流 (Nm) 并評(píng)估種群的遺傳多樣性水平。根據(jù)Tajiam'sD[16]、Fu'sFs[17]中性檢驗(yàn)結(jié)果和核苷酸不對(duì)稱分布情況[18-19]對(duì)種群歷史動(dòng)態(tài)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

經(jīng)過Clustal W序列比對(duì)裁剪，獲得90條長(zhǎng)度為876 bp的莖柔魚部分ND2基因序列，包含33個(gè)單倍型，其中22個(gè)單倍型分別只屬于3個(gè)群體中的某一個(gè)，所占總頻率為0.666 7。在分析的ND2基因序列中，檢測(cè)到31個(gè)可變(多態(tài)) 位點(diǎn)，其中包含17個(gè)單一突變位點(diǎn)和14個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。另外，90個(gè)莖柔魚樣本的C、T、A、G 4種堿基的比例分別為7.28%、22.40%、33.12%、37.2%，A+T的含量 (55.52%) 顯著高于C+G的含量 (44.48%)，其中G含量最高，C含量最低。

2.2 遺傳多樣性分析

3個(gè)表型群體莖柔魚的Hd均較高，其中中表型群的Hd(0.872) 高于另外2個(gè)表型群 (0.797和0.768)，Pi同樣如此(表3)?；贜D2基因序列的AMOVA分析結(jié)果表明來源于種群內(nèi)的變異達(dá)到了100.45%，說明所有的變異都來自群體內(nèi)。

表3 基于ND2序列的莖柔魚遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of ND2 gene sequences in D.gigas

Fst可用來表征種群內(nèi)各亞種群間的近交程度，兩兩表型群間的Fst均小于0.05且P均大于0.05，而兩兩表型群間的Nm均遠(yuǎn)大于1，這表明東南太平洋大、中、小3種表型的莖柔魚群體間具有頻繁的基因交流，未出現(xiàn)顯著的遺傳分化 (表4)。

表4 基于ND2基因的莖柔魚群體間遺傳分化系數(shù) (對(duì)角線下方) 和基因流 (對(duì)角線上方)Table 4 Population pairwise Fst (below diagonal) and gene flow(Nm, above diagonal) of populations based on ND2 gene sequences

2.3 莖柔魚歷史種群動(dòng)態(tài)分析

在種群擴(kuò)張模型中對(duì)3個(gè)表型群以及平均的粗糙指數(shù)(Raggedness index) 進(jìn)行計(jì)算，發(fā)現(xiàn)P均大于0.05，無(wú)顯著性差異，表示這個(gè)數(shù)據(jù)適合于種群擴(kuò)張模型?；贜D2基因序列的Tajima'sD和Fu'sFs中性檢驗(yàn)結(jié)果見表5，所有表型群以及平均的Tajima'sD和Fu'sFs均為負(fù)數(shù)，但中表型群的Tajima'sD不存在顯著差異 (P>0.05)，所有表型群的Fu'sFs均表現(xiàn)出顯著差異 (P<0.05)。負(fù)的Tajima'sD和Fu'sFs以及兩者差異顯著的P表示種群經(jīng)歷過擴(kuò)張，從理論上說，F(xiàn)u'sFs方法檢驗(yàn)效果要比Tajima可靠，因此，可以認(rèn)為3個(gè)區(qū)域群體在歷史上經(jīng)歷了種群擴(kuò)張事件。同樣，基于ND2基因序列的核苷酸不配對(duì)分布結(jié)果顯示，3個(gè)表型群以及總體的核苷酸錯(cuò)配分布曲線均出現(xiàn)了明顯的單峰 (圖2)，說明莖柔魚群體在歷史上經(jīng)歷了種群擴(kuò)張事件，與中性檢驗(yàn)的結(jié)果相一致。

圖2 基于ND2基因的莖柔魚群體核苷酸不配對(duì)分布Fig.2 Mismatch distribution graphs of populations based on ND2 gene sequences

表5 中性檢驗(yàn)結(jié)果和Raggedness index的計(jì)算 (包含P)Table 5 Results of neutrality tests and Raggedness index including P-values

2.4 莖柔魚群體的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

利用MAGE 7.0軟件基于ND2基因序列以Kimura雙參數(shù)模型 (K-2-P) 構(gòu)建NJ樹 (圖3)。莖柔魚群體NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹中無(wú)明顯分支，且分支間遺傳距離較小，3個(gè)表型群個(gè)體較隨機(jī)地分布在進(jìn)化樹中，表明莖柔魚群體未出現(xiàn)遺傳分化。

圖3 基于ND2基因的莖柔魚NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Rooted neighbor-joining tree of populations based on ND2 gene haplotypes

通過ND2基因單倍型序列以Network繪制網(wǎng)絡(luò)圖 (Median-joining network, MJ網(wǎng)絡(luò)圖，圖4)。發(fā)現(xiàn)H1和H3是主要的核心單倍型，通過單一突變或多步突變相連，并都包含了來自3個(gè)表型群內(nèi)的單倍型。同時(shí)，3個(gè)表型群?jiǎn)伪缎烷g彼此相互關(guān)聯(lián)，不存在與3個(gè)表型群對(duì)應(yīng)的獨(dú)立單倍型，這也證明了3個(gè)區(qū)域群體間存在一定的基因交流。且網(wǎng)絡(luò)圖呈放射狀分布，這與之前的種群擴(kuò)張模式相一致，進(jìn)一步驗(yàn)證種群擴(kuò)張事件的發(fā)生。

圖4 莖柔魚ND2基因單倍型的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Median-joining network of ND2 gene haplotypes of D.gigas

3 討論

東南太平洋不同表型群的莖柔魚在地理分布上存在顯著的差異，大表型群主要分布在棲息范圍的南部，中表型群在整個(gè)棲息范圍內(nèi)均有分布，而小表型群主要分布在赤道海域[3]。同時(shí)由于莖柔魚漁業(yè)資源分布廣、資源量大，種群的遷徙變動(dòng)受到復(fù)雜的洋流體系影響，單一的形態(tài)學(xué)手段無(wú)法科學(xué)有效地識(shí)別不同區(qū)域、不同大小以及不同環(huán)境條件下的莖柔魚亞種群，而種群遺傳學(xué)的研究則可以通過一定的DNA標(biāo)記識(shí)別離散的亞種群，從而了解種群結(jié)構(gòu)、種內(nèi)變異性和基因流。在分子標(biāo)記的選取中，與能量物質(zhì)腺嘌呤核苷三磷酸 (ATP) 產(chǎn)生直接相關(guān)的線粒體NADH脫氫酶亞基在環(huán)境因子脅迫下的適應(yīng)性進(jìn)化中具有適中的進(jìn)化速率[20]，同時(shí)根據(jù)陳維[21]對(duì)同為頭足類的短蛸(Octopus ocellatus) 的多個(gè)NADH脫氫酶亞基的序列對(duì)比結(jié)果，ND2基因具有較高的核苷酸多態(tài)性。

基于線粒體DNA序列的遺傳分析可以得到莖柔魚群體基本的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)信息。在本研究中，基于ND2基因序列測(cè)得的A+T含量 (55.52%) 顯著高于C+G含量 (44.48%)，4種核苷酸組成呈現(xiàn)不均一分布，這與其他大洋性頭足類，如阿根廷滑柔魚 (Illex argentinus) 的細(xì)胞色素氧化酶I (COI) 和細(xì)胞色素b(Cyt b) 基因[22]、柔魚(Ommastrephes bartramii) 的COI和Cyt b基因[23]等的核苷酸組成特征一致。由遺傳多樣性分析的結(jié)果可知，基于ND2基因序列測(cè)得的Hd較高，而Pi較低，根據(jù)莖柔魚種群動(dòng)態(tài)分析的結(jié)果推斷這可能是因?yàn)闁|南太平洋莖柔魚群體在歷史上存在迅速擴(kuò)張的時(shí)期，單倍型多樣性隨著莖柔魚數(shù)量的快速增加而增加，但核苷酸產(chǎn)生的變異沒有足夠的積累時(shí)間[24]，這種高Hd低Pi的特征常見于具有一定游泳能力的海洋生物[25-27]。

在莖柔魚的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究中，基于ND2基因的莖柔魚個(gè)體NJ進(jìn)化樹和MJ單倍型網(wǎng)絡(luò)圖的結(jié)果呈現(xiàn)一致性，較小分支中的個(gè)體 (M42、M15、M31、M12、S24、L7) 分屬單倍型H17、H23、H15和H5，來自不同表型的莖柔魚樣本在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中相互交織，未出現(xiàn)獨(dú)立的進(jìn)化分支。同時(shí)，在MJ單倍型網(wǎng)絡(luò)圖中，以核心單倍型H3和H1為中心，其他單倍型呈放射狀分布，呈現(xiàn)較為典型的星狀圖譜，這與劉連為等[10]基于COI基因的秘魯外海莖柔魚的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析結(jié)果相吻合 (亦呈現(xiàn)有2個(gè)核心單倍型構(gòu)成的星狀圖譜)。

莖柔魚是高度洄游的大洋性頭足類，游泳能力強(qiáng)，受到東南太平洋復(fù)雜的洋流系統(tǒng)影響，在東南太平洋有著廣闊的洄游范圍和復(fù)雜的洄游路徑[28]。同時(shí)，由于洋流周期性循環(huán)，使得東南太平洋的莖柔魚在秘魯沿岸形成了較為集中的產(chǎn)卵場(chǎng)[29]，有助于不同表型群的莖柔魚間頻繁的基因交流 (Nm>1)，最終使得莖柔魚不同表型群在遺傳上未出現(xiàn)分化 (Fst<0.05,P>0.05)。與現(xiàn)有的研究結(jié)果對(duì)比，劉連為等[10]利用線粒體DNA與微衛(wèi)星2個(gè)分子標(biāo)記對(duì)秘魯外海莖柔魚大型群與小型群的遺傳變異進(jìn)行研究，認(rèn)為2個(gè)群體不存在顯著的遺傳分化；Sanchez等[9]基于ND2序列和微衛(wèi)星標(biāo)記的秘魯寒流系統(tǒng)中莖柔魚大小兩群體間遺傳分析也得出了相同的結(jié)論。生物體表型特征一般由自身的遺傳信息決定，并轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但也存在同種基因型對(duì)不同環(huán)境因素產(chǎn)生響應(yīng)，Tafur等[30]研究表明，實(shí)際上可能不存在這3類性成熟長(zhǎng)度，這可能是對(duì)環(huán)境變化和食物供應(yīng)的一種響應(yīng)，而Arkhipkin等[31]則認(rèn)為莖柔魚早期生活史(3—6月) 所經(jīng)歷的水溫條件最終決定了其年齡和胴長(zhǎng)，結(jié)合本研究結(jié)果，遺傳變異導(dǎo)致的莖柔魚表型性狀差異可能性較小?？紤]到生物體可能通過對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生不同的表型特征即表型可塑性，因此，不同表型群的莖柔魚在性成熟胴長(zhǎng)大小上存在的差異可能與不同的洄游路徑和所處的棲息地條件有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究利用線粒體ND2基因序列對(duì)東南太平洋不同表型的莖柔魚群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以期為莖柔魚漁業(yè)資源的評(píng)估和管理提供重要依據(jù)。研究表明不同海域大、中、小3種表型的莖柔魚群體間不存在顯著的遺傳分化，建議將東南太平洋的莖柔魚群體劃為一個(gè)種群進(jìn)行評(píng)估管理。同時(shí)，考慮到莖柔魚不同表型產(chǎn)生的原因，綜合考慮其生活史及其對(duì)應(yīng)的棲息條件將有助于更加合理地保護(hù)與開發(fā)利用莖柔魚資源。然而，線粒體標(biāo)記本身相對(duì)于全基因組序列而言包含的遺傳信息較少，且多態(tài)性水平較低，對(duì)準(zhǔn)確反映莖柔魚整體的遺傳信息具有一定的局限性。其次，受到采樣條件的限制，大表型群體的樣本數(shù)量較少，因此，東南太平洋不同表型莖柔魚群體間的遺傳關(guān)系仍存在不確定性，需要在提高樣本數(shù)量的同時(shí)，利用單核苷酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphism, SNP) 標(biāo)記等基因組覆蓋面更廣的分子標(biāo)記對(duì)其群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比研究。