黃 皓，范嗣剛，王鵬飛，陳 佳，趙 超，閆路路，邱麗華，潘 瀅

1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306

2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所/廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300

3.寧德市富發(fā)水產(chǎn)有限公司/大黃魚育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 寧德 352103

花鱸 (Lateolabrax maculatus) 俗稱海鱸，隸屬于鱸形目、鮨科、花鱸屬，為東北亞特有種，廣泛分布于中國、韓國及日本沿海，屬廣溫、廣鹽性海水魚類[1]。花鱸體長，側(cè)扁，背腹面皆鈍圓，體側(cè)上部及背鰭有黑色斑點(diǎn)[2]。一般養(yǎng)殖在位于河口的咸淡水池塘、網(wǎng)箱和工廠化水泥池等地，隨著繁育與養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，花鱸在山東、浙江、福建和廣東等沿海地區(qū)已形成了規(guī)?；B(yǎng)殖。近年來中國的花鱸產(chǎn)量逐年提高，2019年達(dá)到18萬噸，出口約3萬噸[3-4]。珠江口是花鱸養(yǎng)殖的主產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量占全國的一半以上。珠海斗門擁有花鱸的國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品“白蕉海鱸”[2]。綜上，花鱸現(xiàn)在已成為中國重要的海水養(yǎng)殖魚類，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

“國以農(nóng)為本，糧以種為先”，優(yōu)良品種對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)力提升至關(guān)重要[5]。目前中國花鱸產(chǎn)業(yè)基本形成了“南北接力”的繁育和養(yǎng)殖模式，即北方培育和提供親魚，在福建和浙江人工繁育，苗種在廣東、福建等地養(yǎng)成。這導(dǎo)致了花鱸種質(zhì)資源的混亂[4,6]。另外，經(jīng)過多年的人工繁殖和養(yǎng)殖，中國花鱸近親繁殖加劇，種質(zhì)退化，缺乏良種，急需開展遺傳選育[6-7]。遺傳多樣性評(píng)估是遺傳選育的重要一環(huán)[8]。因此，開展花鱸群體的遺傳多樣性研究，對(duì)其遺傳育種極為重要。

微衛(wèi)星 (Microstatelites) 又名簡單重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)，是基因組內(nèi)以2～6 bp為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列。側(cè)翼序列位于串聯(lián)重復(fù)序列兩側(cè)，具有保守性，可在此設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)微衛(wèi)星的多態(tài)性。微衛(wèi)星具有數(shù)量多，共顯性、多態(tài)性豐富，易于檢測(cè)等特點(diǎn)[9]，隨著二代和三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和成熟，從轉(zhuǎn)錄組或基因組中能分離得到大批量的SSR位點(diǎn)[10-12]。微衛(wèi)星已被廣泛用于動(dòng)植物的群體遺傳多樣性分析[13-14]、親子鑒定[15-16]和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[17-18]等方面。如Guerrero-Cózar等[17]用229個(gè)微衛(wèi)星引物構(gòu)建了塞內(nèi)加爾鰨 (Solea senegalensis) 的遺傳連鎖圖譜。微衛(wèi)星在水產(chǎn)動(dòng)物遺傳多樣性研究中也有很多報(bào)道。李景芬等[19]用16對(duì)微衛(wèi)星引物分析了5個(gè)羅氏沼蝦 (Macrobrachium rosenbergii) 群體的遺傳多樣性；胡玉婷等[20]用10對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)9個(gè)黃顙魚 (Pelteobagrus fulvidraco) 群體進(jìn)行了遺傳分析；沙航等[21]用12對(duì)微衛(wèi)星引物分析了3個(gè)鳙 (Aristichthys nobilis) 群體的遺傳多樣性；Shen等[14]用21對(duì)微衛(wèi)星評(píng)估了中華鱘 (Acipenser sinensis) 野生群體的遺傳多樣性。目前有關(guān)花鱸微衛(wèi)星分離和群體遺傳多樣性的研究尚少。Shao等[22]分離了8個(gè)花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記；Zhang等[23]分離了26個(gè)花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記；An等[24]用12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究了韓國野生花鱸群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性；江鑫[25]和王桂興等[26]用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)中國的花鱸群體的遺傳多樣性進(jìn)行了研究，其中研究的花鱸群體主要集中在北方海域。本研究利用11個(gè)花鱸微衛(wèi)星分子標(biāo)記，對(duì)中國渤海、黃海、東海和南海的6個(gè)沿海地區(qū) (天津、長島、青島、上海、廈門和北海)的花鱸野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期為花鱸的良種選育和種質(zhì)資源的保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從中國沿海6個(gè)地區(qū)共捕獲237尾野生花鱸個(gè)體 (表1)，分別剪取每尾花鱸的鰭條，放入無水乙醇中固定，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后放置于–20 ℃保存。

表1 6個(gè)花鱸群體樣本采集信息Table 1 Sampling information of six L.maculatus populations

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組 DNA 提取

用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒 (天根，中國) 提取各樣品的DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 (Thermo Scientific，美國) 檢測(cè)DNA的完整性和濃度，DNA濃度調(diào)至50 ng·μL–1，–20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

用11對(duì)自行開發(fā)的具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物來分析6個(gè)花鱸群體的遺傳多樣性 (表2)。PCR反應(yīng)體系如下：ExTaq酶 (TaKaRa，日本) 0.2 μL，10×Ex TaqBuffer (含 Mg2+) 2 μL，dNTP Mix 1.6 μL，上、下游引物各0.8 μL，DNA模板0.6 μL，去離子水 14 μL，共 20 μL。PCR 程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，52～56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

表2 花鱸11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物信息Table 2 Primer information of 11 microsatellite loci of L.maculatus

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染

用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。銀染后，凝膠由Epson Scanner v33掃描儀(Epson，德國) 掃描成像。等位基因大小以20 bp DNA Ladder Marker (TaKaRa，日本) 和 pBR322 DNA Mspl (天根，中國) 為參照進(jìn)行判讀，根據(jù)等位基因由大到小記為A、B、C…。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用GenAlex V 6.5軟件[27]分析等位基因數(shù)(Number of allele,Na)、有效等位基因數(shù) (Effective number of allele,Ne)、觀測(cè)雜合度 (Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度 (Expected heterozygosity,He)、群體間Nei's遺傳距離和遺傳相似度、群體間的遺傳分化指數(shù) (Genetic differentiation index,FST)、基因流 (Gene flow,Nm) 和分子方差分析(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)。用Cervus V 3.2軟件[28]計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量 (Polymorphism information content, PIC)，并進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡 (Hardy-Weinberg equilibrium, HWE) 檢驗(yàn)。用MEGA X軟件[29]繪制基于群體間的Nei's遺傳距離的UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetic mean, UPGMA) 聚類樹。用Structure V 2.3軟件[30-31]進(jìn)行聚類分析，用Structure Harverter軟件[31]確定最適K值，利用CLUMPP軟件[30]對(duì)K值矩陣進(jìn)行合并，用Distruct軟件[30]繪制貝葉斯基因型聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析

11個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)在6個(gè)花鱸群體中共檢測(cè)到57個(gè)等位基因，Na為2～9，平均為5.18；Ne為1.315 3～4.192 2，平均為2.708 2；等位基因最多的位點(diǎn)為Lm16-189 (9個(gè))，等位基因最少的位點(diǎn)為Lm3-130 (2個(gè))。11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)Ho和He分別介于0.083 0～0.683 5和0.239 7～0.761 5，其中位點(diǎn)Lm3-111Ho最高 (0.683 5)，位點(diǎn)Lm16-189He最高(0.7615)。11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn) PIC 介于 0.211 0～0.745 0，平均值為0.537 5，其中高度多態(tài)性位點(diǎn) (PIC≥0.50) 有7個(gè)，分別為Fssr3、Lm3-91、Lm3-100、Lm3-110、Lm3-111、Lm16-189和 Lm16-203。中度多態(tài)性位點(diǎn) (0.25≤PIC<0.50) 有3個(gè)，分別為Lm3-90、Lm3-129和Lm16-175，低多態(tài)性位點(diǎn)(PIC<0.25) 有1個(gè)，為Lm3-130。11個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中除3個(gè)位點(diǎn) (Fssr3、Lm3-129和Lm3-130)外，其余均偏離哈迪溫伯格平衡 (P<0.05，表3)。

表3 11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of 11 microsatellite loci

2.2 花鱸群體的遺傳多樣性分析

6個(gè)花鱸群體的Na介于3.909 1～4.636 4，Ne介于2.293 4～2.773 5，Ho介于0.391 3～0.456 8，最大的為上海群體，最小的為長島群體；He介于0.505 1～0.566 2，PIC 介于 0.388 8～0.518 9 (表4)。其中上海群體的Na、Ne、Ho、He和PIC均最大。青島群體、上海群體和北海群體的PIC>0.5，為高度多態(tài)性群體，其余群體的PIC介于0.25～0.50，遺傳多態(tài)性為中度。

表4 花鱸6個(gè)群體的遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of six L.maculatus populations

2.3 群體遺傳分化與親緣關(guān)系分析

6個(gè)花鱸群體間FST介于0.022 6～0.055 2，其中天津群體與北海群體間遺傳分化系數(shù)最大 (FST=0.055 2)，其余群體間FST<0.05 (表5)。6個(gè)花鱸群體間Nm介于4.276 6～11.220 8，其中，北海群體和天津群體的基因流最低，上海群體和長島群體的基因流最高 (表5)。AMOVA結(jié)果顯示，6個(gè)群體的遺傳變異有91%來自群體內(nèi)，9%來自群體間 (表6)。

表5 花鱸6個(gè)群體間遺傳分化指數(shù) (對(duì)角線以下) 與基因流 (對(duì)角線以上)Table 5 Genetic differentiation index (below diagonal) and gene flow (above diagonal) of six L.maculatus populations

表6 花鱸6個(gè)群體的分子方差分析Table 6 Analysis of molecular variance of six L.maculatus populations

對(duì)6個(gè)花鱸群體進(jìn)行基于個(gè)體歸類的聚類分析，運(yùn)用Structure Harverter計(jì)算合適的K值 (理論群體數(shù))，K=2時(shí)得到最大的ΔK，表明本研究6個(gè)花鱸群體中的個(gè)體分布在2個(gè)基因型類群中(圖1)。未見任何一個(gè)群體獨(dú)立分配于一個(gè)類群中，無顯著分化的地理群體。

6個(gè)花鱸群體間Nei's遺傳距離和遺傳相似度分別介于0.037 8～0.144 3和0.865 6～0.929 5，其中天津群體與北海群體遺傳距離最大 (0.144 3)，遺傳相似度最小 (0.865 6)；天津群體與青島群體遺傳距離最小 (0.038 7)，遺傳相似度最大 (0.929 5，表7)。UPMGA聚類樹結(jié)果顯示，6個(gè)群體首先分為兩支，位于最南部的北海群體獨(dú)立為一支；另一支中天津群體與青島群體匯聚，上海群體與長島群體匯聚后再與廈門群體匯聚 (圖2)。

圖1 花鱸6個(gè)群體貝葉斯基因型聚類分析 (K=2)Fig.1 Bayesian genotypes clustering analysis for six L.maculatus populations (K=2)

表7 花鱸6個(gè)群體間的遺傳距離 (對(duì)角線以下) 與遺傳相似度 (對(duì)角線以上)Table 7 Genetic identity (below diagonal) and genetic distance (above diagonal) of six L.maculatus populations

圖2 基于Nei's遺傳距離構(gòu)建的6個(gè)花鱸群體的UPMGA聚類樹Fig.2 UPGMA clustering tree based on Nei's genetic distance for six L.maculatus populations

3 討論

3.1 微衛(wèi)星引物多樣性

本研究使用的11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均來自于花鱸基因組序列 (GenBank登錄號(hào)：PRJNA408177)。趙燕等[32]也從GenBank 數(shù)據(jù)庫搜索，結(jié)合 FIASCO法開發(fā)了15個(gè)花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記。Zhang等[23]和翟云等[33]利用高通量測(cè)序法對(duì)花鱸基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，獲得微衛(wèi)星標(biāo)記。由于微衛(wèi)星標(biāo)記和研究群體不同，微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)也不一樣。本研究中，11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在6個(gè)花鱸群體中的遺傳多樣性 (平均Na為5.18，平均He為0.570 0，平均PIC為0.537 5) 與趙燕等[32]和Zhang等[23]的研究結(jié)果相似。如Zhang等[23]開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記的He為0.175～0.938，趙燕等[32]的為0.507 9～0.889 0，本研究為0.239 7～0.761 5。翟云等[33]開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記均為二堿基重復(fù)，其平均Na、雜合度和PIC均顯著高于本研究和其他研究。這與微衛(wèi)星二堿基重復(fù)的多態(tài)性高于其他數(shù)目重復(fù)的多態(tài)性有關(guān)[34]。本研究存在偏離HWE的微衛(wèi)星位點(diǎn)。偏離HWE的原因有很多，比如雜合子缺少、無效等位基因擴(kuò)增、檢測(cè)個(gè)體不具有代表性等。這在其他花鱸微衛(wèi)星的開發(fā)研究中也經(jīng)常見到，如Shao等[22]開發(fā)的10個(gè)花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記中有4個(gè)由于空等位基因存在而出現(xiàn)偏離；An等[24]也發(fā)現(xiàn)，韓國養(yǎng)殖的花鱸群體由于選育致使部分位點(diǎn)發(fā)生偏離。本研究所采用的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，7個(gè)為高度多態(tài)性位點(diǎn)，3個(gè)為中度多態(tài)性位點(diǎn)，占比90.91%。因此這些位點(diǎn)可用于群體遺傳多樣性研究。

3.2 群體遺傳多樣性

研究群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)有雜合度和PIC。兩者值越大，群體的遺傳變異就越大，遺傳多樣性就越高，群體的穩(wěn)定性也就越大。本研究中，6個(gè)花鱸群體的He介于0.505 1～0.566 2。王桂興等[26]于2015年收集了中國6個(gè)花鱸野生群體，發(fā)現(xiàn)6個(gè)群體的平均He為0.708～0.762；An等[24]于2013年收集了韓國1個(gè)花鱸野生群體，He為0.761，均高于本研究。6個(gè)花鱸群體的PIC為0.388 8～0.518 9，Botstein等[35]研究指出，PIC≥5為高度多態(tài)性，0.25≤PIC<0.5為中度多態(tài)性，其中有3個(gè)群體為高度多態(tài)性群體，3個(gè)為中度多態(tài)性。王桂興等[26]研究顯示6個(gè)花鱸野生群體均為高度多態(tài)性群體。表明近幾年花鱸野生群體的遺傳多樣性有所降低，原因可能如下：1) 隨著花鱸人工養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年提高，野生個(gè)體可能會(huì)被大量捕撈，用于做繁育；韓國的花鱸野生群體數(shù)量在近20年內(nèi)也是逐漸下降[24]。2) 本研究用到的野生花鱸，可能有一部分樣本為逃逸或增殖放流到野生環(huán)境的養(yǎng)殖個(gè)體。

Na和Ne越接近，等位基因在群體中分布的越均勻，而本研究中每個(gè)群體的Na均大于Ne，表明6個(gè)花鱸群體均存在等位基因分布不均勻的情況，這種不均勻程度依次為長島>北海>廈門>上海>青島>天津。該結(jié)果在羅氏沼蝦[19]和青魚 (Mylopharyngodon piceus)[36]等物種的研究中也觀察到。

3.3 群體遺傳分化和群體遺傳結(jié)構(gòu)

FST可用來反映各群體間的遺傳分化程度。6個(gè)群體間的FST介于0.022 6～0.055 2。天津與北海群體間遺傳分化最大，與青島群體間的遺傳分化最小。根據(jù)Francois和Nicolas[37]的研究，當(dāng)0

基因流與遺傳分化系數(shù)呈負(fù)相關(guān)，即基因流越大，群體間相似性越大，遺傳分化越小。6個(gè)花鱸群體間的Nm介于4.276 6～11.220 8，當(dāng)Nm>1時(shí)，表明群體間存在較高水平的基因交流，Nm>4，則充分反映了種群間的基因交流水平，群體間遺傳分化更小[38]。本研究表明6個(gè)花鱸群體之間的基因交流頻繁。AMOVA分析結(jié)果顯示，6個(gè)花鱸群體的遺傳變異主要來自群體內(nèi) (91%)，群體間的變異極少 (9%)，這與王桂興等[26]研究結(jié)果相似 (群體間8.04%，群體內(nèi)91.96%)。本研究中，6個(gè)群體的花鱸個(gè)體均被劃分到2個(gè)基因型類群中，無獨(dú)立的基因型類群。王桂興等[26]的研究也證實(shí)中國6個(gè)花鱸群體無獨(dú)立的基因型類群，但有3個(gè)基因型類群。UPMGA聚類樹結(jié)果與各群體間的基因流和遺傳距離結(jié)果一致。天津群體和青島群體基因交流多，遺傳距離近，聚為一支；同理上海群體與長島群體聚為一支；北海群體單獨(dú)為一支。

綜上，除天津群體和北海群體有地理種群遺傳分化外，中國其他海域的花鱸群體之間已經(jīng)融合。這可能與中國花鱸“南北接力”的養(yǎng)殖模式有關(guān)。花鱸從北到南，經(jīng)歷了人工繁育、運(yùn)輸和養(yǎng)殖[4]。在此過程中，會(huì)有一些花鱸苗和成魚逃逸到自然海區(qū)?；|行動(dòng)敏捷、活動(dòng)范圍廣，適應(yīng)能力強(qiáng)，能在我國沿海遷移。已有研究表明擴(kuò)散程度高的水生物種可以促進(jìn)基因流和遺傳混合，這在歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)[39]、鱟 (Tachypleus tridentatus)[40]、羅氏沼蝦[19]和鱖 (Siniperca chuatsi)[41]等水生動(dòng)物中得到證實(shí)。由于遷移能力有限，地理距離和自然屏障導(dǎo)致大鱗副泥鰍 (Paramisgurnus dabryanus)[42]不同地理群體基因流受阻，遺傳分化程度高。