馬瑩，張哲，曲章義，韓旭

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科腔鏡科，哈爾濱 150001； 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生微生物學(xué)教研室，哈爾濱 150001)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是一種常見(jiàn)婦科腫瘤，在多數(shù)歐美發(fā)達(dá)國(guó)家EC患者占婦科腫瘤總數(shù)的50%[1]。我國(guó)每年新診斷EC患者高達(dá)20萬(wàn)，因EC死亡患者數(shù)量亦逐年升高[2-3]。近年來(lái)的研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白通路是一種與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及不良預(yù)后相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前在非小細(xì)胞肺癌[4]、卵巢癌[5]、骨肉瘤[6]等中研究較多，主要通過(guò)影響細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移以及促血管生成發(fā)揮相應(yīng)作用[7]。PI3K在哺乳動(dòng)物中可分為PI3KⅠ型、PI3KⅡ型、PI3KⅢ型3個(gè)亞型，其中PI3KⅠ型與腫瘤的關(guān)系最為密切，而PI3KCA主要編碼PI3KⅠ型中參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵催化亞基p110α[8]。本研究旨在通過(guò)研究PI3KCA在EC組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系，為判斷EC患者病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后提供幫助，并為EC的分子治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年9月至2019年9月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科住院治療的83例EC患者作為EC組，選取同期83例子宮肌瘤患者作為子宮肌瘤組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①EC組經(jīng)病理學(xué)檢查確診[9]；②手術(shù)前未經(jīng)過(guò)放化療、免疫治療及內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①轉(zhuǎn)移性EC；②合并其他惡性腫瘤；③長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素。EC組年齡37～70歲，平均(57±6)歲；淋巴轉(zhuǎn)移情況：陽(yáng)性33例、陰性50例；病理分級(jí)：低分化27例、中分化29例、高分化27例；肌層浸潤(rùn)深度：≥1/2 70例，<1/2 13例；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)分期：Ⅰ期23例、Ⅱ期25例、Ⅲ期22例、Ⅳ期13例。子宮肌瘤組年齡40～69歲，平均(56±6)歲。兩組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署了知情同意書。

1.2方法

1.2.1反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè) ①采用TRIzol法(Invitrogen?)提取標(biāo)本的總RNA，采用Invitrogen?Qubit 4熒光計(jì)檢測(cè)提取總RNA的濃度及純度，檢測(cè)合格后繼續(xù)下游實(shí)驗(yàn)。②按照BcaBEST?RNA PCR Kit Ver.1.1說(shuō)明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA，反應(yīng)條件：65 ℃ 1 min，30 ℃ 5 min，65 ℃ 30 min，98 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min。③按照Bimake?2x SYBR Green反轉(zhuǎn)錄PCR master mix說(shuō)明，以互補(bǔ)DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。甘油醛-3-磷酸脫氫酶及其引物均包含在試劑盒內(nèi)。PI3KCA基因特異性引物由吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成，上游引物：5′-CTCTGAGGAGGTGGGTAG-3′，下游引物：3′-CGGTGGTCAGTTGAGTAA-5′。反應(yīng)體系共25 μl：互補(bǔ)DNA模板4 μl，上下游引物各 1.25 μl，2x SYBR Green反轉(zhuǎn)錄PCR master mix 12.5 μl，雙蒸水6 μl。使用美國(guó)Thermofisher ABI QuantStudio 1熒光定量PCR儀，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，以上40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min總延伸。④每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，記錄Ct值，并取平均值，平均Ct值≤20為PI3KCA基因高表達(dá)，平均Ct值>20為PI3KCA基因低表達(dá)。另采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析，根據(jù)Ct平均值以2-ΔΔCt表示PI3KCA基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2免疫組織化學(xué)檢測(cè) ①將石蠟包埋的標(biāo)本切片，厚度4 μm，每個(gè)標(biāo)本切5片。1片空白對(duì)照，1片蘇木精-伊紅染色，3片行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。②免疫組織化學(xué)按照SP法試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SP0021)說(shuō)明進(jìn)行操作，石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度乙醇水化、3%過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶后，再用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)。利用山羊血清對(duì)石蠟切片封閉，然后滴加兔源PI3KCA相關(guān)蛋白(p110α)抗體(美國(guó)Affinity Biosciences公司生產(chǎn)，1∶5 000稀釋)，過(guò)夜孵育后滴加Bio-羊抗兔IgG(1∶100稀釋)及鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶(1∶100稀釋)，二氨基聯(lián)苯胺顯色。③用Mayer′蘇木精染色劑復(fù)染，脫水，封片。④用顯微鏡觀察染色物質(zhì)及其出現(xiàn)的位置及染色深度。無(wú)染色顆粒為PI3KCA相關(guān)蛋白不表達(dá)，淺黃色顆粒為PI3KCA相關(guān)蛋白低表達(dá)，棕黃色顆粒為PI3KCA相關(guān)蛋白中表達(dá)，褐色顆粒為PI3KCA相關(guān)蛋白高表達(dá)[10]。

2 結(jié) 果

2.1兩組子宮內(nèi)膜組織PI3KCA基因表達(dá)量比較 EC組子宮內(nèi)膜組織PI3KCA基因表達(dá)量明顯高于子宮肌瘤組[(1.24±0.24)比(0.26±0.11)](t=33.417，P<0.001)。

2.2EC組織中PI3KCA基因表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 EC組織標(biāo)本中，PI3KCA基因高表達(dá)率為51.8%(43/83)，PI3KCA基因低表達(dá)率為48.2%(40/83)。不同淋巴轉(zhuǎn)移情況、肌層浸潤(rùn)深度及FIGO分期的PI3KCA基因高表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同病理分級(jí)的PI3KCA基因高表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 EC組織中PI3KCA基因表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

2.3兩組PI3KCA相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率比較 PI3KCA相關(guān)蛋白在EC細(xì)胞中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，見(jiàn)圖1。EC組PI3KCA相關(guān)蛋白表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于子宮肌瘤組[100.0%(83/83)比33.7%(28/83)](χ2=82.250，P<0.001)。

注：EC為子宮內(nèi)膜癌圖1 子宮內(nèi)膜中PI3KCA相關(guān)蛋白(p110α)的表達(dá) (Mayer′蘇木精染色)

2.4EC組織中PI3KCA相關(guān)蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征關(guān)系 在EC患者子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中，PI3KCA相關(guān)蛋白高表達(dá)率為32.5%(27/83)、中表達(dá)率為25.3%(21/83)、低表達(dá)率為42.2%(35/83)。不同淋巴轉(zhuǎn)移情況、肌層浸潤(rùn)深度及FIGO 分期的PI3KCA相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，不同病理分級(jí)的PI3KCA相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 EC組織中PI3KCA相關(guān)蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

3 討 論

絕經(jīng)后女性是EC的主要發(fā)病人群，但近年20～44歲EC患者的比例逐漸升高，約7%[11]。EC發(fā)病率的升高及患病群體的年輕化迫切要求對(duì)EC病情進(jìn)行精準(zhǔn)判斷，制訂個(gè)體化的治療方案[12]。因此，本研究從PI3K/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中編碼PI3K的PI3KCA基因入手，觀察PI3KCA在不同病情嚴(yán)重程度EC患者中表達(dá)量的差異，以期準(zhǔn)確判斷患者病情，從而延長(zhǎng)患者生存期，改善預(yù)后。

PI3K/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增生、細(xì)胞周期、細(xì)胞程序性死亡等方面發(fā)揮作用，其在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)[13]。PI3KCA基因作為PI3K/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上游位點(diǎn)的重要調(diào)控基因之一，能夠促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生惡性行為，PI3KCA基因主要通過(guò)其編碼表達(dá)的催化亞基p110α蛋白發(fā)揮作用，p110α蛋白具有類脂激酶及蛋白激酶雙活性[14-15]，PI3KCA基因突變導(dǎo)致p110α蛋白過(guò)表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致下游激酶活性增加，PI3K/蛋白激酶B通路持續(xù)激活，最終產(chǎn)生癌變[16]。Denninghoff等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PI3KCA是較常見(jiàn)的可發(fā)生突變的癌基因，因此目前對(duì)EC發(fā)生發(fā)展中PI3KCA基因重要作用的研究具有理論意義。

本研究結(jié)果顯示，EC病情嚴(yán)重程度與PI3KCA表達(dá)量高度相關(guān)，在RNA以及蛋白質(zhì)層面，PI3KCA基因及其編碼表達(dá)的p110α蛋白的表達(dá)量隨EC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移范圍擴(kuò)大、肌層浸潤(rùn)深度增加、FIGO分期及病理分級(jí)升高而升高，表明PI3KCA基因在EC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前，對(duì)PI3KCA基因在人類惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的研究逐漸增多，以膽管癌、肺癌及乳腺癌等為主[18]，對(duì)EC的相關(guān)研究有限。本研究中，未發(fā)現(xiàn)PI3KCA基因表達(dá)量與EC臨床病理分級(jí)之間的明顯相關(guān)性，但并不說(shuō)明兩者完全沒(méi)有關(guān)聯(lián)，其原因可能與本研究納入樣本量有限、病理類型主要為子宮內(nèi)膜樣腺癌有關(guān)，尚不能排除不同病理類型導(dǎo)致研究結(jié)果的差異，需要進(jìn)一步探索。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)于腫瘤研究的重點(diǎn)逐漸傾向于分子靶向治療，準(zhǔn)確找到有效的分子靶點(diǎn)，針對(duì)靶點(diǎn)精準(zhǔn)用藥可提高治療效果。本研究結(jié)果顯示，PI3KCA表達(dá)量與EC患者病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，因此針對(duì)該基因位點(diǎn)進(jìn)行靶向治療，可能在很大程度上改善患者的預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可能通過(guò)抑制PI3K通路誘導(dǎo)EC細(xì)胞發(fā)生自噬[19]，而PI3KCA是PI3K通路重要的上游基因。同時(shí)，PI3KCA可通過(guò)磷酸化BAD蛋白及胱天蛋白酶9阻止細(xì)胞凋亡[20]，抑制糖原合成酶激酶-3β的活性，從而阻止G1/S-特異性周期蛋白D1的降解，促進(jìn)腫瘤G1/S細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)化[21]，上述研究結(jié)果在細(xì)胞自噬、凋亡以及細(xì)胞周期調(diào)控方面均為EC患者的治療提供了新的分子生物學(xué)思路。曹海敬等[22]證明，PI3KCA基因突變可使下游通路活化，進(jìn)而抑制細(xì)胞程序性死亡，使細(xì)胞無(wú)限繁殖產(chǎn)生癌變，因此針對(duì)PI3KCA基因的抑制劑研究具有重要臨床意義。目前，許多P13KCA基因抑制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[23]，但標(biāo)準(zhǔn)化的用藥方案及治療效果尚不確切，且人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因突變患者的PI3KCA基因突變率較高[24]，因此PI3KCA抑制劑與多種藥物聯(lián)合治療腫瘤可能成為未來(lái)的研究方向。目前，中國(guó)科學(xué)院開發(fā)的PI3Kα抑制劑已獲得美國(guó)食品藥品管理局的臨床試驗(yàn)許可，計(jì)劃用于實(shí)體腫瘤的晚期治療[25]，這為EC的治療提供了可行性。本研究利用相應(yīng)的試驗(yàn)室技術(shù)分別在蛋白質(zhì)和RNA層面證明了PI3KCA參與EC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，驗(yàn)證了PI3KCA與EC臨床病理特征的關(guān)系，說(shuō)明PI3KCA是一種具有潛在治療價(jià)值的靶向位點(diǎn)，但尚有許多問(wèn)題需進(jìn)一步探索。

綜上所述，EC組織PI3KCA表達(dá)量高于正常子宮內(nèi)膜組織，且PI3KCA表達(dá)與EC的臨床病理學(xué)特征有一定的相關(guān)性。