邱曉媛 郭廣振 吳鵬鑫 尹福泉

(廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，湛江 524088)

防御素(defensins)廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中，屬于抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)的一種。防御素由于具有抑制微生物活性、抗菌譜廣、無(wú)免疫原性及穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，受到了國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注。2019年，《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194號(hào)》公布退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種[1]，這表明尋找能代替抗生素的安全替代物成為保證畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，防御素具有代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素的潛力，在抗微生物活性、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化等方面都能發(fā)揮一定的作用。因此，本文綜述了防御素的抗病原微生物活性、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化這3種生物學(xué)功能以及防御素在畜牧業(yè)的應(yīng)用研究進(jìn)展等，以期為防御素研究及其在實(shí)際畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 防御素分類和結(jié)構(gòu)

防御素是一類小分子AMPs，富含半胱氨酸(cysteine,Cys)，最初是在1980年被分離得到。在有脊柱動(dòng)物中，包括哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行動(dòng)物、魚類和兩棲動(dòng)物，都發(fā)現(xiàn)了防御素的存在。研究表明，防御素存在于皮膚、呼吸道、生殖道和胃腸道的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或上皮細(xì)胞中，由中心粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等吞噬細(xì)胞產(chǎn)生；其由18～45個(gè)氨基酸殘基和3個(gè)穩(wěn)定的二硫鍵組成，缺乏糖基或?；鶄?cè)鏈修飾，帶正電荷，具有親水性和親脂性，主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)是β-發(fā)夾轉(zhuǎn)角，有的還形成α-螺旋結(jié)構(gòu)[2-6]。

目前，至少有335種防御素被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)二硫鍵排列位置的不同，可以將其分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3個(gè)亞類。α-防御素是由哺乳動(dòng)物產(chǎn)生的，至少由1個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)組成，在Cys1-Cys6、Cys2-Cys4和Cys3-Cys5之間形成3個(gè)二硫鍵[7]。1991年，研究人員從牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了牛氣管黏膜抗菌肽，這是最早被發(fā)現(xiàn)的一種β-防御素，接著又在牛的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了其他β-防御素[8]，而后經(jīng)過(guò)許多研究人員研究發(fā)現(xiàn)，β-防御素存在于許多脊椎動(dòng)物體內(nèi)[9-11]。β-防御素至少由1個(gè)β-折疊結(jié)構(gòu)組成，這一點(diǎn)與α-防御素相同；此外，β-防御素在N端形成了α-螺旋結(jié)構(gòu)，在Cys1-Cys5、Cys2-Cys4和Cys3-Cys6之間形成二硫鍵[12-13]。θ-防御素存在于靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，但不包括人類，最早是在獼猴白細(xì)胞中被分離出來(lái)；與α-防御素和β-防御素的結(jié)構(gòu)不同，它由2個(gè)被截?cái)嗟摩?防御素環(huán)化而成，是獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有9個(gè)氨基酸片段，在Cys1-Cys6、Cys2-Cys5和Cys3-Cys4之間形成二硫鍵[14]。研究表明，α-防御素的祖先是β-防御素，而θ-防御素又是由α-防御素變化得到，3個(gè)亞類之間的進(jìn)化關(guān)系解釋了β-防御素基因分布之廣泛[15]。

2 防御素的生物學(xué)功能和作用機(jī)理

2.1 抗病原微生物活性

AMPs作為機(jī)體的多功能肽，在抗病原微生物活性和免疫調(diào)控等方面都起到重要作用，哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的AMPs可分為防御素和cathelicidins。因此，防御素能在病原微生物入侵機(jī)體時(shí)起作用。其抗病原微生物活性主要包括抗菌活性和抗病毒活性等。在面對(duì)不同的病原微生物入侵時(shí)，防御素產(chǎn)生防御的機(jī)制也并不相同。由于菌體表面存在磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)和脂多糖(LPS)等物質(zhì)，使細(xì)胞表面帶上負(fù)電荷[16]。而防御素是帶正電荷的多肽，能非特異性地與菌體表面結(jié)合，覆蓋在菌體表面，通過(guò)改變細(xì)胞壁通透性的方式，來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)成分向外排出，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。另外，一些防御素還可以通過(guò)對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁先行物脂質(zhì)Ⅱ的限制而殺死細(xì)菌[16]。

防御素在不同的環(huán)境中發(fā)揮抗病毒活性功能的機(jī)制并不相同。在有血清的環(huán)境中，防御素通過(guò)與靶細(xì)胞表面受體如G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)相互作用，改變下游信號(hào)，阻斷包膜病毒與細(xì)胞復(fù)合物的核進(jìn)入細(xì)胞或阻斷病毒RNA的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致病毒活性降低[18-21]。在黏膜表面等沒(méi)有血清的位置，在細(xì)胞還未受感染前，防御素便會(huì)作用在包膜病毒上，通過(guò)破壞病毒包膜，或與病毒糖蛋白相互作用，阻斷病毒與細(xì)胞的融合，殺滅病毒[19]。

2.2 免疫調(diào)節(jié)

作為先天免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，防御素具有免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明，防御素對(duì)T細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞都具有趨化作用；當(dāng)病原微生物入侵機(jī)體，其通過(guò)選擇性激發(fā)和吸引特定白細(xì)胞，參與免疫反應(yīng)。Chertov等[22]研究表明，0.1～100 ng人β-防御素2(HBD2)和1.0～100 ng/mL陽(yáng)離子抗菌蛋白37(CAP37)能刺激體外T細(xì)胞趨化性，誘導(dǎo)T細(xì)胞聚集成熟，促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)能力。Niyonsaba等[23]通過(guò)研究不同劑量的防御素對(duì)肥大細(xì)胞的趨化作用發(fā)現(xiàn)，3 mg/mL HBD2能誘導(dǎo)肥大細(xì)胞產(chǎn)生最大遷移，快速增加局部組織中肥大細(xì)胞數(shù)量以應(yīng)對(duì)局部感染。另外，防御素對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)具有化學(xué)吸引力，刺激其成熟[24-25]；而DC是一種抗原遞呈細(xì)胞，參與免疫反應(yīng)。

當(dāng)機(jī)體受到損傷刺激，就會(huì)觸發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥的調(diào)節(jié)關(guān)乎機(jī)體的健康。在這方面，防御素是通過(guò)調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Miles等[26]研究發(fā)現(xiàn)，人α-防御素中性粒細(xì)胞肽1(HNP1)能有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)吞噬活性，在小鼠腹膜炎模型中起主要的抗炎作用。HNP1能通過(guò)非特異性結(jié)合巨噬細(xì)胞的mRNA，或抑制tRNA或核糖體蛋白等翻譯所需的因子，抑制其翻譯，但不影響轉(zhuǎn)錄，以此來(lái)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，防止反應(yīng)過(guò)度[27]。

抗原遞呈細(xì)胞上的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一類重要的蛋白質(zhì)，其雖然主要參與非特異性免疫，但也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。許多研究已經(jīng)證實(shí)，防御素和TLR關(guān)系密切。鼠β-防御素2(MBD2)與TLR-4相互作用，通過(guò)誘導(dǎo)未成熟的樹突狀細(xì)胞上的CD40、CD80和CD86，刺激T細(xì)胞增殖，參與免疫反應(yīng)[27-30]。MBD2可以激活用TLR-4和髓樣分化蛋白2(MD2)轉(zhuǎn)染的人胚腎(HEK)293細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)，但不能在未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中激活。另外，已經(jīng)證實(shí)MBD2也作為TLR-4激活DC成熟的內(nèi)源性配體[29]。

2.3 抗氧化

防御素抗氧化作用的報(bào)道較少，作用機(jī)理也尚不清晰。薛現(xiàn)鳳等[31]研究表明，豬β-防御素1(PBD1)和豬β-防御素2(PBD2)對(duì)1，1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和羥基自由基表現(xiàn)出清除作用，且清除DPPH自由基能力有與維生素C相同的趨勢(shì)，并表現(xiàn)出還原力，在該試驗(yàn)條件下，PBD1和PBD2產(chǎn)生抗氧化能力的水平為0～256 μg/mL，且呈劑量依賴效應(yīng)。

3 防御素在畜牧業(yè)的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

目前已知的豬β-防御素(PBD)有29種，用于研究的PBD大多是通過(guò)異源表達(dá)生成的，常用的表達(dá)方式依次是大腸桿菌、畢赤酵母以及枯草芽孢桿菌。Tang等[32]研究表明，在飼糧中添加PBD2可以提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，促進(jìn)其腸黏膜絨毛-隱窩結(jié)構(gòu)的發(fā)育，有利于小腸提高消化和吸收能力；另外，還可以降低仔豬小腸血清和黏膜中一些免疫因子的濃度，如白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子，防止機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)度。推薦添加量為1 mg/(d·頭)。Peng等[33]研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加PBD2，對(duì)腸道黏膜發(fā)育有積極影響，增加了腸道絨毛高度，降低了隱窩深度，改善了仔豬生長(zhǎng)性能；此外，PBD2還可以抑制仔豬腸道有害菌群生長(zhǎng)，減少仔豬斷奶腹瀉的發(fā)生，減小斷奶應(yīng)激，推薦飼糧中添加量為5 g/kg。

關(guān)于PBD代替抗生素添加在豬精液稀釋液中的研究較少。Puig-Timonet等[34]通過(guò)在豬精液稀釋液中各添加PBD1和PBD2發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PBD1添加量為1.5和3 μmol/L時(shí)，精子活力沒(méi)有受到顯著影響；而PBD2添加量為3 μmol/L時(shí)，精子活力高于1.5 μmol/L添加量，這些結(jié)果表明PBD可以添加在精液稀釋液中，且與不添加抗生素的稀釋液相比，添加3 μmol/L PBD能有效抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)。

3.2 在禽生產(chǎn)中的應(yīng)用

雞β-防御素(AvBD)是雞的一類防御素，研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌和李斯特菌具有抑菌活性[35]。它可以誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞表達(dá)一些細(xì)胞因子并刺激絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。除了能促進(jìn)機(jī)體先天免疫，AvBD還能通過(guò)CD40影響機(jī)體的后天免疫，研究表明其有作為疫苗佐劑的潛力[36-37]。

鴨防御素方面，朱錦蘭等[38]通過(guò)研究重組鴨β-防御素2制劑對(duì)肉鴨生長(zhǎng)性能的影響發(fā)現(xiàn)，重組鴨β-防御素2對(duì)肉鴨生長(zhǎng)性能有正面效果，但并未給出最適添加量。另外，嚴(yán)霞等[39]研究發(fā)現(xiàn)，重組鴨β-防御素2對(duì)多重耐藥性大腸桿菌攻毒雛雞有較好的治療效果，應(yīng)用前景良好。

3.3 在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌的代表，能引起奶牛乳房炎，導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)力下降。研究發(fā)現(xiàn)，牛β-防御素可以有效抑制金黃色葡萄球菌。通過(guò)基因工程技術(shù)將一種溶葡萄球菌酶基因進(jìn)行改造，使其能夠在奶牛乳腺中大量表達(dá)，從而抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，且在牛奶中不被表達(dá)，可用于治療奶牛乳腺炎[40]。

產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)通常定植于家畜腸道上皮細(xì)胞上，產(chǎn)生腸毒素而引起家畜腹瀉。綿羊β-防御素2(SBD2)是綿羊β-防御素的一種，分離自綿羊胃腸道。鄒雙霞[41]通過(guò)構(gòu)建SBD2過(guò)表達(dá)和干擾載體，轉(zhuǎn)染至湖羊小腸上皮細(xì)胞中，再用F17大腸桿菌感染湖羊小腸上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)SBD2后黏附至小腸上皮細(xì)胞上的細(xì)菌數(shù)量顯著降低，干擾SBD2后黏附至小腸上皮細(xì)胞上的細(xì)菌數(shù)量顯著升高，說(shuō)明SBD2具有抗F17大腸桿菌感染小腸上皮細(xì)胞的能力。

4 小結(jié)與展望

作為AMPs的成員之一，防御素不僅具有抗病原微生物活性、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能，更多的功能都已被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)。但也有報(bào)道稱，在一定劑量下防御素會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，有助于腫瘤侵襲；另外，HNP1-3還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制血管生成[42-44]。由此可見(jiàn),防御素機(jī)制復(fù)雜，依舊是今后研究者需要探究的地方。另外，防御素可以清除自由基，在飼料保存和維持微量元素效價(jià)方面還存在研究空間。