任永雯 李鵬 張磊亮

（山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，濟南 250062）

1 外泌體

外泌體是大小為30～150 nm的膜包裹細胞外微泡，屬于一種細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）［1］。它 是 由 多 泡 體（multivesicular body，MVB）通過內(nèi)體途徑分泌的小泡，存在于各種體液中，如血液、精液、腦脊液、羊水、腹水、膽汁和母乳等。它在細胞間通訊、免疫調(diào)節(jié)和病毒傳播中起重要作用，具有與其他細胞外囊泡，如微泡、遷移體、凋亡體等不同的特點。但是，在不同的研究領(lǐng)域，囊泡的命名和分類存在著混淆和巧合，這有待研究人員用統(tǒng)一的標準給予細胞外囊泡分類。

外泌體起源于多泡體，而這些多泡體從早期的內(nèi)體中萌芽。早期內(nèi)體形成多泡體的發(fā)育過程分為4個階段：內(nèi)吞囊泡結(jié)構(gòu)、前多泡體、蒼白的多泡體和致密的多泡體（又稱晚期核內(nèi)體）［2］。成熟核內(nèi)體包含的腔內(nèi)小泡（intraluminal vesciles，ILVs）有兩種不同的命運：a.與質(zhì)膜融合并將ILVs釋放到細胞外環(huán)境的囊泡，稱為外泌體；b.未與質(zhì)膜融合的MVB將與胞內(nèi)溶酶體結(jié)合，最終被降解［3］。

外泌體能夠同時攜帶胞內(nèi)和胞外物質(zhì)，這可能與運輸需要的內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）機制 有關(guān)，因此，Alix和TSG101等ESCRT蛋白在外泌體中富集作為外泌體的標志物［4-5］。在外泌體中也檢測到其他蛋白質(zhì)，如脂質(zhì)運輸相關(guān)蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白和小泡蛋白，以及膜運輸相關(guān)蛋白，CD9、CD63和CD81等，它們進入外泌體也需要ESCRT機制的分選［6-7］。然而，運用ESCRT機制并不是細胞內(nèi)外物質(zhì)進入外泌體的唯一方法，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和RNA亦可以通過許多其他機制進入外泌體，如神經(jīng)酰胺途徑［8］和四跨膜蛋白復(fù)合物的寡聚化［9］。

2 外泌體在黃病毒科病毒感染過程中的作用

黃病毒科病毒是單股正鏈包膜RNA病毒，直徑大約50～70 nm［10］，包括許多重要的人類病原體如登革病毒（Dengue virus，DENV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）、西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）、丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）和 蘭 加 特 病 毒（Langat virus，LGTV）等［11］。大多數(shù)黃病毒科病毒通過吸血的節(jié)肢動物（如蚊子、蜱蟲等）傳播，在世界范圍內(nèi)引起各種新發(fā)和再發(fā)傳染病，從而對全球公共衛(wèi)生造成嚴重負擔(dān)［12-13］。例如，2015年在巴西暴發(fā)過寨卡病毒疫情［14］，近年來在某些地區(qū)發(fā)生了日本腦炎病毒和西尼羅病毒的流行［15］。有研究估計，世界上有40%以上的地區(qū)面臨黃病毒科病毒感染的風(fēng)險。迄今為止，除丙肝病毒外，臨床治療黃病毒科病毒感染還沒有特異性的抗病毒藥物［16］。因此，抗黃病毒科病毒感染的研究仍然極為迫切。

外泌體起源于內(nèi)體，而一些黃病毒科病毒如丙型肝炎病毒、登革病毒、寨卡病毒和西尼羅病毒則可以進入晚期內(nèi)體［17-18］，這或許是病毒蛋白和RNA被分選進入外泌體的原因之一。例如，丙型肝炎病毒基因組RNA可以進入外泌體，并且該外泌體具有感染性［19］。攜帶病毒蛋白和RNA的外泌體不僅被賦予了新的生物功能，還能影響宿主免疫應(yīng)答。但是，病毒蛋白和RNA進入外泌體的機制尚不明確。重要的是，外泌體介導(dǎo)了病毒與宿主的相互作用，這將為外泌體成為抗病毒治療的有效靶點提供重要的理論依據(jù)。

2.1 登革病毒

DENV是一種重要的由節(jié)肢動物傳播的黃病毒科病毒，分為DENV1～4共四個血清型，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，引起從無癥狀到頭痛、全身肌肉疼痛、休克和典型的登革熱等癥狀［20-21］。DENV與外泌體的密切關(guān)系近年來才為人所知，來自感染DENV細胞的外泌體可以通過介導(dǎo)細胞間的信息交流，從而影響DENV傳播。

Vora等［22］從感染DENV2或3的白紋伊蚊和埃及伊蚊體外細胞系中分離出的細胞外囊泡（包括外泌體）中發(fā)現(xiàn)了病毒RNA、E蛋白和完整的DENV基因組，這些EVs具有傳播到蚊子和哺乳動物細胞的能力。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DENV2感染上調(diào)了與E蛋白直接相互作用的四跨膜糖蛋白Tsp29Fb的表達。用外泌體產(chǎn)生和釋放的抑制劑GW4869處理細胞后，不僅減少了宿主細胞及細胞外囊泡中病毒載量，還削弱了Tsp29Fb與E蛋白相互作用，更直接影響了EVs介導(dǎo)的病毒RNA和蛋白質(zhì)向人類細胞的傳遞［22］。鑒于細胞外囊泡可分為不同類型，其在病毒感染過程中具有重要作用，Reyes-Ruiz等［23］在此基礎(chǔ)上進一步研究了外泌體與DENV的關(guān)系，感染DENV的節(jié)肢動物C3/36細胞分泌的外泌體呈“杯狀”結(jié)構(gòu)，與人類細胞的外泌體類似，含有四跨膜蛋白AalCD9和AalCD81，也含有GAPDH等宿主蛋白。他們還發(fā)現(xiàn)，DENV感染的C3/36細胞分泌的外泌體體積大于來自未感染細胞的外泌體，是因為這些外泌體內(nèi)有約55 nm的球形病毒樣顆粒，該外泌體純化后具有感染潛力，可以再次感染C3/36細胞。這些證據(jù)表明，外泌體是DENV進行細胞間傳播的新途徑。

在外泌體介導(dǎo)的抗病毒方面，宿主細胞RNA和蛋白質(zhì)參與的抗病毒作用已在DENV感染細胞分泌的細胞外囊泡/外泌體中被發(fā)現(xiàn)。有文獻報道，感染DENV3的樹突細胞分泌的小EVs（＜200 nm）同樣呈“杯狀”，不僅含有四跨膜蛋白（CD9、CD81、CD63）和一些病毒組分，還包含一些miRNA（如miR4327、miR1246、miR1261、miR142等）和39種mRNA（如RPS13、GSTT1、COX7C、GRHPR、TXNL4A、NDUFB7、DDX58、IFIT1和IFITM1等）［24］。這里的EVs與上述外泌體具有類似的特點以及內(nèi)容物，但是否為外泌體，作者并未指明。

存在于DENV感染細胞內(nèi)的miRNA，作為生物標志物可以被EVs釋放。其中，miR4327僅可在DENV急性感染或者在出血型DENV3-5532株的病人中檢測到，而在輕型DENV3-290株感染患者、流感病毒感染患者、DENV感染康復(fù)者和健康者體內(nèi)無法檢測到，使得miR4327有可能成為檢測DENV嚴重感染的特異性標志物。此外，EVs中的這些mRNA通?？梢跃幋a輔助建立抗病毒反應(yīng)的蛋白質(zhì)或者直接抵抗病毒感染的蛋白質(zhì)，受體細胞可以利用EVs蛋白免受病毒感染。Zhu等［25］則詳細驗證了干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白3（interferoninducible transmemberane protein，IFITM3）在抑制包膜病毒進入、調(diào)節(jié)病毒受體表達等方面的作用。IFITM3被證實存在于細胞外泌體中并可被外泌體釋放到細胞外。當(dāng)宿主細胞被DENV2感染，IFITM3可以通過外泌體從感染細胞傳遞到非感染細胞，從而抑制DENV的進入與感染。另外，干擾素處理后的EVs也可以保護其他細胞免受DENV感染［24-25］。另外，CLEC5A（一種針對黃病毒科病毒和細菌的模式識別受體）和CLEC2（活化血小板的蛇毒聚集素受體）是脾酪氨酸激酶（Syk）偶聯(lián)的c型凝集素受體，分別在白細胞和血小板中大量表達。DENV通過激活CLEC2促進血小板釋放外泌體和微泡，DENV誘導(dǎo)的外泌體可激活中性粒細胞和巨噬細胞上的CLEC5A和TLR2，誘導(dǎo)中性粒細胞胞外陷阱的形成和促炎細胞因子的釋放。動物實驗證明，阻斷CLEC5A和TLR2可有效減弱DENV誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，該研究將有助于開發(fā)新的急性病毒感染的治療方法［26］。

在蚊子細胞內(nèi)，DENV可以利用外泌體途徑促進感染，而哺乳動物細胞可以通過這種途徑向鄰近細胞傳遞信號進行抗病毒免疫反應(yīng)以維持細胞自我穩(wěn)定。蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等物質(zhì)可通過外泌體被運輸?shù)洁徑毎蜻h區(qū)細胞以調(diào)節(jié)細胞的各種生理和病理過程，因此外泌體將有可能作為抗病毒感染以及預(yù)防病毒感染的極佳手段。這些研究為未來以外泌體為靶點的抗病毒研究發(fā)展提供重要的理論依據(jù)且具有很強的現(xiàn)實價值。

2.2 寨卡病毒（ZIKV）

ZIKV自從南美洲暴發(fā)以來，蔓延到了許多地區(qū)，使得數(shù)百萬人被感染。雖然大多數(shù)患者無癥狀或癥狀輕微，但是部分感染可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，引起嚴重的神經(jīng)并發(fā)癥，如腦膜炎和格林-巴利綜合征［27］。

ZIKV利用外泌體為媒介在神經(jīng)元細胞間進行傳播。與DENV感染細胞產(chǎn)生的外泌體類似，ZIKV感染促進小鼠神經(jīng)元細胞釋放的外泌體，其體積大于來自未感染細胞的外泌體，并含有ZIKV RNA和E蛋白，對幼稚皮質(zhì)神經(jīng)元細胞具有高度傳染性。有趣的是，外泌體內(nèi)的ZIKV RNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的幼稚皮質(zhì)神經(jīng)元細胞內(nèi)不僅具有傳染性，還具有活性和可復(fù)制性。進一步研究表明，在ZIKV感染后，神經(jīng)元外泌體產(chǎn)生和釋放的調(diào)控取決于于中性鞘磷脂酶（nSMase）-2/SMPD3是否被激活并表達。因此，使用抑制劑GW4869或沉默SMPD3可以降低皮層神經(jīng)元外泌體介導(dǎo)的病毒傳播和病毒載量［28］。該研究為理解外泌體在ZIKV感染中的重要性提供了一個新的觀點。

外泌體可以介導(dǎo)抗ZIKV感染。干擾素和內(nèi)源性防御素等天然免疫蛋白是機體抵抗病原體入侵的第一道防線，可以預(yù)防多種病毒感染，如：人類免疫缺陷病毒、甲型流感病毒、人類乳頭瘤病毒等。IFN-β已被證明可以誘導(dǎo)一些lncRNA，進而調(diào)節(jié)宿主天然免疫反應(yīng)和自然殺傷（NK）細胞的活性。IFNβ誘導(dǎo)A549細胞產(chǎn)生的外泌體能進入NK細胞，外泌體貨物linc-EPHA6-1作為hsa-miR-4485（與NKp46的3'UTR互補結(jié)合，調(diào)節(jié)NKp46的表達）的競爭性內(nèi)源RNA，上調(diào)NK細胞受體（NKp46）表達，增強NK細胞毒性，抵抗ZIKV感染A549細胞［29］。另外，最近有研究發(fā)現(xiàn)：外泌體介導(dǎo)的防御素α1B（defensin alpha 1B，DEFA1B）可以抗ZIKV感染。相較于未感染ZIKV的A549細胞，感染細胞產(chǎn)生外泌體DEFA1B的mRNA水平明顯升高，并且在HEK293T細胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒證明：DEFA1B以劑量依賴的方式抑制ZIKV復(fù)制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，DEFA1B能與原點識別復(fù)合體1（origin recognition complex 1，ORC1）相互作用并阻止ORC1進入細胞核，抑制DNA復(fù)制從而延緩細胞周期。由于延緩的細胞周期與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)［30］，而作為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運載體的外泌體很容易穿過血腦屏障和胎盤屏障［31-32］，那么這種現(xiàn)象可能與ZIKV感染造成的小頭癥有關(guān)。有趣的是，A549細胞分泌的含有DEFA1B的外泌體能被HEK293T和SH-SY5Y細胞內(nèi)化，從而將延緩細胞周期的作用傳遞給受體細胞［33］。

內(nèi)源性限制因子IFITM3不僅能抑制DENV感染，還能抑制ZIKV進入宿主細胞并抑制病毒復(fù)制［34］；IFITM3外顯子定位于溶酶體或晚期內(nèi)體，EVs傳遞的外源IFITM3通過內(nèi)溶酶體轉(zhuǎn)運并阻斷病毒進入。相反，含有IFITM3突變體的EVs不能有效地傳遞到內(nèi)溶酶體，不能抑制病毒復(fù)制或保護細胞免受感染。此外，胎盤中IFN刺激基因（ISG）的組成性表達，包括IFITM1和IFITM3，被認為是保護發(fā)育中胎兒免受病毒感染的內(nèi)在機制。然而，與胎盤相比，發(fā)育中胎兒器官的IFITM水平較低［35］，為ZIKV在胎兒中復(fù)制提供了機會。動物實驗證明，外泌體能有效穿過胎盤屏障傳遞IFITM3抑制胎兒體內(nèi)ZIKV的復(fù)制并減輕小鼠母體和胎兒的病毒血癥，并且外泌體IFITM3不會對懷孕的小鼠和胎兒造成不良影響或產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)［36］。該研究為以外泌體為載體控制宮內(nèi)感染提供了可能性。

唾液是ZIKV在人與人之間傳播的可能來源，因為病毒會進入唾液。研究人員發(fā)現(xiàn)，生理濃度的混合唾液通過阻止病毒黏附到靶細胞而劑量依賴性地抑制ZIKV感染猴和人細胞。唾液中的抗ZIKV活性不能通過煮沸來消除，這表明抗病毒因子不是一種蛋白質(zhì)；因此他們發(fā)現(xiàn)是唾液中的細胞外囊泡（包括外泌體）以生理濃度阻止ZIKV與靶細胞的黏附和感染，從而可以抑制ZIKV感染。需要注意的是，唾液的抗ZIKV活性是保守的，但抑制程度因個體而異［37］。這項研究為未發(fā)現(xiàn)ZIKV通過唾液傳播的原因提供了一個合理的解釋，并且證明口腔先天免疫防御機制對抗某些病毒病原體有重要作用。

根據(jù)以上研究報道，外泌體作為一種將新穎有效并安全的抗病毒策略，不僅轉(zhuǎn)運病毒組分以及抗病毒物質(zhì)（表1），而且影響受體細胞或組織的生理功能以及免疫應(yīng)答，為穿過各種生物屏障抵抗病毒感染提供了有效工具。

2.3 丙型肝炎病毒（HCV）

HCV屬于黃病毒科肝炎病毒屬，是慢性肝炎的主要病因之一。據(jù)統(tǒng)計，全世界約有7 100萬人感染HCV，自2012年起，中國發(fā)病人數(shù)每年約20多萬。長期慢性HCV感染常導(dǎo)致多種肝臟疾病，包括脂肪變性、肝硬化和肝細胞癌［38］?？茖W(xué)研究表明，來自HCV感染細胞的外泌體含有病毒RNA并促進新的感染。

與其他黃病毒科病毒類似，在HCV感染細胞產(chǎn)生的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了病毒包膜蛋白以及病毒RNA。HCV感染Huh7.5.1細胞，病毒蛋白E2除了可以組成感染性HCV顆粒，還被外泌體攜帶在囊泡表面；該類外泌體具有降低HCV對E2特異性抗體的敏感性，協(xié)助HCV逃避中和抗體的作用［39］。而在HCV患者血漿和HCV感染的肝細胞上清液中分離出的外泌體含有病毒RNA，可以驅(qū)動單核細胞向髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）分化，進而促進T濾泡調(diào)節(jié)細胞的調(diào)節(jié)分化并抑制T濾泡輔助細胞的功能。這種MDSCs介導(dǎo)的T細胞失調(diào)使得外周血中T濾泡調(diào)節(jié)細胞/T濾泡輔助細胞的比率以及IL-10的產(chǎn)生增加。而經(jīng)過抗病毒治療的患者血漿分離的外泌體則不含病毒RNA，也無法誘導(dǎo)髓源性抑制細胞的分化。另外，HCV感染細胞分泌的外泌體可以抑制健康髓細胞miR-124的表達［40］。這項研究揭示了HCV感染期間免疫失調(diào)的新機制。

microRNA（miRNA）是外泌體的重要成分之一，不僅能夠調(diào)節(jié)基因表達，還可以介導(dǎo)宿主抗病毒免疫反應(yīng)。Kim等［41］前期研究發(fā)現(xiàn)，HCV侵染肝細胞能誘導(dǎo)miR-192表達，從而上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）。他們發(fā)現(xiàn)，外泌體將miR-192從病毒復(fù)制的肝細胞傳送到肝星狀細胞；在肝星狀細胞中，miRNA通過上調(diào)TGF-β1來上調(diào)肝纖維化標志物COL1A1和a-SMA等表達，造成肝星狀細胞被激活并分化為成纖維細胞。相應(yīng)的，如果將HCV侵染的肝細胞用抗miR-192處理，那么將不僅降低外泌體內(nèi)的miR192，還抑制肝星狀細胞的分化。另有一項研究［42］闡明了外泌體miRNA與利妥昔單抗（rituximab）相關(guān)的HCV活性增強的關(guān)系。利妥昔單抗是人類CD20的特異性單克隆抗體，能造成B細胞耗竭。在HCV感染患者體內(nèi)，miR-155能促進B細胞的表達上調(diào)。Liao等［42］用體外細胞實驗證明：利妥昔單抗可誘導(dǎo)B細胞耗竭，影響細胞內(nèi)miR-155的產(chǎn)生及外泌體miR-155的傳遞，從而增強肝細胞內(nèi)HCV活性。他們還發(fā)現(xiàn)，與未感染HCV的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者相比，HCV感染合并類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的患者血清樣本中的外泌體和外泌體miR-155水平顯著增強［43］。另外TLR3誘導(dǎo)的巨噬細胞外泌體的miRNA29家族也能有效地抑制HCV在Huh7細胞中的復(fù)制［44］。所以，外泌體miRNA可能成為一種潛在的HCV治療靶點［42］。

2.4 日本腦炎病毒（JEV）

JEV是亞太地區(qū)黃病毒腦炎的主要病原體。絕大多數(shù)感染病毒的人沒有明顯癥狀，但在少數(shù)感染病例中仍會出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀，特別是在兒童中死亡率很高。大多數(shù)存活下來的感染者往往遺留永久性的神經(jīng)缺陷，包括癲癇、癱瘓和智力遲鈍［45］。

腦脊液中存在大量外泌體，而腦脊液中循環(huán)miRNA的改變與多種神經(jīng)性疾病相關(guān)。Goswami等［46］研究JEV感染患者腦脊液外泌體miRNA時發(fā)現(xiàn)：有10種miRNA上調(diào)，6種miRNA下調(diào)。進一步發(fā)現(xiàn)JEV感染患者腦脊液外泌體miR-21-5p、miR-150-5p和miR-342-3p的表達顯著上調(diào)，小鼠模型實驗同樣驗證了這一變化，這3種miRNA在感染JEV的急性腦炎患者腦脊液中特異性循環(huán)。有趣的是，在不同細胞中，miRNA表達存在差異，例如檢測從體外感染JEV神經(jīng)元細胞上清中提取的外泌體，發(fā)現(xiàn)miR-21-5p和miR-150-5p表達上調(diào)，而在小膠質(zhì)細胞中miR-342-3p表達上調(diào)。用疫苗株SA14-14-2感染細胞后，這3種miRNA的水平不再被上調(diào)，這表明病毒復(fù)制可能與外泌體miRNA上調(diào)相關(guān)。對這些miRNAs假定靶基因的通路分析表明，miR-21-5p、miR-342-3p和miR-150-5p的靶基因參與了TGF-β、NGF、軸突引導(dǎo)和MAPK信號通路［46］。以上證據(jù)表明：外泌體miRNA不僅參與了JEV的感染，還可能在宿主抵抗病毒感染的過程中發(fā)揮重要作用。因此，miRNA不僅可以作為疾病診斷的指標，也可作為抗JEV的靶點。

2.5 蘭加特病毒（LGTV）

LGTV發(fā)現(xiàn)于馬來西亞蘭加特森林，主要通過蜱蟲叮咬傳播，引起蘭加特腦炎。人類對LGTV從節(jié)肢動物傳播到脊椎動物宿主的過程了解甚少。一項研究首次表明，LGTV侵染ISE6蜱細胞和神經(jīng)元細胞能促進外泌體的產(chǎn)生和釋放，該外泌體含有大量的LGTV RNA、病毒包膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1），它們具有感染性和復(fù)制性，能從節(jié)肢動物傳播到人皮膚角質(zhì)細胞和血液內(nèi)皮細胞。重要的是，感染的腦微血管內(nèi)皮細胞分泌的外泌體依賴網(wǎng)格蛋白通過血腦屏障，促進LGTV RNA和蛋白質(zhì)向神經(jīng)元細胞傳遞。GW4869可抑制外泌體中LGTV的載量和釋放，從而影響LGTV RNA和蛋白質(zhì)在節(jié)肢動物和脊椎動物宿主細胞中的傳遞［47］。近期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)LGTV存在蜱蟲體內(nèi)或在蜱細胞內(nèi)時，節(jié)肢動物IsSMase（inhibits sphingomyelinase，一種鞘磷脂D，能催化鞘磷脂等底物的裂解）的表達明顯下降，這表明IsSMase的下降水平與蜱細胞蘭加特病毒復(fù)制活性下降水平相關(guān)。LGTV感染誘導(dǎo)IsSMase使鞘磷脂增多，與膜相關(guān)的病毒復(fù)制和外泌體的發(fā)生有關(guān)。GW4869能逆轉(zhuǎn)IsSMase的活性和表達水平并降低病毒載量和鞘磷脂的積累［48］。與其他黃病毒科病毒一樣，LGTV利用節(jié)肢動物源性外泌體作為病毒RNA和蛋白質(zhì)從載體傳遞的新途徑，這些外泌體在宿主內(nèi)傳播可能導(dǎo)致神經(jīng)侵襲和神經(jīng)發(fā)生，但宿主相關(guān)蛋白能抑制病毒復(fù)制。

2.6 西尼羅病毒（WNV）

WNV可引起發(fā)熱和神經(jīng)侵入性疾病，如腦炎和脊髓灰質(zhì)炎。它會引起老年人和免疫功能低下患者的嚴重疾病，通常會增加死亡風(fēng)險［49-50］。病毒感染會改變細胞外囊泡的分子組成，研究人員發(fā)現(xiàn)WNV感染產(chǎn)生的外泌體不僅含有不具感染性的病毒粒子和病毒RNA，還會改變外泌體內(nèi)來自宿主細胞的RNA水平，如microRNA、小非編碼RNA（sncRNAs）和mRNA。更進一步研究發(fā)現(xiàn)：WNV感染過程中有依賴干擾素和不依賴干擾素的過程參與調(diào)控RNA進入EVs；感染細胞被IFN-α處理后，對外泌體內(nèi)宿主mRNA和miRNA影響顯著高于sncRNA。深入研究發(fā)現(xiàn)，感染細胞分泌的外泌體含有的mRNA參與Wnt信號和I型干擾素信號途徑；外泌體內(nèi)一些小片段RNA（＜300 nt）使得天然免疫應(yīng)答基因MDA5、TRIM25和ISG15等表達升高從而產(chǎn)生抗病毒效應(yīng)［51］。

Table 1 Interplay between exosome and Flaviviridae表1外泌體與黃病毒科病毒相互作用

根據(jù)以上研究報道，外泌體不僅可以轉(zhuǎn)運病毒組分促進病毒感染，而且可能作為一種新穎、安全有效的抗病毒載體轉(zhuǎn)運抗病毒物質(zhì)（表1），影響受體細胞或組織的生理功能以及免疫應(yīng)答，還為穿過各種生物屏障從而抵抗病毒感染提供了有效工具。

3 外泌體與冠狀病毒的相互作用

冠狀病毒，因其表面的冠狀突起而得名，是單正鏈RNA包膜病毒。冠狀病毒科分為冠狀病毒亞科（Coronavirinae）和環(huán)曲病毒亞科（Torovirinae）。其中冠狀病毒亞科又分為α、β、γ和δ 4個屬。HCoV-OC43和HCoV-229E最早發(fā)現(xiàn)于20世紀60年代末，而HCoV-NL63和HCoVHKU1分別發(fā)現(xiàn)于2004年和2005年。α和β冠狀病毒只感染哺乳動物，通常引起人類的呼吸系統(tǒng)癥狀和其他動物的胃腸炎［52-53］。α冠狀病毒（HCoVNL63和HCoV-229E）和β冠狀病毒（HCoV-OC43和HCoV-HKU1）通常只引起輕微的普通感冒癥狀。在2002～2003年，嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）引起了一場SARS流行，死亡率約10%［54］。中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）由單峰駱駝傳播給人類，在2012年造成了嚴重的流行，死亡率為37%［55］。2019年12月下旬開始暴發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）的病原體是新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）。

3.1 豬流行性腹瀉病毒

豬流行性腹瀉病毒隸屬冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種對新生仔豬具有破壞性的腸道病毒，其基因組長度約為28 kb，包括一個5'端非編碼區(qū)、3'端編碼區(qū)以及至少7個開放的閱讀框。通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，從感染豬流行性腹瀉病毒或模擬感染的新生仔豬中分離血清外泌體，證明了血清外泌體不存在病毒蛋白。而在血清外泌體中發(fā)現(xiàn)了10個補體蛋白，并且檢測到豬流行性腹瀉病毒感染的血清外泌體中C3、C6和CFB補體的表達水平明顯低于模擬感染的血清外泌體。進一步研究證明，模擬感染的新生仔豬外泌體抑制了豬流行性腹瀉病毒感染；然而，這種抑制作用在外泌體被熱滅活后消失，這表明C3、C6和CFB補體是關(guān)鍵的抗病毒分子［56］。

3.2 嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒

SARS-CoV基因組約有30 000個核苷酸，含編碼病毒的4個結(jié)構(gòu)蛋白和16個非結(jié)構(gòu)蛋白［57］。該病毒主要造成人類非典型性肺炎，重癥患者可發(fā)生呼吸衰竭、急性呼吸窘迫綜合征、休克和多臟器功能衰竭等癥狀。雖然2003年SARS疫情已經(jīng)被控制，但是仍然需要開發(fā)疫苗以應(yīng)對將來再次流行的可能性。由于S蛋白與DC-SIGN家族成員和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）結(jié)合［58-59］，從而介導(dǎo)病毒進入靶細胞，所以將該蛋白質(zhì)作為研制抗SARSCoV疫苗的靶點。研究人員探索了含有SARS冠狀病毒S蛋白的外泌體疫苗，SARS S蛋白的胞漿和跨膜結(jié)構(gòu)域被水泡性口炎病毒的G蛋白結(jié)構(gòu)域所取代，獲得了含S蛋白的外泌體。相對于野生型S蛋白，嵌合S蛋白在細胞表面水平表達更高，并可增強外泌體的釋放。在小鼠體內(nèi)檢測該疫苗的免疫原性和效力，并與表達S蛋白的腺病毒載體疫苗進行比較，發(fā)現(xiàn)含S蛋白的外泌體和腺病毒載體疫苗都能誘導(dǎo)中和抗體。用SARS-S蛋白外泌體疫苗啟動和腺病毒載體增強后，中和抗體滴度超過了SARS患者恢復(fù)期血清中的水平［60］。相對于滅活病毒疫苗和其他種類的疫苗，外泌體疫苗不僅包含病毒蛋白，也包含多種細胞蛋白，其中一些蛋白質(zhì)已經(jīng)被證明有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，但這些額外的刺激信號是否有利于誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生還有待于研究。

3.3 新型冠狀病毒

SARS-CoV-2在世界大規(guī)模流行，給各國人民的健康和經(jīng)濟發(fā)展帶來了嚴重威脅。該病毒造成急性呼吸窘迫、胃腸道窘迫、神經(jīng)功能損害、嗅覺和味覺喪失、血液凝固失調(diào)、肝損傷，急性心臟和腎臟損傷等癥狀。雖然病毒和宿主基因變異是影響疾病嚴重程度和免疫反應(yīng)結(jié)果的可能因素，但SARSCoV-2易感性和疾病表現(xiàn)變化的潛在機制目前尚不清楚。

病毒能誘導(dǎo)宿主細胞脂質(zhì)體發(fā)生變化，并挾持關(guān)鍵的能量途徑，從而為病毒感染的不同階段提供能量。研究人員利用質(zhì)譜分析了輕度、中度和重度COVID-19患者和健康對照者的血漿脂質(zhì)體和代謝組，發(fā)現(xiàn)COVID-19的血漿脂質(zhì)體與富含單唾液酸二己糖神經(jīng)節(jié)苷脂（monosialodihexosyl gangliosides，GM3）的外泌體相似，即鞘磷脂（SMs）和GM3s水平增加，二酰甘油（DAGs）減少。GM3s與CD4+T細胞計數(shù)呈負相關(guān)；隨著病情加重，COVID-19患者外泌體中的GM3越來越豐富，二者呈正相關(guān)關(guān)系。因此，富含GM3的外泌體可能參與了與COVID-19發(fā)病機制相關(guān)的病理過程［61］。

大腦是機體的“司令官”，但是大腦如何抵抗病毒感染目前尚不完全清楚。下丘腦在先天免疫與適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要作用，下丘腦神經(jīng)干細胞/祖細胞（hypothalamic neural stem/progenitor cells，htNSC）大量分泌外泌體進入腦脊液，而有些外泌體中的microRNA則被釋放［62］。利用慢病毒為載體構(gòu)建SARS-CoV-2假病毒，研究者發(fā)現(xiàn)從小鼠下丘腦神經(jīng)干/祖細胞以及海馬NSC中分離出的外泌體/微泡（exosomes/microvesicles，Ex/Mv）對不同組織細胞具有天然抗病毒效應(yīng)，在無細胞環(huán)境中也可以攻擊和降解病毒。令人驚奇的是，SARS-CoV-2假病毒侵染表達ACE2的NSC細胞系誘導(dǎo)產(chǎn)生的Ex/Mv在減少病毒感染方面比基礎(chǔ)Ex/Mv更強，這表明它參與了一種類似抗病毒的適應(yīng)性免疫功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NSC Ex/Mv具有大量piRNAs（P element-induced wimpy testis（PIWI）-interacting RNAs），其中一些piRNAs在病毒侵染時表達水平上升，可能參與了Ex/Mv的抗病毒作用［63］。綜上所述，NSC Ex/Mv具有抗病毒免疫功能，有望發(fā)展成為對抗多種病毒的藥物。值得注意的是，NSC可能不是產(chǎn)生抗病毒囊泡的唯一細胞類型，探索和發(fā)現(xiàn)具有此功能的其他類型的細胞，對于抗病毒將非常有價值。研究者發(fā)現(xiàn)，唾液細胞外囊泡（包括外泌體）可以抑制ZIKV傳播，但是不能抑制SARS-CoV-2傳播［37］。

大多數(shù)SARS-CoV-2候選疫苗選擇S蛋白進行免疫。研究者開發(fā)了一種新的SARS-CoV-2疫苗策略，使用外泌體傳遞多種SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA［64］。研究人員首先對293F細胞產(chǎn)生的外泌體進行了純化，并裝載了設(shè)計用來表達人工融合蛋白LSNME，它包含S蛋白的受體結(jié)合域、以及N、M和E蛋白的mRNA。將疫苗LSNME/SW1注射到13周齡雄性C57BL/6J小鼠體內(nèi)，免疫小鼠產(chǎn)生了CD4+和CD8+T細胞反應(yīng)，對SARS-CoV-2的N蛋白和S蛋白均顯示出劑量依賴的抗體反應(yīng)，并且達到了預(yù)期的持久反應(yīng)［64］。這種新型外泌體疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比，不僅含有病毒蛋白，還具有已經(jīng)證明可以促進免疫應(yīng)答的細胞蛋白，有利于誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，對于SARS-CoV-2疫苗的研究具有重要意義。

冠狀病毒感染產(chǎn)生的外泌體同樣可含有病毒蛋白，以及外泌體內(nèi)宿主細胞蛋白或RNA可能參與了宿主抵抗病毒的免疫過程（表2）。雖然還不知道以外泌體為靶點或載體的治療方法以及外泌體疫苗對人類的效果，這些研究為目前正在全世界大流行的SARS-CoV-2的預(yù)防和抗病毒治療提供了一種可能性，具有重要的現(xiàn)實意義。

Table 2 Interplay between exosome and Coronaviridae表2外泌體與冠狀病毒科病毒的相互作用

4 總結(jié)與展望

本綜述探討了外泌體在黃病毒科病毒傳播和宿主免疫應(yīng)答過程中的作用。一方面，黃病毒科病毒相關(guān)的外泌體促進病毒感染。黃病毒科病毒可以利用外泌體越過內(nèi)皮屏障或逃脫免疫監(jiān)視，增強病毒的傳播能力，還能在個體的不同細胞內(nèi)或跨不同屬傳播，增加可被感染的細胞類型。另一方面，外泌體可作為免疫系統(tǒng)的誘餌。含有病毒成分和宿主細胞物質(zhì)的外泌體能夠激活免疫反應(yīng)，以抑制病毒的傳播。

本綜述還探討了外泌體與冠狀病毒的關(guān)系。外泌體可能有助于冠狀病毒的傳播：一方面，病毒受體蛋白如ACE2等可能會被分選進入外泌體，使受體細胞容易受到病毒感染；另一方面，病毒可能被引導(dǎo)進入外泌體途徑，其成分被包裝到外泌體中進行分泌，利用外泌體逃逸免疫監(jiān)視從而促進傳播。外泌體具有抗SARS-CoV-2功能：外泌體不僅可以誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)抗病毒，還可以包裹病毒蛋白作為疫苗誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生?；谕饷隗w可以建立多種SARS-CoV-2感染治療策略，如抑制外泌體生物發(fā)生和攝取、外泌體治療、基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)和基于外泌體的疫苗。

總之，對外泌體的研究已經(jīng)成為研究病毒感染的新視角。外泌體作為物質(zhì)交換和信息交流的媒介，在病毒與宿主細胞間的相互作用中起著重要的作用。了解與RNA病毒感染相關(guān)外泌體的分子機制，豐富對于病毒進入、復(fù)制、傳播和感染的認識，還將有助于開發(fā)更好的策略來預(yù)防和診治黃病毒科病毒和冠狀病毒引起的疾病。