倪曉琦 陳錫威 金曉鋒*

（1）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，寧波 315211；2）寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江省病理生理學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211）

1 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)

蛋白質(zhì)是人體細(xì)胞、組織的重要成分，也是機(jī)體重要的功能分子。正常生理?xiàng)l件下，蛋白質(zhì)需要通過(guò)及時(shí)地表達(dá)并被準(zhǔn)確地修飾來(lái)維持正常功能，而后在細(xì)胞內(nèi)被降解，以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)。蛋白質(zhì)降解過(guò)程不僅與細(xì)胞周期、信號(hào)傳導(dǎo)、DNA轉(zhuǎn)錄和翻譯等生理過(guò)程有關(guān)，還能下調(diào)對(duì)機(jī)體有危害的調(diào)節(jié)因子，降解多余、功能失調(diào)和受損的細(xì)胞成分，循環(huán)利用資源和能量，具有十分重要的生理意義。人體細(xì)胞中存在多種蛋白質(zhì)降解途徑，研究最多的是溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體（ubiquitinproteasome system，UPS）途徑，其中溶酶體途徑主要降解細(xì)胞內(nèi)吞的胞外蛋白質(zhì)，UPS則主要降解胞內(nèi)泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。

UPS由泛素修飾蛋白質(zhì)底物的特定酶和水解標(biāo)記底物的26S蛋白酶體組成。泛素與底物的結(jié)合是通過(guò)由泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素綴合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）和泛素-蛋白質(zhì)連接酶（ubiquitin-protein ligase，E3）組成的多步級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。簡(jiǎn)言之，E1利用ATP水解產(chǎn)生的能量，在泛素C端和E1酶活性催化位點(diǎn)的Cys殘基之間生成硫酯鍵，這種激活的泛素然后被轉(zhuǎn)移到E2，在E2和泛素之間形成硫酯鍵，最后，帶電荷的E2與數(shù)百個(gè)E3合作將激活后的泛素轉(zhuǎn)移到目標(biāo)底物，最后使目標(biāo)底物被泛素化修飾［1］。其中，E3包含兩個(gè)不同的功能：催化異肽鍵的形成和招募底物。兩個(gè)主要的E3連接酶家族已被描述：HECT結(jié)構(gòu)域家族（因其與E6相關(guān)蛋白羧基末端的同源性而命名）和RING家族（其包含了泛素連接酶活性所必需的內(nèi)在環(huán)指結(jié)構(gòu)域或相關(guān)環(huán)指蛋白亞單位）［2］。

而Cullins家族是迄今為止最大的E3連接酶復(fù)合體家族，它是一個(gè)進(jìn)化上保守的蛋白質(zhì)家族，在芽殖酵母和分裂酵母中包含3個(gè)相關(guān)基因，在蠕蟲(chóng)、果蠅和人類中包含6個(gè)相關(guān)基因。Cullins蛋白作為分子支架，可通過(guò)一個(gè)保守的C端結(jié)構(gòu)域與環(huán)指蛋白R(shí)bx1結(jié)合，而Rbx1蛋白則可招募一種帶泛素的E2蛋白，即獲得了E2的催化功能；而后通過(guò)一個(gè)獨(dú)特的N端結(jié)構(gòu)域，單個(gè)Cullins通過(guò)銜接蛋白與E3泛素連接酶結(jié)合以招募特定的底物。Cullin3（Cul3）作為Cullins家族的成員之一，可與具有BTB結(jié)構(gòu)域broad complex-tramtrack-bric-abrac的蛋白質(zhì)直接結(jié)合，形成大量的BTB-Cul3-Rbx1泛 素 連 接 酶［3］。Kelch樣ECH關(guān) 聯(lián) 蛋 白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1），作為Cul3-Rbx1 E3泛素連接酶復(fù)合物的底物銜接蛋白，目前已有許多研究證明了其突變與癌癥發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)。本文將從Keap1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能、Keap1基因的突變情況、Keap1導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制等方面作一綜述。

2 Keap1蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

Keap1是一個(gè)分子質(zhì)量為70 ku的蛋白質(zhì)，包括624個(gè)氨基酸，位于19號(hào)染色體p13.2位，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，正常情況下錨定于胞漿的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上。它是一種BTB-Kelch蛋白，是Cul3依賴的泛素連接酶復(fù)合物的底物銜接蛋白。Keap1主要結(jié)構(gòu)域包括NTR結(jié)構(gòu)域（N-terminal region，1～60位氨基酸殘基）、與Cul3相互作用的BTB結(jié)構(gòu) 域（61～179位 氨 基 酸 殘 基）、IVR結(jié) 構(gòu) 域（intervening region，180～314位氨基酸殘基）、含有6個(gè)Kelch重復(fù)結(jié)構(gòu)域的DGR結(jié)構(gòu)域（double glycine repeat，315～359、361～410、412～457、459～504、506～551、553～598位氨基酸殘基）和CTR結(jié)構(gòu)域（C-terminal region，599～624位氨基酸殘基）［4］（圖1a）。

BTB結(jié)構(gòu)域是一段進(jìn)化上保守的基序，功能多樣，包括介導(dǎo)Keap1同源二聚和與Cul3連接酶復(fù)合物結(jié)合的作用。且BTB結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)半胱氨酸殘基C151被發(fā)現(xiàn)是Keap1在親電刺激下降低E3活性所必需的［5］。

IVR結(jié)構(gòu)域富含一些半胱氨酸殘基，可用來(lái)調(diào)節(jié)Keap1活性。此結(jié)構(gòu)域上的C273和C288對(duì)于Keap1維持泛素E3連接酶活性和降解Nrf2是必不可少的。此外，IVR結(jié)構(gòu)域?qū)TB結(jié)構(gòu)域與C端Kelch/DGR結(jié)構(gòu)域連接起來(lái)。同時(shí)，Keap1通過(guò)IVR結(jié)構(gòu)域與Cul3的N端區(qū)域結(jié)合。

Keap1的Kelch/DGR域是一個(gè)六葉片β螺旋槳結(jié)構(gòu)，其中I-VI螺旋槳的每個(gè)葉片由4個(gè)β-股（A～D）組成。β螺旋槳的中心核投射出不同長(zhǎng)度的環(huán)，組成這些β股。根據(jù)慣例，連接β股A和B（A-B）或β股C和D（C-D）的短環(huán)定義了β螺旋槳的底部，而連接β股D和A（D-A）或β股B和C（B-C）的較長(zhǎng)環(huán)定義了β螺旋槳的頂部［6］，該結(jié)構(gòu)域具有識(shí)別與結(jié)合底物蛋白的功能。

3 Keap1的泛素化底物

Keap1通過(guò)泛素作用于其下游底物，例如核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）被Keap1泛素化并靶向蛋白酶體降解；IκB激酶亞單位β（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit beta，IKKβ）也可以被Keap1泛素化并由26S蛋白酶體降解。此外，選擇性自噬接頭蛋白p62（sequestosome1，SQSTM1/p62）、性 別 決 定 區(qū) 域Y框9（sex determining region Y-box 9，SOX9）、凋亡調(diào)節(jié)劑（apoptosis regulator）Bcl-2、絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋 白 磷 酸 酶（serine/threonine-protein phosphatase）PGAM5、線粒體Rho GTPase 2（mitochondrial Rho GTPase 2，Miro2）、STE20樣 絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋 白 激 酶（STE20-like serine/threonine-protein kinase，SLK）和有絲分裂紡錘體裝配檢查點(diǎn)蛋白MAD2A（mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2A，MAD2L1），以及可能的非常規(guī)肌球蛋白Ixb（unconventional myosin-IXb，Myo9b）同樣也被Keap1泛素化修飾并降解。值得注意的是，另外存在一些能被Keap1泛素化但不被降解的底物，如DNA復(fù)制許可因子（DNA replication licensing factor）MCM3、BRCA2定位協(xié)作因子（partner and localizer of BRCA2，PALB2）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜傳感器NFE2L1（nuclear factor-erythroid 2-related factor 1，Nrf1）等?？傊?，Keap1作為E3泛素連接酶的接頭蛋白，對(duì)比Cul3家族的另一種E3接頭蛋白SPOP而言，其下游泛素化底物仍有很大的研究空間。截至目前被文獻(xiàn)報(bào)道的所有Keap1泛素化底物見(jiàn)表1。

Fig.1 Structure，function of Keap1 and Keap1-mediated mechanism pathways圖1 Keap1結(jié)構(gòu)、功能及相關(guān)分子機(jī)制

Table 1 Ubiquitylation substrates of Keap1表1 Keap1的泛素化底物

4 Keap1的降解型底物

Keap1作為Cul3-Rbx1 E3泛素連接酶復(fù)合物的一部分，介導(dǎo)了包括Nrf2、Ikkβ、p62、SOX9、Bcl-2、PGAM5、Miro2、SLK、MAD2L1和Myo9b的降解。Keap1同這些底物一起組成了一個(gè)十分復(fù)雜的細(xì)胞生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)，參與了眾多細(xì)胞過(guò)程。尤其在癌癥中，Keap1既是抑癌蛋白也是促癌蛋白，因此，了解Keap1和這些底物所參與的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)非常重要。下文側(cè)重于通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)4種底物Nrf2、Ikkβ、p62和SOX9來(lái)闡述Keap1在癌癥或疾病中的作用，并提及了這4種底物互相之間的橫向聯(lián)系，提示了Keap1網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。

4.1 Keap1與Nrf2

Keap1最初發(fā)現(xiàn)的底物就是Nrf2，也是人們研究最多的底物。Keap1-Nrf2系統(tǒng)是細(xì)胞防御和生存相互影響的重要節(jié)點(diǎn)，Keap1充當(dāng)氧化還原損傷的富含半胱氨酸硫醇的傳感器，而Nrf2是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，作為效應(yīng)器來(lái)協(xié)同激活細(xì)胞中包括抗氧化酶、排毒酶、炎癥相關(guān)蛋白、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶等保護(hù)基因，在氧化應(yīng)激和代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用［23］。相反，Keap1-Nrf2的失調(diào)導(dǎo)致Nrf2異常激活也會(huì)引起病理變化，尤其在癌癥中［23-26］。

Nrf2由Nfe2l2基因編碼，屬于堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn) 錄 因 子 和cap-ncollar（CNC）家族。Nrf2的分子質(zhì)量約為68 ku，由人體內(nèi)的589個(gè)氨基酸組成，可以分為7個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域：Neh1～7。Neh1結(jié)構(gòu)域包含介導(dǎo)與DNA結(jié)合和形成二聚體的CNC和bZIP結(jié)構(gòu)域；Neh2結(jié)構(gòu)域包含分別與Keap1具有高親和力和低親和力的ETGE和DLG基序，該結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Nrf2的降解并抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性［15］；Neh3結(jié)構(gòu)域位于Nrf2的C端，是必不可少的功能區(qū)域，可以與染色質(zhì)域解旋酶DNA結(jié)合蛋白6（chromodomainhelicase-DNA-binding protein 6，CHD6）結(jié)合并激活抗氧化響應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）［27］；Neh4和Neh5結(jié) 構(gòu) 域 可 以 與 激 活 物cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）結(jié)合，以幫助Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核［28］；具有大量絲氨酸殘基的Neh6結(jié)構(gòu)域抑制Nrf2轉(zhuǎn)錄，而與Keap1無(wú)關(guān)［29］；Neh7結(jié)構(gòu)域識(shí)別類視黃醇X受體α（retinoid X receptor alpha，RXRα）［30］。另外，Nrf2的第40個(gè)氨基酸是磷酸化位點(diǎn)，該位點(diǎn)的磷酸化導(dǎo)致Nrf2從Keap1上解離［31］。

正常生理?xiàng)l件下，Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul3 E3泛素連接酶復(fù)合物結(jié)合，兩個(gè)Keap1分子通過(guò)BTB區(qū)形成同型二聚體，然后Keap1二聚體可以通過(guò)DGR結(jié)構(gòu)域，結(jié)合Nrf2的ETGE和DLG基序，并以1∶1的比例直接相互作用。Nrf2的Neh6域中DSGIS和DSAPGS氨基酸基序與Keap1結(jié)合，然后將泛素連接酶復(fù)合物上的泛素轉(zhuǎn)移到Nrf2的ETGE和DLG基序之間的7個(gè)賴氨酸殘基（K40、K50、K52、K53、K56、K64和K68）上。Keap1可能與泛素伴侶去泛素化蛋白（deubiquitinating protein，VCP）VCPIP和兩個(gè)蛋白酶體泛素受體26S蛋白酶體非ATPase調(diào)節(jié)亞基2（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 2，PSMD2）和26S蛋 白 酶 體 非ATPase調(diào) 節(jié) 亞基4（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4，PSMD4）的相互作用以誘導(dǎo)泛素化的Nrf2傳遞至蛋白酶體，并被快速降解［32］。在氧化應(yīng)激條件下，線粒體會(huì)產(chǎn)生大量的高活性分子，例如活性氧。當(dāng)活性氧含量超過(guò)細(xì)胞清除能力時(shí)，氧化還原系統(tǒng)發(fā)生失衡，對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA造成氧化損傷，并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，組織或器官損傷。因此，Nrf2途徑被顯著激活，其具體機(jī)制如下：a.Keap1的IVR區(qū)中C273和C288巰基被氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致空間構(gòu)象變化。然后，具有強(qiáng)結(jié)合能力的高親和力ETGE基序仍然能夠緊密結(jié)合Keap1，而弱的、低親和力的DLG基序則與Keap1分離。隨著Nrf2的空間定位變化，它不能被泛素蛋白酶體降解［33］。b.Keap1的BTB結(jié)構(gòu)域中的C151被修飾并產(chǎn)生位阻效應(yīng)，導(dǎo)致Keap1和Cul3解離［34］。這破壞了Keap1-Cul3 E3泛素連接酶復(fù)合物的活性，并抑制了泛素介導(dǎo)的Nrf2降解。當(dāng)Keap1-Keap1-Nrf2的量達(dá)到飽和時(shí)，Keap1同型二聚體無(wú)法在細(xì)胞中再生，并且新生成的Nrf2由于其自身的保護(hù)而不再與Keap1結(jié)合。Nrf2遷移到細(xì)胞核并與小Maf蛋白（small Maf protein，sMaf）結(jié)合。然后，Nrf2-sMaf與ARE結(jié)合并增加抗氧化劑蛋白和II期解毒酶的轉(zhuǎn)錄激活。而細(xì)胞核中過(guò)多不必要的Nrf2則被糖原合酶激酶3b（glycogen synthase kinase 3b，GSK-3β）磷酸化，從而使其能夠被包含β轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白（β-transducin repeatcontaining protein，β-TrCP）識(shí) 別，被β-TrCPCUL1 E3泛素連接酶復(fù)合物泛素化并通過(guò)蛋白酶體降解。但這種基于β-TrCP的Nrf2降解方式獨(dú)立于Keap1，且被認(rèn)為是次要的［29］。細(xì)胞核中的Nrf2也能通過(guò)Keap1的短暫穿梭入核被泛素化而被抑制［35］。當(dāng)氧化還原平衡恢復(fù)后，Nrf2從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中被泛素化降解［36］（圖1b）。

Keap1-Nrf2系統(tǒng)吸引了基礎(chǔ)和臨床癌癥研究領(lǐng)域科學(xué)家的廣泛興趣，除了在細(xì)胞生理學(xué)和應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用外，其在癌細(xì)胞中也得到廣泛利用，并且在賦予癌細(xì)胞生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)、支持癌癥代謝和促進(jìn)惡性轉(zhuǎn)化方面起著關(guān)鍵作用。這與已知的Nrf2保護(hù)作用相反，暗示了Keap1-Nrf2系統(tǒng)在癌癥中的雙重作用。為了研究Keap1在腫瘤發(fā)展中的直接作用，Wakabayashi等［37］創(chuàng)建了Keap1基因敲除小鼠。這種遺傳結(jié)構(gòu)具有致死性，并且在出生后3周內(nèi)無(wú)法生存。然而，在死亡之前，這些小鼠表現(xiàn)出高水平的Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)，并顯示肝臟內(nèi)排毒酶的上調(diào)。有報(bào)道說(shuō)，Keap1可以作為腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制劑，它靶向非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，NSCLC）細(xì) 胞 中 的Nrf2-S100P途徑［38］。最近有報(bào)道說(shuō)，Keap1缺失會(huì)過(guò)度激活Nrf2，并 在 小 鼠 中 促 進(jìn)KRAs（kainate-type glutamate receptors）驅(qū)動(dòng)的肺腺癌并導(dǎo)致對(duì)谷氨酰胺分解的依賴性［39］。Keap1缺失還能協(xié)同PI3K途徑共同驅(qū)動(dòng)免疫微環(huán)境改變的NSCLC［40］。此外，在人類各種癌癥中發(fā)現(xiàn)了Keap1的體細(xì)胞突變。發(fā)現(xiàn)Keap1的N端和BTB結(jié)構(gòu)域上的某些突變可破壞Keap1-Cul3-Rbx1泛素復(fù)合物的形成，而Kelch結(jié)構(gòu)域上的其他突變則可減少Keap1與Nrf2的相互作用，從而使其穩(wěn)定［41-43］。在肝癌和膽囊癌中發(fā)現(xiàn)Keap1的體細(xì)胞突變，這些突變使Nrf2的表達(dá)不受限制，從而導(dǎo)致II期解毒酶和抗氧化劑蛋白的誘導(dǎo)，從而證明對(duì)癌細(xì)胞具有化學(xué)抗藥性［44］。最近一項(xiàng)研究將癌癥中40%的Keap1突變歸為ANCHOR突變體，這些突變體比野生型Keap1和泛素化Nrf2結(jié)合更多的Nrf2，但它們不能促進(jìn)Nrf2降解。在活細(xì)胞中，Keap1 R320Q和R470C ANCHOR突變體與Nrf2、p62和多聚泛素共定位在快速融合和溶解的結(jié)構(gòu)化球形液滴中。透射電子顯微鏡結(jié)合共聚焦熒光成像顯示無(wú)膜相分離的生物分子冷凝物。Cloer等［32］提出了一個(gè)模型，其中ANCHOR突變形成并形成p62依賴相分離的球形簇，其包含被未修飾和磷酸化的p62、多聚泛素和Nrf2包圍的Keap1陽(yáng)性核心。該模型可能代表某種受損的蛋白酶體降解和自噬之間的過(guò)渡狀態(tài)。總之，這些事件表明Keap1發(fā)揮抑癌作用，因?yàn)樗娜狈?huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，Keap1表達(dá)或功能的降低則會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。有趣的是，最近研究表明Keap1在癌癥中發(fā)揮雙重作用。在肝特異性Keap1基因敲除小鼠模型中，Keap1缺失引起的Nrf2激活可防止肝纖維化的癌癥的發(fā)生。這提示了Keap1在非酒精性慢性肝癌中的促癌作用［45］。

最近有研究關(guān)注于Keap1與Nrf2之間蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）上，提出Keap1不僅能抑制Nrf2，它也受Nrf2抑制。過(guò)量Keap1的存在是對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有害的。Nrf2缺乏的細(xì)胞中，由于Keap1靶向Miro2的降解，導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)顯著失調(diào)［13］。此外，可抑制Keap1的Nrf2蛋白不足會(huì)導(dǎo)致Rho GTPase激活蛋白1（Rho GTPase-activating protein 1，RhoGAP1）過(guò)量，從而調(diào)節(jié)Cdc42（cell division cycle 42）活性。這損害了足小體的組裝并破壞了肌動(dòng)蛋白的重排，從而阻止了血管生成［46］。但Nrf2能充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)束縛Keap1，允許足小體組裝核血管生成，而不受Nrf2轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控［47］。最近人們還似乎將Keap1-Nrf2系統(tǒng)與衰老聯(lián)系起來(lái)［48］。已經(jīng)有研究表明，Nrf2會(huì)在衰老或者早衰模型中增加［49］。Keap1在衰老中的作用仍有待發(fā)現(xiàn)。

4.2 Keap1和IKKβ

IKKβ由IKBKB基因編碼，是一種絲氨/蘇氨酸激酶，分子質(zhì)量為86 ku。IKKβ主要位于細(xì)胞質(zhì)中，也可以在細(xì)胞核中少量存在。IKKβ包含756個(gè)氨基酸，由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）、二聚結(jié)構(gòu)域（scaffold/dimerization domain，SDD）、泛 素 樣 結(jié) 構(gòu) 域（ubiquitin-like domain，ULD）、C端NEMO結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NEMO binding domain，NBD）［50］。

細(xì)胞質(zhì)中的IKKβ在核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著關(guān)鍵控制者的作用。多種促炎刺激可以激活I(lǐng)KKβ，然后將IKKβ磷酸化，從而導(dǎo)致核因子κB抑制劑（inhibor of nuclear factor-kappa-B，IκB）泛素化并隨后通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解。IκB的去除導(dǎo)致NF-κB的核易位并誘導(dǎo)與免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管生成、細(xì)胞存活，腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄［51］。此外，IKKβ還通過(guò)磷酸化介導(dǎo)的抑癌基因抑制作用顯示了其非NF-κB的致瘤性［52］。細(xì)胞核中的IKKβ則是紫外線誘導(dǎo)的NF-κB活化中IκB泛素化和降解的銜接蛋白［53］。

有研究發(fā)現(xiàn)，Keap1通過(guò)充當(dāng)IKKβ E3連接酶來(lái)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而抑制癌癥［9］。生理情況下，Keap1 DLG結(jié)構(gòu)域與IKKβ KD結(jié)構(gòu)域的ETGE基序結(jié)合，并介導(dǎo)IKKβ上的第555位賴氨酸的K48型多聚泛素化及隨后的26S蛋白酶體降解。IKKβ的酪氨酸尤其是Tyr525主導(dǎo)了Keap1對(duì)Nrf2的特異性識(shí)別［54］。Keap1對(duì)IKKβ的失調(diào)同樣也在癌癥中出現(xiàn)。Keap1是抑癌的，在肝癌中的S404X和D479G突變體以及肺癌和乳腺癌中的G333C、G364C、R413L和G430C突變體被證明減弱Keap1和IKKβ的結(jié)合親和力及之后的泛素化和降解，導(dǎo)致NF-κB通路激活而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。有趣的是，C23Y突變體會(huì)干擾Keap1-Cul3-Rbx1泛素復(fù)合物的形成，但和野生型Keap1介導(dǎo)的IKKβ泛素化之間沒(méi)有差異?？傊?，這些事件說(shuō)明，一些Keap1突變體也作為腫瘤的啟動(dòng)子。另外，一項(xiàng)對(duì)肺癌突變的全面表征研究表明，Cul3-Keap1-Rbx1復(fù)合物任一成分的遺傳改變都足以破壞復(fù)合物的完整性，導(dǎo)致IKKβ降解的失調(diào)及隨后NF-κB的異常激活，進(jìn)而促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展［55］（圖1c）。

IKKβ和Nrf2是Keap1的主要底物?？紤]到Keap1-Nrf2-ARE和IKKβ-NF-κB通路在炎癥和癌癥的病理過(guò)程中起相反的作用，因此NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)和Nrf2-ARE通路的干擾對(duì)于維持平衡至關(guān)重要。目前已經(jīng)報(bào)道了關(guān)于NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)和Nrf2-ARE途徑之間串?dāng)_的一些初步發(fā)現(xiàn)。NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)可以通過(guò)p65（NF-κB的亞單位）和Keap1的相互作用來(lái)抑制Nrf2-ARE途徑［56］。在另一項(xiàng)研究中，p65通過(guò)從Nrf2剝奪CBP和促進(jìn)組蛋白脫乙酰基酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）募集到ARE參與了抗氧化基因表達(dá)的下調(diào)［57］。最近一項(xiàng)對(duì)Keap1-IKKβ之間PPI的研究表明，Keap1是Keap1-Nrf2-ARE和IKKβ-NF-κB之間串?dāng)_的新節(jié)點(diǎn)，該發(fā)現(xiàn)也為細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了有價(jià)值的見(jiàn)解［54］。

4.3 Keap1與p62

p62，也稱為SQSTM1，是一種泛素結(jié)合自噬受體，分子質(zhì)量為62 ku。p62主要位于細(xì)胞質(zhì)中并且可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間穿梭，在自噬體以及溶酶體中也存在。p62具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，包括N端Phox1和Bem1p結(jié)構(gòu)域（Phox1 and Bem1p，PB1），其介導(dǎo)p62的異二聚或均聚而作為蛋白質(zhì)結(jié)合模塊；LC3相互作用域（LC3-interacting region，LIR），介導(dǎo)與ATG8家族蛋白的相互作用；泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-associated，UBA），能與多聚泛素化底物的K63型多泛素鏈特異性結(jié)合；Keap1相互作用區(qū)（Keap1-interacting region，KIR），介導(dǎo)了與Keap1的結(jié)合；ZZ型鋅指（ZZ-type zinc finger，ZZ），介導(dǎo)了與受體相互作用的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（receptor-interacting serine/threonine-protein kinase1，RIPK1）的相互作用。此外，p62還具有腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6結(jié)合基序（tumor necrosis receptor-associated factor 6（TRAF6）-binding，TB）。p62被認(rèn)為是一個(gè)多功能信號(hào)樞紐，它參與了營(yíng)養(yǎng)敏感中雷帕霉素復(fù)合物1（rapamycin complex1，mTORC1）機(jī)械性靶點(diǎn)的激活［58］、炎癥和凋亡過(guò)程中NF-κB的激活［59］，抗氧化反應(yīng)中Keap1-Nrf2通路的激活［18］，以及在選擇性自噬中提到的受體作用［60］。最近研究發(fā)現(xiàn)，p62在引起液-液相分離中也有重要作用［61-63］。

有研究發(fā)現(xiàn)，Keap1充當(dāng)p62的E3泛素連接酶，將p62靶向泛素化和自噬降解，而保護(hù)疾病中細(xì)胞的死亡［17］。Keap1同源二聚體與p62二聚體上的兩個(gè)高親和力KIR基序結(jié)合，導(dǎo)致其UBA結(jié)構(gòu)域上的K420殘基被泛素化修飾，進(jìn)而p62所具有的與泛素化蛋白質(zhì)聚集體螯合成p62包涵體的能力得到進(jìn)一步增強(qiáng)。隨后包涵體與自噬體膜上LC3（自噬相關(guān)蛋白8的同源蛋白）結(jié)合的能力也被加強(qiáng)，使p62和被泛素化的蛋白質(zhì)一起通過(guò)溶酶體途徑被降解（圖1d）。在退行性疾病包括骨佩吉特病、肌萎縮側(cè)索硬化、額顳葉癡呆，以及包涵體肌病中［64-65］，存在p62-UBA結(jié)構(gòu)域內(nèi)的主要遺傳性錯(cuò)譯或者缺失突變，但是p62突變?nèi)绾螀⑴c疾病的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，可能與泛素結(jié)合活性降低有關(guān)。而研究發(fā)現(xiàn)，這些不同組織的共同致病機(jī)理是p62聚集體和泛素化內(nèi)含物積累導(dǎo)致的。p62 S349的磷酸化可以被UBA結(jié)構(gòu)域中的點(diǎn)突變破壞，該突變會(huì)減弱其泛素結(jié)合功能［66］。然后，p62上的S349的磷酸化增加了p62對(duì)Keap1的親和力［67］。也可以想象p62中的UBA結(jié)構(gòu)域相關(guān)疾病突變影響S349磷酸化，從而廢除了Keap1-Cul3介導(dǎo)的UBA結(jié)構(gòu)域泛素化。最近研究發(fā)現(xiàn)，在Keap1相互作用區(qū)域內(nèi)也存在著與骨佩吉特病和肌萎縮側(cè)索硬化相關(guān)的p62錯(cuò)義突變［68-69］，這些突變導(dǎo)致p62與Keap1相互作用的喪失和Nrf2信號(hào)的減弱，這些突變還可能影響p62的UBA域的泛素化修飾。

P62與Keap1-Nrf2通路之間存在串?dāng)_，p62可以激活Nrf2，并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核并激活抗氧化基因，來(lái)響應(yīng)氧化應(yīng)激。P62的調(diào)控作用可以通過(guò)3條途徑：a.磷酸化的p62 KIR域可能識(shí)別Keap1的DGR域，形成p62-Keap1復(fù)合物，該復(fù)合物可通過(guò)UPS途徑清除［70］；b.p62通過(guò)組裝p62-Keap1復(fù)合物和LC3形成LC3-p62-Keap1復(fù)合物來(lái)控制Keap1轉(zhuǎn)化，通過(guò)選擇性自噬消除p62［71］；c.Nrf2啟動(dòng)靶基因p62的表達(dá)［72］。最近Tan等［62］在二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生模型中，發(fā)現(xiàn)凋亡調(diào)節(jié)因子1（modulator of apoptosis 1，MOAP-1）缺陷小鼠表現(xiàn)出較高的腫瘤負(fù)擔(dān)且伴隨著p62自噬小體和Nrf2信號(hào)傳導(dǎo)的水平過(guò)高［62］。他們提出MOAP-1介導(dǎo)p62自噬小體的解離釋放Keap1并抑制Nrf2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在誘導(dǎo)刺激p62自噬小體形成的細(xì)胞應(yīng)激之后，MOAP-1被募集到p62自噬小體中，并降低了其水平，而與自噬途徑無(wú)關(guān)。MOAP-1與p62的PB1-ZZ域相互作用，并干擾其自身低聚和液-液相分離，從而拆卸了p62分子。最近也有研究表明，p62激活的Nrf2途徑是神經(jīng)退行性疾病的重要標(biāo)志。p62-Keap1-Nrf2陽(yáng)性反饋回路和Nrf2通路參與消除阿爾茨海默病誘導(dǎo)的活性氧（ROS）和蛋白質(zhì)聚集［31］。神經(jīng)退行性疾病中也很容易觀察到p62自噬小體，神經(jīng)元中的p62自噬小體如何調(diào)控及維持p62-Keap1-Nrf2正反饋環(huán)路的體內(nèi)平衡可能是治療神經(jīng)退行性疾病的潛在目標(biāo)。

4.4 Keap1和SOX9

SOX9是結(jié)構(gòu)相關(guān)的性別決定區(qū)Y盒轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，在發(fā)育過(guò)程中對(duì)實(shí)現(xiàn)不同的功能至關(guān)重要。SOX9由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：DIM結(jié)構(gòu)域、HMG結(jié)構(gòu)域、反式結(jié)構(gòu)域。DIM結(jié)構(gòu)域位與N端，介導(dǎo)自身的二聚化；HMG結(jié)構(gòu)域在DIM之后，由兩個(gè)核定位信號(hào)和夾在中間的一個(gè)核出口信號(hào)組成，介導(dǎo)與DNA的結(jié)合和核定位；反式結(jié)構(gòu)域包括保守域2（conserved domain-2，K2），脯氨酸、谷氨酰胺和富含丙氨酸的域（proline，glutamine，and alanine rich domain，PQA）以及一個(gè)反式激活域（transactivation domain，TA）［73］。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，Keap1是SOX9的E3連接酶，靶向泛素化和蛋白酶體降解，抑制癌癥的發(fā)生［22］。正常情況下，Keap1可以結(jié)合分別位于SOX9 N端和K2結(jié)構(gòu)域上的DLK基序，后者是Keap1的主要結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)K2域上的DLK基序缺失將阻止Keap1介導(dǎo)的SOX9第249位賴氨酸上的多聚泛素化（泛素是K6、K11、K27和K33的混合連接型）及進(jìn)一步的蛋白酶體途徑降解。此外，SOX9的磷酸化促進(jìn)了其與Keap1的相互作用，例如CKI激動(dòng)劑或DNA損傷藥物可通過(guò)促進(jìn)Keap1的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)其對(duì)SOX9降解來(lái)抑制SOX9介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生。然而，肺癌中的R204P、G333S、W497L、G603W和E611D Keap1突變體被證明減弱Keap1和SOX9的結(jié)合親和力及之后的泛素化和降解，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生。有趣的是，Keap1 R470C突變體在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出增強(qiáng)的SOX9結(jié)合，而在促進(jìn)SOX9多聚泛素化和降解方面表現(xiàn)出與Keap1野生型類似的行為?？傊伟┲蠯eap1體細(xì)胞突變導(dǎo)致SOX9蛋白水平升高，導(dǎo)致了肺癌的預(yù)后差以及惡性進(jìn)展（圖1e）。

SOX9是Nrf2的靶基因，SOX9的穩(wěn)定性也能受到Keap1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)。Schmidlin等［74］研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露（誘導(dǎo)p62將Keap1隔離而激活Nrf2）和Keap1功能缺失突變導(dǎo)致的Nrf2激活，上調(diào)了SOX9，進(jìn)而增加了非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移潛力。最近Nabeshima等［75］發(fā)現(xiàn)Keap1缺失促進(jìn)了K-ras/p53突變驅(qū)動(dòng)的膽管癌的進(jìn)展，雖然膽管癌中SOX9高表達(dá)，但其高表達(dá)的背后是受到轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯后修飾調(diào)控的仍不為所知?？傊?，SOX9與Nrf2之間的串?dāng)_，體現(xiàn)了癌癥發(fā)生過(guò)程的復(fù)雜調(diào)節(jié)。然而SOX9不僅是癌基因，在宮頸癌［76］、黑色素瘤［77］和膀胱癌［78］中是抑癌的，在此等人類癌癥中Keap1介導(dǎo)的SOX9失調(diào)可能起相反作用。Keap1是抑癌還是促癌取似乎決于癌癥的特異性。

5 Keap1與疾病的關(guān)系

5.1 通過(guò)Keap1-Nrf2通路影響疾病發(fā)生

5.1.1 腎臟疾病

由于氧化應(yīng)激是腎臟疾病的主要致病和加重因素，Keap1-Nrf2系統(tǒng)被認(rèn)為是腎臟保護(hù)的治療靶點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，在大鼠慢性腎病（CKD）模型中，Keap1抑制劑CDDO-9,11-dihydro-trifluoroethyl amide（CDDO-dhTFEA，也稱為dh404）在高劑量的情況下，即Keap1少量存在時(shí)，能通過(guò)激活NFκB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，加重腎臟纖維化，印證了上文Keap1對(duì)NF-κB的抑制作用。而低劑量的CDDO-dhTFEA，即Keap1大量存在時(shí)，Nrf2被異常激活，但沒(méi)有NF-κB響應(yīng)，則能改善腎臟纖維化。因此激活Nrf2對(duì)腎病的治療有重要意義。然而，必須考慮到Keap1抑制劑可能會(huì)影響Nrf2以外的Keap1靶點(diǎn)活性。最后，來(lái)自正在進(jìn)行的研究項(xiàng)目數(shù)據(jù)表明，Keap1抑制劑可以改善3期CKD和T2DM（2型糖尿?。┗颊叩哪I小球?yàn)V過(guò)率，而無(wú)安全隱患。因此，Keap1-Nrf2系統(tǒng)是腎臟疾病最有希望的治療靶點(diǎn)之一，雖然Keap1抑制劑在不同腎病中發(fā)揮作用不一，但毋庸置疑它有望是腎臟關(guān)鍵療法的一部分，并且在腎病中Keap1存在Nrf2異常激活的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［79］。

Keap1-Nrf2通路在腎毒病中也發(fā)揮重要作用。已知慶大霉素（GM）可有效治療嚴(yán)重的甚至危及生命的感染。然而，注射GM后腎功能會(huì)受損，氧化/抗氧化失衡，所以GM的腎毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，地奧司明（DS）是一種具有廣泛生物活性的黃酮類化合物，具有十分重要的生物學(xué)意義。GM顯著降低了腎細(xì)胞Nrf2、谷氨酰半胱氨酸合成酶（GCLC）、血紅素氧化酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶3（SOD-3）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）的表達(dá)，但上調(diào)了Keap1的表達(dá)。相反，DS給藥可顯著減輕GM誘導(dǎo)的腎功能障礙，恢復(fù)腎臟氧化/抗氧化狀態(tài)。此外，DS和GM聯(lián)合處理顯著增強(qiáng)Nrf2、GCLC、HO-1、SOD3、AKT和p-AKT的表達(dá)，同時(shí)Keap1下調(diào)。組織病理學(xué)檢查也顯示，DS顯著減少GM誘導(dǎo)的組織損傷。不言而喻，通過(guò)抑制Keap1，激活Nrf2系統(tǒng)能起到保護(hù)腎臟的作用。綜上所知，DS能通過(guò)靶向Keap1-Nrf2-ARE、AKT和PPAR信號(hào)通路，有望成為GM腎毒性的保護(hù)劑［80］。

5.1.2 肝臟疾病

研究表明，氧化應(yīng)激在肝臟疾病的病理機(jī)制中起著重要作用，故氧化應(yīng)激關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的正常表達(dá)與否十分關(guān)鍵。在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞中，HBV病毒一方面能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，另一方面能夠通過(guò)激活Nrf2-ARE通路，使Nrf2下游的抗氧化基因大量表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的細(xì)胞保護(hù)作用。在非酒精性脂肪性肝炎的小鼠動(dòng)物模型中，姜黃素治療能使小鼠肝臟損傷的程度明顯緩解，其機(jī)制可能就是姜黃素通過(guò)激活Nrf2而使其下游抗氧化酶表達(dá)量升高，繼而抑制氧化應(yīng)激。同理，在小鼠肝纖維化動(dòng)物模型中，甘草次酸通過(guò)上調(diào)Nrf2的表達(dá)，繼而使Nrf2下游的抗氧化酶基因表達(dá)增加，發(fā)揮保護(hù)作用，而在Nrf2缺乏小鼠中肝臟的纖維化及炎性反應(yīng)程度卻進(jìn)一步加重，說(shuō)明Nrf2在改善肝臟纖維化方面起一定作用。在肝臟缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，相比野生型小鼠，Nrf2缺乏小鼠在15 d-PGJ2（15-脫氧-12,14-前列腺素J2）治療后，肝損傷的程度雖不能得到緩解，但該藥物可以通過(guò)激活Nrf2-ARE通路而有效降低肝臟缺血再灌注損傷的程度。以上研究表明，氧化應(yīng)激廣泛存在于多種肝臟疾病中，且通過(guò)Nrf2再激活抗氧化系統(tǒng)能夠?qū)Ω渭?xì)胞起到保護(hù)作用［81］。

5.1.3 炎癥

炎癥可以定義為對(duì)有害的內(nèi)源性和外源性刺激的保護(hù)性免疫反應(yīng)。然而，長(zhǎng)期或自身免疫性炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體各種有害狀態(tài)。炎癥相關(guān)分子被鑒定為Nrf2的內(nèi)源性誘導(dǎo)因子。例如，15 d-PGJ2是COX-2（環(huán)氧合酶2）途徑的最終產(chǎn)物之一，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，并具有強(qiáng)大的抗炎作用。15d-PGJ2通過(guò)與Keap1相互作用，強(qiáng)烈激活Nrf2并抑制炎癥性轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB。然后，一方面，Nrf2通過(guò)ROS介導(dǎo)抑制炎癥。ROS在炎癥性疾病的進(jìn)展中起重要作用，但過(guò)量的ROS會(huì)對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA造成損傷，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。受損的細(xì)胞釋放DAMP（損傷相關(guān)分子模式），如熱休克蛋白和高遷移率族蛋白B1，它們激活參與先天免疫反應(yīng)的巨噬細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞再釋放出各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，誘導(dǎo)一系列炎癥反應(yīng)，因此，Nrf2的抗氧化功能有助于消除過(guò)多的ROS和隨后的炎癥反應(yīng)。另一方面，Nrf2除了通過(guò)消除ROS發(fā)揮抗炎作用，還可通過(guò)ROS非依賴機(jī)制抑制炎癥。Nrf2以ROS介導(dǎo)的方式直接抑制巨噬細(xì)胞中IL-6、IL-1b這些促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄，Nrf2結(jié)合到這些促炎細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)域內(nèi)，并抑制RNA聚合酶II向這些位點(diǎn)的募集。且重要的是，促炎性細(xì)胞因子基因的抑制發(fā)生在早期階段，這表明Nrf2能迅速解決炎癥。綜上表明，Keap1抑制Nrf2激活能抑制炎癥的發(fā)生發(fā)展。在處理炎癥時(shí)，幾類化合物可主動(dòng)破壞Keap1-Nrf2相互作用并激活Nrf2，如三萜類化合物是齊墩果酸的衍生物，這些小分子通過(guò)與Keap1的C151共價(jià)結(jié)合來(lái)阻止Nrf2降解，類似于異硫氰酸鹽，天然三萜類化合物由于具有抗炎作用而被用于中醫(yī)，并且以多種形式存在，如油酸和熊烷［82］。

5.1.4 少肌癥

骨骼肌健康對(duì)于預(yù)防各種與年齡有關(guān)的疾病很重要。骨骼肌質(zhì)量的喪失，即肌肉減少癥，是老年人身體殘疾、生活質(zhì)量差和慢性疾病的基礎(chǔ)，而Keap1-Nrf2系統(tǒng)在此疾病中有關(guān)鍵作用。已經(jīng)有研究證明，Keap1抑制在骨骼肌中對(duì)耐力的有益作用，考慮到Keap1和Nrf2之間的關(guān)系非常嚴(yán)格，我們認(rèn)為Keap1抑制的有益作用主要?dú)w因于Nrf2的激活。為了確定骨骼肌Nrf2對(duì)運(yùn)動(dòng)能力的貢獻(xiàn)，在骨骼肌中對(duì)Nrf2的負(fù)調(diào)節(jié)劑Keap1進(jìn)行特異性抑制，并檢查Nrf2途徑激活的細(xì)胞自主和非細(xì)胞自主效應(yīng)。

Keap1被破壞引起骨骼肌特異性Nrf2活化，能增強(qiáng)脂肪酸（FAs）的動(dòng)員和氧化、增加骨骼肌質(zhì)量和運(yùn)動(dòng)能力。Keap1抑制能增強(qiáng)FAs的β氧化作用，增加線粒體活性而不是數(shù)量來(lái)發(fā)揮細(xì)胞自主效應(yīng)。為了確定Nrf2的遺傳激活是否能重現(xiàn)這種效果，發(fā)現(xiàn)在Keap1敲降（Keap1-KD）小鼠骨骼肌中Keap1蛋白和mRNA的表達(dá)降低。而Nqo1是Nrf2的典型靶基因之一，被確定在Keap1-KD骨骼肌中被上調(diào)，這表明Nrf2途徑在Keap1-KD骨骼肌中被激活；而Nrf2缺乏的小鼠確實(shí)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)耐力受損。綜上可知，由于全身性Keap1抑制而引起的Nrf2途徑活化增加了運(yùn)動(dòng)能力。

還有，眾所周知，運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的肌肉收縮會(huì)產(chǎn)生ROS。盡管尚不清楚控制ROS產(chǎn)生的確切機(jī)制，但線粒體被認(rèn)為是ROS的主要來(lái)源，尤其是通過(guò)電子傳遞鏈復(fù)合物I和III。雖然長(zhǎng)時(shí)間或高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的ROS，導(dǎo)致骨骼肌氧化損傷，但最近的研究表明，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的ROS在生理上起著重要作用，并是骨骼肌適應(yīng)的重要介體。肌肉收縮和運(yùn)動(dòng)增加Nrf2蛋白水平和活性，而Nrf2的激活能抑制運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，因此我們認(rèn)為Nrf2的最佳激活平衡了維持生理信號(hào)所需的有益ROS水平和限制了有害ROS水平，保護(hù)組織免受氧化損傷。這些結(jié)果表明了Nrf2可以進(jìn)行多峰代謝調(diào)節(jié)，從而增加運(yùn)動(dòng)耐力。我們建議適當(dāng)?shù)腘rf2激活可用于抗衰弱干預(yù)。

總之，骨骼肌中的Nrf2激活增加了慢速氧化性肌纖維類型并改善了運(yùn)動(dòng)耐力，而負(fù)責(zé)耐力運(yùn)動(dòng)的慢速氧化肌纖維功能對(duì)于預(yù)防老年人的肌肉減少癥和體弱尤為關(guān)鍵；并且那些具有Nrf2途徑激活的骨骼肌表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)耐力的增強(qiáng)和脂肪酸β氧化過(guò)程的增加。其機(jī)制就是骨骼肌中的Nrf2激活通過(guò)體液和/或神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)與脂肪組織的通訊，并促進(jìn)脂肪酸作為能源的利用，從而導(dǎo)致線粒體活性增加和運(yùn)動(dòng)過(guò)程中有效的能量產(chǎn)生，從而改善運(yùn)動(dòng)耐力。正如有些報(bào)道表明，Nrf2的全身激活可增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)能力，并最終有助于預(yù)防與年齡相關(guān)的肌肉減少癥和虛弱，但骨骼肌Nrf2的激活可減少骨骼肌質(zhì)量，表明Nrf2在參與骨骼肌生理學(xué)中的復(fù)雜性，即Nrf2在每個(gè)組織和器官中對(duì)全身運(yùn)動(dòng)能力的貢獻(xiàn)不同，這可作為未來(lái)解決此類疾病的一個(gè)重要方向［83］。

5.1.5 眼科疾病

正如上述所說(shuō)，研究已證實(shí)Nrf2對(duì)肝臟、腎臟和心臟細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時(shí)已用于癌癥的臨床治療。而現(xiàn)在越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化應(yīng)激藥物對(duì)多種眼球細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，印證了氧化應(yīng)激與多種眼科疾病的病理過(guò)程相關(guān)。Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞的防御保護(hù)中發(fā)揮了重要作用。以下討論，Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)，公認(rèn)的抗氧化應(yīng)激的重要通路，也是目前眼科研究的熱點(diǎn)之一。

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD），主要在55歲以上人群發(fā)病，是引起失明的最常見(jiàn)原因，它的發(fā)病是由多種因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果，其中氧化應(yīng)激對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細(xì)胞的損害作用是導(dǎo)致AMD發(fā)生發(fā)展的主要病理機(jī)制。RPE細(xì)胞的損傷歸因于細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的衰弱或ROS水平的增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Nrf2基因敲除小鼠表現(xiàn)出與人類AMD相似的病理改變，如氧化損傷、過(guò)度自噬和炎癥反應(yīng)等，說(shuō)明Nrf2信號(hào)通路的缺失將增加視網(wǎng)膜年齡相關(guān)性疾病的易感性；而當(dāng)敲除Nrf2的負(fù)性調(diào)控因子Keap1時(shí)，卻能部分恢復(fù)大齡鼠RPE細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路活性，說(shuō)明細(xì)胞中Keap1抑制導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2及其下游信號(hào)分子的激活可有效提高RPE細(xì)胞抗氧化損傷能力。綜上所述，Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路能保護(hù)年齡相關(guān)性的視網(wǎng)膜損傷如AMD，并有可能作為治療AMD的靶點(diǎn)，同時(shí)，RPE細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)對(duì)AMD進(jìn)展有無(wú)影響也值得進(jìn)一步研究。

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)證之一，不僅是糖尿病性微血管病變中最重要的表現(xiàn)，也是一種具有特異性改變的眼底病變。它是導(dǎo)致發(fā)達(dá)國(guó)家成人致盲的常見(jiàn)原因，但其導(dǎo)致視力障礙和喪失的機(jī)制尚未完全闡明，因而引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。我們猜測(cè)，高血糖能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加，而ROS又能啟動(dòng)血糖異常代謝途徑，各種代謝產(chǎn)物又不斷將氧化應(yīng)激放大，導(dǎo)致更多的自由基生成，激發(fā)了更大的氧化應(yīng)激，最終引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及周細(xì)胞凋亡，血-視網(wǎng)膜屏障破壞以及視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在Nrf2缺乏的糖尿病小鼠中，過(guò)氧化物表達(dá)、引起DR的重要炎癥因子——腫瘤壞死因子-α都明顯高于Nrf2存在的糖尿病小鼠；而視網(wǎng)膜中抗氧化蛋白GSH水平卻明顯低于野生型糖尿病小鼠?？傊C實(shí)了Nrf2信號(hào)通路在延緩DR發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

視神經(jīng)（optic nerve）損傷，又稱之為外傷性視神經(jīng)炎病變（traumatic optic neuropathy），是顱腦損傷中常見(jiàn)和嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，約占顱腦外傷的2%～5%。眾多實(shí)驗(yàn)已證明，Nrf2介導(dǎo)的信號(hào)通路能保護(hù)氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)退行性病變。體內(nèi)及體外研究均發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)效梔子素衍生物能通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路減少氧化應(yīng)激損傷所致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞死亡，抗氧化劑R-α硫辛酸通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)下游因子HO-1的表達(dá)，從而保護(hù)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷?？傊险{(diào)Nrf2信號(hào)通路能減輕視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷。

還有葡萄膜炎、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等多種眼科疾病都表明了Keap1-Nrf2系統(tǒng)在其中抗氧化應(yīng)激的作用，但其在多種眼科疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中究竟扮演了什么角色，還有待于進(jìn)一步研究。目前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已顯示，多種Nrf2激動(dòng)劑對(duì)多種眼細(xì)胞具有保護(hù)作用，因此Keap1-Nrf2-ARE通路可作為治療眼科疾病的一個(gè)新的靶點(diǎn)，預(yù)期對(duì)臨床眼科疾病的治療發(fā)揮重要作用［84］。

5.1.6 神經(jīng)退行性疾病

事實(shí)表明，Keap1-Nrf2系統(tǒng)在神經(jīng)退行性疾病中也發(fā)揮重要作用。Keap1抑制、Nrf2激活對(duì)氧化應(yīng)激所致神經(jīng)退行性變的保護(hù)作用已經(jīng)得到了很好的研究：Nrf2轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)誘導(dǎo)多種細(xì)胞防御和解毒酶的表達(dá)，在神經(jīng)退行性疾病中起保護(hù)作用。Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)氧化應(yīng)激敏感。所以異常的Nrf2水平將導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，而氧化應(yīng)激又可導(dǎo)致異常蛋白質(zhì)聚集、小膠質(zhì)細(xì)胞活化和線粒體功能障礙等病理特征，這些病理過(guò)程將產(chǎn)生ROS，進(jìn)而脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA損傷。這些病理生理事件包括各種各樣的神經(jīng)退行性疾病，包括阿爾茨海默病（AD）、亨廷頓氏病（HD）、帕金森?。≒D）、缺血和中風(fēng)。a.帕金森?。≒D）。Keap1-Nrf2系統(tǒng)和癌基因DJ-1調(diào)控PD疾病的發(fā)生。DJ-1是一種氧化應(yīng)激傳感器基因，也是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。在正常氧化應(yīng)激條件下，DJ-1的表達(dá)增加，Nrf2依賴基因的表達(dá)正常，后通過(guò)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡幫助減少氧化應(yīng)激的發(fā)生；而在DJ-1基因缺陷的患者中，Nrf2依賴基因的表達(dá)減少，氧化應(yīng)激增加。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)不平衡時(shí)，即DJ-1過(guò)度的氧化也會(huì)使其功能喪失，從而導(dǎo)致PD的氧化應(yīng)激。這表明，功能失調(diào)的Nrf2水平與家族性PD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。DJ-1阻止Keap1與Nrf2相互作用，從而防止Nrf2的泛素化而保護(hù)神經(jīng)元免于氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡；在沒(méi)有DJ-1的情況下，Nrf2是不穩(wěn)定的，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在基礎(chǔ)條件和誘導(dǎo)條件下都會(huì)變遲鈍從而導(dǎo)致PD的發(fā)生發(fā)展。而多巴胺類似物6-羥基多巴胺（6-HAD）具有高度神經(jīng)毒性，被發(fā)現(xiàn)能夠激活Nrf2，進(jìn)而激活細(xì)胞防御機(jī)制，以防止氧化應(yīng)激。因此，6-HAD可作為Nrf2激活劑以成為PD的治療靶點(diǎn)，從而改善PD的病情。b.亨廷頓氏?。℉D）。研究表明，在HD的初級(jí)階段，Nrf2激動(dòng)劑通過(guò)Keap1-Nrf2-ARE系統(tǒng)過(guò)表達(dá)重要的細(xì)胞保護(hù)基因，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，這可能會(huì)保護(hù)由ROS引起的腦損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞中Keap1-Nrf2通路的激活加速了神經(jīng)元對(duì)非興奮性毒性谷氨酸的抵抗。因此，Nrf2的激活和過(guò)表達(dá)是治療HD的一個(gè)令人鼓舞的治療靶點(diǎn)。還有，在氧化應(yīng)激下，p62能通過(guò)直接競(jìng)爭(zhēng)使Nrf2與Keap1解離，隨后激活Nrf2并介導(dǎo)Keap1的自噬降解，從而在腦缺血損傷期間清除ROS，對(duì)預(yù)防氧化損傷和減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起著重要作用，所以抑制Keap1表達(dá)，促進(jìn)Nrf2激活也是一個(gè)重要的防治HD的切入點(diǎn)［85］。c.阿爾茨海默病。同樣地，Keap1-Nrf2系統(tǒng)也調(diào)控AD的發(fā)生。在AD患者的大腦中Nrf2顯著減少，這可能解釋了神經(jīng)元對(duì)神經(jīng)退行性疾病損傷易感性增加的原因。另一項(xiàng)研究顯示，DJ-1能穩(wěn)定功能失調(diào)的Nrf2，它通過(guò)阻止Keap1與Nrf2的聯(lián)系，導(dǎo)致Keap1受蛋白酶體降解而Nrf2穩(wěn)定表達(dá)。有研究利用果蠅模型，確定了Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)因子Keap1抑制是挽救AD相關(guān)Nrf2缺陷和隨后預(yù)防神經(jīng)元變性的有效靶點(diǎn)。此外，有研究還發(fā)現(xiàn)了一種新的化合物——1，4-二苯基-1，2，3-三唑化合物，它直接阻斷了Nrf2和Keap1之間的結(jié)合，從而可以減弱AD在小鼠神經(jīng)元中的毒性作用。因此，直接的Keap1-Nrf2干擾因子對(duì)神經(jīng)退行性疾病中觀察到的Nrf2活性缺陷具有針對(duì)性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)發(fā)此類化合物可以作為潛在的新藥，來(lái)預(yù)防神經(jīng)衰弱和其他神經(jīng)退行性疾?。?6］。還有某些藥物或慢病毒也可導(dǎo)致Nrf2表達(dá)增加，使Nrf2增加抗氧化基因的表達(dá)，改善活性氧積累的肽類，即其也可以作為AD的治療靶點(diǎn)，從而改善AD的病情。最后，有研究提供了第一個(gè)體內(nèi)證據(jù)，即對(duì)Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)因子Keap1的特異性抑制，通過(guò)與Nrf2激活相關(guān)，可以防止AD引起的神經(jīng)元毒性?？偟膩?lái)說(shuō)，我們特別強(qiáng)調(diào)Keap1是AD中Nrf2活化的有效靶點(diǎn)，并支持進(jìn)一步研究Keap1直接抑制劑預(yù)防體內(nèi)神經(jīng)退行性變［86］。

5.1.7 心血管疾病

Keap1-Nrf2系統(tǒng)在心血管疾病中也起到了非常重要的作用。在心肌肥大的早期，Keap1釋放Nrf2后易位至細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)許多抗氧化基因，例如SOD、CAT和GPx等的轉(zhuǎn)錄，對(duì)心臟中的病理性氧化應(yīng)激進(jìn)行廣泛的細(xì)胞防御：這表明早期Keap1-Nrf2系統(tǒng)發(fā)揮積極作用。然而，到晚期階段，前期Nrf2的過(guò)度激活導(dǎo)致Nrf2表達(dá)下調(diào)，無(wú)法維持心肌細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，因此，心臟持續(xù)的氧化應(yīng)激將誘導(dǎo)心臟重塑，并最終導(dǎo)致心力衰竭，這表明晚期Keap1-Nrf2系統(tǒng)發(fā)揮消極作用。還有研究表明，4-羥基壬烯酸可以通過(guò)形成加合物直接誘導(dǎo)Keap1的構(gòu)象變化；或通過(guò)增加線粒體ROS的產(chǎn)生間接誘導(dǎo)Keap1的構(gòu)象變化激活Nrf2，在活化抗氧化酶的基礎(chǔ)上，刺激GSH生物合成，進(jìn)一步保護(hù)心臟，但4-羥基壬烯酸誘導(dǎo)Nrf2核聚集的機(jī)制仍有待闡明［87］。

5.1.8 缺血/再灌注損傷

缺血性心臟?。↖HD）是全球范圍內(nèi)死亡和殘疾的主要原因，據(jù)估計(jì)每年全球約有740萬(wàn)人死亡。盡管通常以經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)為代表的心肌再灌注治療已成為IHD治療的主流方法，但缺血再灌注（IR）損傷仍然是一個(gè)尚未解決的問(wèn)題，主要影響再灌注治療的有效性。因此，如何有效地預(yù)防心肌IR損傷已引起研究人員越來(lái)越多的興趣。盡管尚未完全闡明心肌IR損傷的機(jī)制，但氧化應(yīng)激和炎癥已被證明是造成心肌IR損傷的原因，所以Nrf2是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。在生理狀態(tài)下，Nrf2通過(guò)與作為Nrf2生理抑制劑的Keap1結(jié)合而主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。然而，在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2通過(guò)與Keap1分離而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，隨后激活了抗氧化基因如HO-1的轉(zhuǎn)錄，可保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激和炎癥誘導(dǎo)的損傷。還有，經(jīng)子苷誘導(dǎo)的預(yù)處理可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激來(lái)減輕心肌IR損傷。此外，Nrf2的激活能抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的經(jīng)由ROS在腦IR上的損傷。因此，Nrf2被認(rèn)為是心肌IR損傷的治療靶標(biāo)。

據(jù)報(bào)道，Sweroside（一種從擬南芥（Swertia pseudochinensisHara）中提取的secrididoid葡萄糖苷）具有抗氧化和抗炎活性從而減輕IR帶來(lái)的機(jī)體損傷。它可能與Keap1相互作用來(lái)發(fā)揮作用。已確定經(jīng)Sweroside處理后，Keap1的表達(dá)水平顯著降低了51%；而Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)降低了50%，但在細(xì)胞核中的表達(dá)水平幾乎提高了兩倍，這支持了Sweroside抑制Keap1表達(dá)并促進(jìn)Nrf2核易位的假說(shuō)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，一些小分子可通過(guò)中斷Keap1-Nrf2的PPI導(dǎo)致Nrf2活性升高?？紤]到在分子對(duì)接模型中預(yù)測(cè)了Keap1和Sweroside之間的相互作用，推斷Sweroside通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Keap1，進(jìn)而促進(jìn)Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合物中逃逸而被激活。此外，證實(shí)了Sweroside對(duì)HO-1和ROS的作用可以通過(guò)抑制Nrf2得以挽救，這進(jìn)一步證明了其抗氧化作用是Nrf2依賴性的。綜上，可以此為方向?qū)ふ夷芴禺愋园邢騅eap1抑制而激活Nrf2的藥物來(lái)防治IR［88］。

5.2 Keap1與癌癥

文獻(xiàn)表明，Keap1是一種腫瘤抑制因子，也是一種重要腫瘤蛋白。Keap1招募底物并靶向泛素化和蛋白酶體或自噬降解，從而保持底物的低水平。而癌癥中Keap1介導(dǎo)的泛素化降解功能失調(diào)，這往往是由于癌癥中存在的Keap1體細(xì)胞突變導(dǎo)致的。例如在肺癌中Keap1體細(xì)胞突變導(dǎo)致Nrf2或IKKβ或SOX9蛋白水平升高，并通過(guò)不同的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而導(dǎo)致肺癌的發(fā)生和惡性進(jìn)展。此外，Keap1點(diǎn)突變?cè)谖赴?1.1%）、肝癌（2.8%）、結(jié)腸直腸癌（7.8%）、前列腺癌（1.3%）、膽囊癌（30.7%）、卵巢癌（37%）、膠質(zhì)瘤（1.7%）、頭頸癌（42%）和透明腎細(xì)胞癌（4.7%）等多種人類癌癥中被發(fā)現(xiàn)［89］，但大多數(shù)這些突變的功能性后果和機(jī)制仍然未知。也有研究確定了Keap1突變的3種不同的功能類別：a.最有可能代表乘客事件的沉默突變；b.亞型突變；c.功能性死亡蛋白質(zhì)［90］。提示了Keap1突變功能的多樣性。為此，我們將癌癥中的Keap1突變進(jìn)行了歸納（表2），并在下文詳細(xì)介紹了Keap1突變導(dǎo)致肺癌發(fā)生發(fā)展的詳細(xì)機(jī)制。

Table 2 Somatic mutations of Keap1 in various human cancers表2各類人類癌癥中Keap1的體細(xì)胞突變

有研究證實(shí)，Keap1能夠抑制NSCLC的轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/S100P信號(hào)通路而發(fā)揮作用。它可以作為NSCLC中預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展和監(jiān)測(cè)治療效果的分子標(biāo)志物。這些研究證明，Keap1是一種抑癌基因，由于它的缺失導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在多種癌癥中報(bào)道了Keap1基因存在突變體。最初是在人肺腺癌細(xì)胞系中鑒定出了Keap1基因的突變體，在Keap1的Kelch/DGR結(jié)構(gòu)域中，甘氨酸被半胱氨酸所取代。此后，肺癌組織中也發(fā)現(xiàn)Keap1基因的Kelch或IVR結(jié)構(gòu)域中存在多個(gè)突變體。在肝癌和膽囊癌中也檢測(cè)到Keap1的突變能夠?qū)е翹rf2的過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)Ⅱ期解毒酶和抗氧化蛋白的激活。越來(lái)越多的研究證明，Keap1在多種癌癥中發(fā)生突變，并且Keap1不同的表達(dá)狀態(tài)對(duì)腫瘤的作用也不相同。例如，在乳腺癌基因組研究中Keap1 N端結(jié)構(gòu)域的突變（C23Y）消除其對(duì)Nrf2的抑制作用，有利于癌細(xì)胞存活和治療耐藥。除了這些突變體之外，Keap1基因突變也已在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和肺乳頭狀腺癌細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)［104］。以下詳細(xì)介紹一下Keap1與肺癌的關(guān)系。

Keap1缺失促進(jìn)KRAS驅(qū)動(dòng)的肺癌并導(dǎo)致對(duì)谷氨酰胺分解的依賴。大約20%的KRAS突變型肺腺癌（LUAD）腫瘤攜帶編碼Keap1基因功能缺失突變。Keap1的高頻率突變提示，氧化應(yīng)激反應(yīng)在肺腫瘤發(fā)生中起重要作用。實(shí)驗(yàn)顯示，在KRAS驅(qū)動(dòng)的LUAD小鼠模型中使用CRISPR-Cas9基因敲除Keap1的方法，發(fā)現(xiàn)Keap1缺失對(duì)肺癌進(jìn)展的影響：在小鼠中，Keap1的缺失會(huì)使Nrf2過(guò)度活躍，并促進(jìn)KRAS驅(qū)動(dòng)的LUAD。通過(guò)基于CRISPRCas9的基因篩選和代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Keap1缺失或Nrf2突變型癌癥依賴于谷氨酰胺分解的增加，這一特性可通過(guò)谷氨酰胺酶的藥理抑制進(jìn)行治療［39］。

受體酪氨酸激酶（RTK）-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路在肺癌和其他癌癥的發(fā)展中起著重要作用，并且該通路的多個(gè)節(jié)點(diǎn)經(jīng)常發(fā)生突變或拷貝數(shù)改變。靶向RTK-MAPK通路的抑制劑被認(rèn)為能導(dǎo)致肺癌和其他癌癥的臨床反應(yīng)。靶向RTKMAPK途徑的抑制劑治療，可增加Keap1完整細(xì)胞中的ROS，而Keap1的丟失則消除了這種增加效應(yīng)。此外，Keap1的缺失還能增加Nrf2的活性，而后通過(guò)增加谷胱甘肽的合成減少ROS的產(chǎn)生，改變細(xì)胞代謝，使細(xì)胞在缺乏MAPK信號(hào)的情況下增殖。總結(jié)來(lái)說(shuō)：在多種靶向RTK-MAPK途徑的抑制劑存在下，Keap1-Nrf2通路的改變可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生存，RTK-MAPK途徑抑制劑通過(guò)阻斷MAPK信號(hào)并誘導(dǎo)ROS減少，使Nrf2穩(wěn)定至低水平，但Keap1缺失或Nrf2過(guò)表達(dá)足以在MAPK信號(hào)缺失的情況下恢復(fù)細(xì)胞增殖。然而，此前有研究表明，Nrf2對(duì)ROS的解毒和對(duì)氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié)有助于腫瘤的發(fā)生。最近也發(fā)現(xiàn)Nrf2是一種致癌基因，除了它在調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)中的作用外，Nrf2還可以調(diào)節(jié)許多代謝酶的表達(dá)，將葡萄糖和谷氨酰胺重新定向到支持增殖的合成代謝途徑中，以及控制絲氨酸和甘氨酸生物合成以支持谷胱甘肽和核苷酸的生產(chǎn)。因此在Keap1缺失時(shí)，增加Nrf2的表達(dá)可以通過(guò)降低ROS和調(diào)節(jié)代謝途徑來(lái)增強(qiáng)對(duì)RTK-MAPK途徑抑制的抵抗力。Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)因子Keap1的缺失，調(diào)節(jié)肺癌BRAF、NRAS、KRAS、EGFR和ALK基因突變。在大約30%的肺鱗狀細(xì)胞癌和大約20%的肺腺癌中，Keap1-Nrf2通路中某些元素發(fā)生了基因改變。該途徑的改變可與RTK-Ras途徑的改變同時(shí)發(fā)生，盡管在肺癌的癌基因陰性亞群中，Keap1-Nrf2的改變更為豐富［105］。

6 調(diào)控和影響Keap1的因素

6.1 甲基化修飾對(duì)Keap1轉(zhuǎn)錄水平的影響

首先，Keap1功能在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)控。Keap1受到甲基化的啟動(dòng)子的直接調(diào)控。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌中，Keap1基因的啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化而低表達(dá)，且Keap1啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)CpG島高甲基化在乳腺癌、前列腺癌及結(jié)腸癌等腫瘤中直接或間接促進(jìn)了化療耐藥，從而證實(shí)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路與多重耐藥機(jī)制相關(guān)聯(lián)［9］（圖1f）。

6.2 幾種微小RNA對(duì)Keap1翻譯水平的影響

其次，Keap1功能在在翻譯水平受到調(diào)控。有研 究 發(fā) 現(xiàn)，幾 種 微 小RNA（microRNAs，miRNAs）調(diào)節(jié)Keap1在人類疾病中的表達(dá)。miRNAs是一種識(shí)別特定mRNAs 3'非翻譯區(qū)域（3'untranslated regions，3'UTR）的小非編碼分子，通過(guò)翻譯阻斷或強(qiáng)制降解來(lái)負(fù)調(diào)控mRNA的豐度。首先，檢索TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，Keap1 mRNA的3'UTR上有miR-223結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-223模擬轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的內(nèi)源性miR-223表達(dá)上調(diào)，并觀察到Keap1蛋白質(zhì)水平的降低；而在miR-223抑制劑轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中觀察到miR-223表達(dá)的顯著降低和Keap1蛋白質(zhì)水平的增加。這些結(jié)果表明，miR-223的表達(dá)負(fù)調(diào)控HepG2細(xì)胞中Keap1的蛋白質(zhì)水平?？傊?，Keap1受miR-223靶向調(diào)控，而且Keap1的負(fù)調(diào)控因子miR-223在T2DM肝損傷中是一個(gè)有吸引力的治療靶點(diǎn)［106］。另一項(xiàng)研究表明，果糖誘導(dǎo)miR-200a低表達(dá)而上調(diào)Keap1，從而阻斷Nrf2抗氧化途徑，增強(qiáng)ROS驅(qū)動(dòng)的TXNIP，激活NLRP3內(nèi)酰胺酶，干擾脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激、損傷和脂質(zhì)沉積。而Polydatin增強(qiáng)miR-200a表達(dá)以控制Keap1-Nrf2通路是治療果糖相關(guān)性肝損傷和脂質(zhì)沉積的一種治療策略［107］。此外，在食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中miR-432-3p通過(guò)抑制Keap1 mRNA的翻譯而正向調(diào)節(jié)Nrf2的活性［108］（圖1f）。

6.3 Keap1蛋白翻譯后水平修飾的調(diào)控

最后，Keap1蛋白受翻譯后修飾水平的調(diào)控。功能研究表明，在多種癌癥細(xì)胞模型內(nèi)，TRIM25正調(diào)控Keap1含量，即其通過(guò)直接靶向Keap1進(jìn)行泛素化和降解，激活Nrf2信號(hào)并降低ROS水平，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活［109］（圖1f）。以下還有幾種經(jīng)典的對(duì)Keap1的翻譯后修飾。

6.3.1 氧化修飾（oxidation）

活細(xì)胞在氧化和還原之間保持平衡，這種氧化還原平衡的擾動(dòng)被認(rèn)為是導(dǎo)致多種疾病的原因。調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)的最新嘗試集中在親電試劑（EPs）上，它們可激活有效的細(xì)胞防御系統(tǒng)抵抗氧化應(yīng)激。這種方法的一個(gè)例子是鼠尾草酸（CA）和鼠尾草酚（CS），這是在迷迭香（Rosmarinus officinalis）中發(fā)現(xiàn)的化合物。重要的是，CA和CS本身不是親電的，而是響應(yīng)氧化而變成親電的，然后激活Keap1/Nrf2/ARE轉(zhuǎn)錄途徑來(lái)合成內(nèi)源性抗氧化劑“2期”酶［110］。

正常狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與Keap1結(jié)合并處于活性相對(duì)抑制狀態(tài)。而在外界氧化應(yīng)激刺激下（如ROS或RNS），解偶聯(lián)后的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE相結(jié)合，啟動(dòng)下游的抗氧化酶，這些酶包括超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、醌氧化還原酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）、過(guò) 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）等。現(xiàn)在，有越來(lái)越多的天然抗氧化劑被發(fā)現(xiàn)，其具有抵抗細(xì)胞內(nèi)氧化過(guò)度的情況，如白藜蘆醇、姜黃素、原花青素、槲皮素、茶多酚等［111］。在COPD患者中，長(zhǎng)期受到煙草中自由基和化學(xué)物質(zhì)刺激時(shí)，會(huì)引起Keap1構(gòu)象的改變或者由高度活性的氧化物直接促使Nrf2被磷酸化，導(dǎo)致Nrf2與Keap1解離而活化，活化的Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)ARE下游的抗氧化蛋白或促抗氧化蛋白合成酶等基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以抵抗內(nèi)外界的有害刺激。

除了通過(guò)氧化調(diào)節(jié)Keap1，在某些化學(xué)和氧化應(yīng)激條件下，Keap1本身可以通過(guò)修飾其中心連接域而使自身多聚泛素化。此外，在壓力應(yīng)激條件下，Nrf2的DLG基序可以從Keap1上斷開(kāi)，允許多泛素結(jié)合蛋白p62的結(jié)合，進(jìn)入自噬介導(dǎo)的溶酶體途徑降解。

6.3.2 糖基化修飾（glycosylation）

O-連接N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）是一種動(dòng)態(tài)翻譯后修飾（PTM），能可逆性修飾數(shù)千種核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白的絲氨酸和蘇氨酸殘基。在哺乳動(dòng)物中，O-GlcNAc由O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT）添加，并由O-GlcNAc酶（OGA）去除。異常的O-GlcN?；c各種人類疾病，特別是癌癥有關(guān)。例如，許多癌蛋白（如Myc、Akt）和腫瘤抑制物（如p53、AMPK）被O-GlcNAc?；?，從而影響致癌信號(hào)和治療反應(yīng)。

OGT抑制的許多轉(zhuǎn)錄效應(yīng)受氧化還原應(yīng)激耐受的主要調(diào)節(jié)因子Nrf2的激活。此外，我們發(fā)現(xiàn)在多個(gè)腫瘤表達(dá)數(shù)據(jù)中，低OGT活性的特征與Nrf2激活密切相關(guān)，即OGT抑制激活Nrf2依賴的轉(zhuǎn)錄程序。在這些信息的指導(dǎo)下，我們確定Keap1、Nrf2的主要負(fù)調(diào)節(jié)因子，是OGT的直接底物。

為了闡明O-GlcNAc酰化對(duì)Keap1的功能效應(yīng)，經(jīng)過(guò)對(duì)純化的Keap1進(jìn)行基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，確定了11個(gè)候選O-GlcN?；稽c(diǎn)：4個(gè)假定的O-GlcNAc位點(diǎn)（S102、S103、S104和S166）位于BTB結(jié)構(gòu)域的α螺旋內(nèi)；另外6個(gè)潛在的O-GlcNAc位 點(diǎn)（T388、S390、S391、T400、S404和S410）位于第二個(gè)Kelch基序的β鏈中，而最終候選位點(diǎn)（S533）位于第五個(gè)Kelch基序中。我們通過(guò)Nrf2活性的轉(zhuǎn)錄和ROS讀數(shù)判斷，Keap1在S104處的O-GlcNAc?；瞧浣閷?dǎo)Nrf2泛素化和蛋白酶體破壞的能力所必需的，并且不可糖基化的S104A突變體Keap1賦予Nrf2依賴性抵抗erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，但S104糖基化不是Keap1二聚所必需的。文獻(xiàn)表明，OGT在非應(yīng)激條件下與Keap1相互作用并組成糖基化，后抑制OGT降低Keap1 O-GlcNAc?；Ｔ谠S多人類腫瘤中，Nrf2通路被不適當(dāng)?shù)丶せ?，賦予腫瘤生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和治療抗性?？赡芡ㄟ^(guò)Keap1糖基化的藥理作用抑制Nrf2信號(hào)，從而使癌細(xì)胞對(duì)化療或放療敏感。有趣的是，O-GlcNAc水平和Nrf2活性隨葡萄糖波動(dòng)而變化，即葡萄糖饑餓會(huì)復(fù)制OGT抑制，導(dǎo)致Keap1去糖基化，減少Keap1-Cul3相互作用，并誘導(dǎo)Nrf2通路，所以通過(guò)小分子OGA拮抗劑對(duì)Keap1去糖基化的藥理學(xué)抑制，可以阻止癌細(xì)胞中葡萄糖饑餓誘導(dǎo)的Nrf2。表明Keap1 O-GlcNAc?；瘜I(yíng)養(yǎng)感應(yīng)與下游脅迫抗性聯(lián)系起來(lái)，因此，通過(guò)Keap1 OGlcNAc?；刂芅rf2信號(hào)可能具有病理生理意義，尤其是在灌注不良、低血糖/缺氧的實(shí)體瘤中。

Keap1通過(guò)其BTB結(jié)構(gòu)域和部分中間區(qū)結(jié)構(gòu)域與Cul3結(jié)合，而Keap1 Kelch基序與底物相互作用。其上S104的O-GlcNAc?；赏ㄟ^(guò)增強(qiáng)Keap1-Cul3結(jié)合、優(yōu)化Keap1構(gòu)象或兩者促進(jìn)與Cul3的生產(chǎn)性相互作用及其底物的有效泛素化。一些研究表明，IKKβ也是一個(gè)靶點(diǎn)。因此，在未來(lái)的研究中確定IKKβ或其他Keap1底物是否也在對(duì)OGT抑制的反應(yīng)中積累將是有趣的。此外，雖然Keap1 Kelch結(jié)構(gòu)域上的候選O-GlcNAc位點(diǎn)對(duì)Nrf2調(diào)節(jié)沒(méi)有顯著影響，但它們可能有助于其他Keap1-Cul3底物的結(jié)合，或者可能調(diào)節(jié)Keap1以響應(yīng)其他信號(hào)。未來(lái)的工作將集中于S104之后Keap1 O-GlcNAc位點(diǎn)的潛在功能后果和下游效應(yīng)［112-113］。

6.3.3 烷基化（alkylation）

在基礎(chǔ)條件下，胞質(zhì)蛋白Keap1與Nrf2導(dǎo)致其啟動(dòng)子區(qū)域包含ARE的細(xì)胞保護(hù)性基因的表達(dá)水平較低。文獻(xiàn)表明人Keap1的27個(gè)半胱氨酸巰基中的一個(gè)或多個(gè)烷基化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中Nrf2的泛素化和蛋白酶體介導(dǎo)的降解降低，Nrf2核積累，再通過(guò)ARE上調(diào)細(xì)胞保護(hù)性基因的表達(dá)從而增強(qiáng)抗氧化能力而保護(hù)細(xì)胞，并預(yù)防諸如癌癥的退化性疾病。因此，鑒定這些半胱氨酸殘基對(duì)特定親電試劑最具反應(yīng)性有助于闡明這種癌癥預(yù)防機(jī)制，也稱為化學(xué)預(yù)防。

酶的誘導(dǎo)，例如醌還原酶、葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶可以保護(hù)細(xì)胞免受致癌物的毒性和腫瘤作用。細(xì)胞核中Nrf2濃度的增加，會(huì)上調(diào)ARE并誘導(dǎo)這些化學(xué)預(yù)防酶的表達(dá)。經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知，某些親電子化合物能使Keap1烷基化，表明這些化合物具有上調(diào)ARE并誘導(dǎo)酶的能力［114］。如碳正離子、醌、醌甲基化物、醌亞胺、環(huán)氧化物和Michael受體之類的親電子試劑均能與Keap1反應(yīng)，并可能是癌癥化學(xué)預(yù)防劑，但應(yīng)預(yù)期這些化合物中反應(yīng)性最強(qiáng)的物質(zhì)會(huì)引起毒性（尤其是高劑量時(shí)）。因此，只有弱親電試劑（例如Michael受體黃腐酚）能在很寬的劑量范圍內(nèi)顯示出化學(xué)預(yù)防癌癥的活性，而不會(huì)顯示出毒性。因此，可以預(yù)期在生物系統(tǒng)中不與水或其他弱親核試劑反應(yīng)的情況下就可以使用這種癌癥化學(xué)預(yù)防劑。所以，可以將Keap1烷基化的天然產(chǎn)物（如黃腐酚）用于預(yù)防癌癥，它們可能通過(guò)誘導(dǎo)ARE調(diào)節(jié)的保護(hù)酶而起化學(xué)保護(hù)劑的作用。而在Keap1的各種半胱氨酸殘基中，C151對(duì)親電試劑的反應(yīng)性最強(qiáng)。且具有共軛二乙炔碳的泛醇可以共價(jià)修飾Keap1中的C151殘基，從而使Keap1失活，導(dǎo)致Nrf2-ARE途徑的激活［115-116］。

內(nèi)源性代謝物衣康酸（itaconate）最近已成為巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子，但其確切的作用機(jī)制仍不清楚。在小鼠和人巨噬細(xì)胞中，脂多糖（LPS）激活Nrf2所需的就是衣康酸。此外，衣康酸是一種抗炎代謝產(chǎn)物，可通過(guò)半胱氨酸殘基的烷基化直接修飾蛋白質(zhì)。如其烷基化了Keap1蛋白上的Cys殘基151、257、288、273和297，使Nrf2能夠增加具有抗氧化和抗炎能力的下游基因表達(dá)，即衣康酸的抗炎作用需要Nrf2的激活。一種新的細(xì)胞可滲透的衣康酸衍生物，4-辛基衣康酸酯（4-octyl itaconate）的使用，可保護(hù)體內(nèi)脂多糖誘導(dǎo)的致死性并減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

衣康酸是對(duì)LPS的反應(yīng)，部分通過(guò)I型干擾素（IFN）產(chǎn)生，并通過(guò)Nrf2激活和一種關(guān)鍵的促炎性調(diào)節(jié)劑琥珀酸脫氫酶（SDH）抑制作用來(lái)促進(jìn)抗炎程序。通過(guò)下調(diào)IFN應(yīng)答，進(jìn)一步限制了炎性基因的表達(dá)及其自身的產(chǎn)生。這有助于解釋為什么缺乏Nrf2的小鼠對(duì)敗血性休克更加敏感，即使在某些情況下也可以保護(hù)這些小鼠免于發(fā)炎。我們確定衣康酸是一種炎癥調(diào)節(jié)劑，可以通過(guò)新近鑒定的翻譯后修飾直接修飾蛋白質(zhì)，從而揭示了使用衣康酸治療炎性疾病的治療機(jī)會(huì)。此外，最近從衣康酸與維生素B12形成了一個(gè)有趣的聯(lián)系，這有必要在炎癥和免疫方面進(jìn)行進(jìn)一步的研究。進(jìn)一步了解衣康酸酯作為I型IFN的抗炎代謝產(chǎn)物和調(diào)節(jié)劑的作用可能會(huì)為炎癥疾病的發(fā)病機(jī)理提供新的見(jiàn)解［117］。

7 展 望

Keap1作為E3泛素連接酶接頭蛋白，其介導(dǎo)的泛素化通常走向蛋白質(zhì)降解并影響某些信號(hào)事件。我們也對(duì)其中4種降解型底物進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，然而泛素化是個(gè)復(fù)雜的翻譯后修飾過(guò)程，降解型泛素化修飾并不是其唯一通路。因此為了解Keap1究竟是通過(guò)降解型泛素化修飾還是非降解型來(lái)影響下游底物，其泛素化底物似乎可成為一個(gè)切入點(diǎn)。眾所周知，Keap1通常結(jié)合擁有E（T/S）GE基 序 的 底 物 蛋 白，如Nrf2、IKKβ、p62、SOX9、PGAM5、PALB2和MCM3等。有趣的是，在這些底物中，擁有另一個(gè)DLG基序的底物蛋白如Nrf2、IKKβ被Keap1泛素化后被蛋白酶體降解，然而僅含有E（T/S）GE基序的底物蛋白如PGAM5、PALB2和MCM3被Keap1泛素化修飾，但蛋白質(zhì)穩(wěn)定性并不受影響。而同樣存在具有ETGE和DLG基序的Nrf1僅被Keap1泛素化而不被降解。此外SOX9不同于其他，它與Keap1結(jié)合是通過(guò)兩個(gè)DLK基序，這種基序與DLG基序非常相似。在這里我們提出一種猜想，底物是否標(biāo)記為泛素化降解以及其降解動(dòng)力學(xué)如何，可能部分取決于DLG基序的存在。但這似乎不足以完全解決泛素化之后通路的問(wèn)題，因此，今后更多底物的發(fā)現(xiàn)可能有助于解決該問(wèn)題。

Keap1作為一種抑癌基因，在人類癌癥中存在著各式的Keap1體細(xì)胞突變，且這些突變遍布在整個(gè)Keap1蛋白。因此，了解特定的體細(xì)胞突變對(duì)蛋白質(zhì)功能有何影響，能為以后治療那些存在Keap1突變的癌癥提供一定的見(jiàn)解。例如一項(xiàng)對(duì)鱗狀細(xì)胞肺癌中體細(xì)胞突變的研究表明，Keap1中沒(méi)有一個(gè)突變發(fā)生在與Nrf2直接相互作用的氨基酸中。然而，其中一些突變能增強(qiáng)Keap1和Nrf2之間的相互作用，盡管它們不影響泛素化，但它們阻止了Nrf2的蛋白酶體降解。總之，探究Keap1突變影響其底物蛋白結(jié)合能力或者是泛素化具有重要意義。此外Keap1癌癥基因組的改變與癌基因信號(hào)通路的異常激活存在一定聯(lián)系，并提示泛素介導(dǎo)的腫瘤蛋白水解作用有助于腫瘤的發(fā)展。因此，進(jìn)一步研究Keap1激活機(jī)制并開(kāi)發(fā)針對(duì)Keap1表達(dá)的藥物可能對(duì)癌癥的治療或預(yù)防具有重要的臨床意義。

上文討論了Keap1在由于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的許多人類疾病中的負(fù)面作用。Keap1抑制劑的出現(xiàn)為對(duì)這些疾病有效的治療或預(yù)防劑。早期的Keap1抑制劑是作用于Keap1半胱氨酸發(fā)揮作用的親電子試劑，也被稱之為Keap1間接抑制劑。如三萜化合物2-氰 基-3，12-二 氧ooleana-1，9-二 烯-28-油 酸（CDDO）的衍生物是極強(qiáng)的親電反擊反應(yīng)誘導(dǎo)劑。這些衍生物與C151結(jié)合并破壞KEAP1和CUL3之間的相互作用。具有與CDDO類似骨架結(jié)構(gòu)的小分子（例如CDDO-Im）已被開(kāi)發(fā)為立體選擇性KEAP1-C151結(jié)合試劑。但這些抑制劑存在著很大的缺陷，Keap1的抑制劑可能會(huì)產(chǎn)生脫靶反應(yīng)，引起潛在的毒性作用。為此，在Keap1-Nrf2 PPI研究的基礎(chǔ)下，人們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了針對(duì)于Keap1-Nrf2 PPI的幾種直接抑制劑。這些直接抑制劑通過(guò)非共價(jià)機(jī)制通過(guò)抑制Keap1-Nrf2 PPI起作用，也被認(rèn)為是一種用于治療和預(yù)防多種疾病和病癥的新穎治療策略。最近也開(kāi)發(fā)了Keap1與其他底物之間的直接抑制劑，有研究發(fā)現(xiàn)N-［2-丙酮基-4-（4-乙氧基苯磺?；被┹?1-基］-4-乙氧基苯磺酰胺（K67）是磷酸化p62-Keap1相互作用的抑制劑，可降低肝癌中Nrf2的水平。K67抑制肝癌細(xì)胞的增殖并加速抗癌藥的作用。K67還可能使癌細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的抵抗力降低，尤其是在HCV陽(yáng)性肝癌患者中。因此，在未來(lái)Keap1與底物之間的PPI的研究可以為更多直接作用與PPI的Keap1抑制劑提供見(jiàn)解。Keap1抑制劑在疾病中是把雙刃劍，Keap1抑制劑的使用在肝病模型中已經(jīng)體現(xiàn)出Keap1抑制劑的黑暗一面。Keap1抑制劑可以激活Nrf2改善3期慢性腎臟疾病和2型糖尿病患者的腎小球?yàn)V過(guò)率而發(fā)揮積極作用，但也能激活NF-κB而加重腎纖維化。因此，在使用Keap1抑制劑時(shí)，腎病中NF-κB和Nrf2激活的對(duì)立面似乎更加體現(xiàn)了Keap1抑制劑特異性的重要性。此外，Keap1的其他功能也是目前研究的熱點(diǎn)，雖然已經(jīng)有了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，但Keap1的功能仍有待完善。特別是在衰老這一人類不可避免的事件中，雖然已經(jīng)提出Keap1-Nrf2在衰老中的重要作用，但僅局限于Nrf2的作用，而Keap1的神秘面紗卻始終沒(méi)有揭開(kāi)。因此，在未來(lái)，衰老中Keap1的非規(guī)范功能研究是重要的。