凌慧，侯恩存，趙藝蔓，陳曉宇，李洲強(qiáng)，郭凱凱，覃鳳飛

廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院 廣西南寧 530000

我國(guó)肝癌病人占全球的半數(shù)以上并不斷呈上升趨勢(shì)[1]，其主要由75%～85%的肝細(xì)胞癌（HCC），10%～15%的肝內(nèi)膽管癌（iCCA）和其他兩種罕見的組織病理學(xué)類型組成。當(dāng)前，HCC的危險(xiǎn)因素包含乙型肝炎病毒（HBV）等病毒感染，烷基化劑等化學(xué)致癌物，X射線等物以及飲酒、吸煙、熬夜等生活方式和新陳代謝異常影響腫瘤微環(huán)境的2型糖尿病等[2]。深入闡明慢性HBV相關(guān)HCC發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，在其預(yù)防、診斷和治療具有重要臨床意義。

現(xiàn)代研究表明[3]，小柴胡湯可通過(guò)抑制肝脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞外基質(zhì)的積聚，從而起到護(hù)肝強(qiáng)肝之效，臨床已被廣泛應(yīng)用于肝炎、肝癌等疾病。但因小柴胡湯化學(xué)成分復(fù)雜，目前對(duì)于小柴胡湯治療肝癌完整的藥效機(jī)制尚未明確。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，加以生物信息學(xué)、分子對(duì)接等手段，探索有效物質(zhì)成分、核心作用靶點(diǎn)以及其調(diào)控的生物學(xué)機(jī)制，從而揭示的小柴胡湯抗HBV相關(guān)HCC的藥效基礎(chǔ)及理論依據(jù)。

資料與方法

1 小柴胡湯活性成分篩選及作用靶點(diǎn)

在TCMSP平臺(tái)檢索小柴胡湯諸味中藥的活性成分和相關(guān)靶點(diǎn)。限制OB≥30%，DL ≥0.18，符合里賓斯基的類藥五原則[4]，更能與人體組織器官結(jié)合以發(fā)揮中藥藥效[5]。

2 芯片數(shù)據(jù)檢索及差異基因分析

在 GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)以“l(fā)iver cancer”、“hepatocellular carcinomas”、“HCC”等為關(guān)鍵詞檢索，選出基因芯片GSE121248數(shù)據(jù)集，使用R軟件limma包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、差異分析（限制LogFC絕對(duì)值＞1且調(diào)整adjustP＜0.05）。

3 構(gòu)造小柴胡湯抗HBV相關(guān)HCC的“中藥活性成分-藥物-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖

將1及2步驟獲得的結(jié)果合并取交集基因，導(dǎo)入到 cytoscape3.7.2 中網(wǎng)絡(luò)分析，根據(jù)node、edge情況構(gòu)造“中藥活性成分-藥物-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖。

4 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用cytoscape3.7.2的BisoGenet插件里收錄的DIP，BIOGRID，HPRD，INTACT，MINT和BIND等蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)構(gòu)建PPI。采用CytoNCA插件結(jié)合中介性和連通性等指標(biāo)整合網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，設(shè)定條件DC＞61，BC＞200，找出藥物作用于 HBV 相關(guān) HCC 的重要基因。

5 基因本體論（GO）功能富集分析

使用R包輸入條件pvalueCutoff ＜0.05，且調(diào)整qvalueCutoff＜0.05對(duì)交集基因進(jìn)行GO注釋。

6 京都基因百科全書數(shù)據(jù)（KEGG）通路富集分析

使用R軟件輸入條件pvalueCutoff＜0.05，且調(diào)整qvalueCutoff＜0.05對(duì)交集基因進(jìn)行KEGG通路分析。

7 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制

將上述6結(jié)果導(dǎo)入到 cytoscape3.7.2 中，顯示通路與基因的富集程度，制作肝癌通路與基因表、肝癌通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖。

8 藥物成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

篩選出重要成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。分別從PubChem、PDB平臺(tái)下載活性成分結(jié)構(gòu)mol2文件、核心基因蛋白PDB文件。利用PyMOL 2.3.4去除水分子及配體，導(dǎo)入AutoDock1.5.6軟件加氫，將活性成分及靶蛋白格式保存為pdbqt格式，設(shè)置盒子參數(shù)對(duì)受體和配體進(jìn)行分子對(duì)接，采用Pymol 2.3.4軟件對(duì)結(jié)果可視化。

結(jié) 果

1 有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

TCMSP網(wǎng)站得到小柴胡湯的活性有效成分共149個(gè)（見表1），其中對(duì)應(yīng)柴胡11個(gè)，半夏9個(gè)，黃芩29個(gè)，人參13個(gè)，生姜3個(gè)，大棗16個(gè)，甘草88個(gè)，共有活性成分8個(gè)。同時(shí)獲取小柴胡湯各味中藥成分的所有靶點(diǎn)共12048個(gè)，其中柴胡的靶點(diǎn)2737個(gè)，半夏的靶點(diǎn)1302個(gè)，黃芩的靶點(diǎn)1203個(gè)，人參的靶點(diǎn)746個(gè)，生姜的靶點(diǎn)2225個(gè)，大棗的靶點(diǎn)1329個(gè)，甘草的靶點(diǎn)2506個(gè)。將篩選后的活性有效成分及所有藥物靶點(diǎn)取交集，最終整理得小柴胡湯活性有效成分藥物靶點(diǎn)3560個(gè)。

表1 小柴胡湯的部分活性有效成分

2 差異基因分析

與健康組對(duì)照，HBV相關(guān)HCC患者580個(gè)基因存在差別表達(dá)，上調(diào)基因167個(gè)，下調(diào)基因413個(gè)。繪制出熱圖（見圖1a）及火山圖（見圖1b）。

3 構(gòu)造“中藥活性成分-藥物-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖

將小柴胡湯與HBV相關(guān)HCC的差異基因合并，獲得30個(gè)交集基因（見圖1c）。將交集基因、化學(xué)成分導(dǎo)入到 cytoscape3.7.2 中，構(gòu)造“中藥活性成分-藥物-疾病靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1d），度值最高的是柴胡、甘草、大棗都具有的活性成分槲皮素（quercetin，MOL000098），其次是山奈酚（kaempferol，MOL000422）、豆甾醇（Stigmasterol，MOL000449）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，MOL000358）等，故可認(rèn)為上述成分是小柴胡湯抗HBV相關(guān)HCC的主要分子。

圖1 a正常人與HBV相關(guān)HCC患者差異基因熱圖；b正常人與HBV相關(guān)HCC患者差異基因火山圖；c小柴胡湯藥物與疾病靶標(biāo)韋恩圖；d中藥活性成分-藥物-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

4 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

PPI拓?fù)浞治龊Y選出3個(gè)標(biāo)紅的CDK1、TOP2A、HSPB1重要基因，見圖2。

圖2 小柴胡湯治療HBV相關(guān)HCC基因的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

5 GO富集分析

GO分析共獲得278個(gè)功能富集條目，其中BP250條、CC4條、MF24條，分別選前20條富集條目繪制氣泡圖（見圖3a～3c）。其中BP主要富集在類固醇代謝；CC則集中在蛋白激酶全酶復(fù)合物；MF首要表示在氧化還原酶活性。

6 KEGG富集分析

KEGG剖析共獲取18條通路（圖 3d），通路涉及類固醇激素的合成通路，視黃醇、藥物、花生四烯酸等代謝通路，細(xì)胞衰老通路，p53、IL-17、TNF等信號(hào)通路。

圖3 a 生物過(guò)程（BP）；b 細(xì)胞成分（CC）； c分子功能（MF）；d KEGG；e 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖

7 通路與基因網(wǎng)絡(luò)圖繪制

從肝癌通路與基因表（表2）、網(wǎng)絡(luò)圖（圖3e）中可以看出可以看出 hsa00830、hsa00982、 hsa00980 、hsa05204、hsa04218是富集最多的通路，F(xiàn)OS、 CCL2、CDK1、CCNB1、 ADH1C、PTGS2、CXCL2、CYP2B6是顯著表達(dá)的基因。

表2 小柴胡湯治療HBV相關(guān)HCC通路

8 分子對(duì)接結(jié)果

上述顯示，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇是小柴胡湯有效活性成分中degree預(yù)測(cè)靶點(diǎn)最多的關(guān)鍵藥效物質(zhì)，CDK1、TOP2A、PTGS2、FOS、CCL2是關(guān)鍵的候選基因，且經(jīng)“中藥有效成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖得知活效成分與關(guān)鍵基因存在相互作用，故選取兩者分別作為分子對(duì)接的配體和受體進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以探究二者分子層面的相互作用位點(diǎn)。普遍認(rèn)為，對(duì)接結(jié)合分值小于-4.25 kcal·mol-1表示兩者間有一定的結(jié)合活性，小于-5.0則表示有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 更具備強(qiáng)烈的結(jié)合活性[6]。通過(guò)autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接并計(jì)算出結(jié)合能（見表3），對(duì)接結(jié)果利用 Pymol 軟件繪圖，見圖4。

圖4 分子對(duì)接

表3 小柴胡湯抗HBV相關(guān)HCC相關(guān)分子對(duì)接結(jié)合信息

討 論

雖然小柴胡湯在臨床肝癌上運(yùn)用較多，本研究探討其治療的分子靶點(diǎn)及機(jī)理，以進(jìn)一步促進(jìn)臨床運(yùn)用與相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。

1 潛在有效成分

小柴胡湯的首要活性成分槲皮素，可以通過(guò)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）延緩肝癌HepG2細(xì)胞的增殖[7]，還可以通過(guò)抑制PKC、PTK、MAPK和其他信號(hào)通路來(lái)增加癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性[8]。山柰酚激活TP53通路或結(jié)合雌激素受體，從而產(chǎn)生抗腫瘤作用[9]。豆甾醇在臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)表達(dá)調(diào)亡基因的情況下，破壞腫瘤血管的生成，具有抑制肝癌、皮膚癌等多種腫瘤生長(zhǎng)的作用[10]。植物甾醇類β-谷甾醇不僅具有抗炎、抗氧化作用，還具有抗病毒、調(diào)免疫、抗腫瘤的作用[11]，其抗腫瘤機(jī)制涉及誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯與調(diào)亡，抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體的黏附和侵入[12]。上述四種化合物均處于網(wǎng)絡(luò)圖的核心，并具有較高Degree，提示這些化合物可能在小柴胡湯抗HBV相關(guān)HCC過(guò)程中起主要作用。

2 潛在基因靶標(biāo)

CDK1，亦稱CDC2，是一種主要參與有絲分裂細(xì)胞周期過(guò)程的絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過(guò)去磷酸化激活參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中S期及G2/M期[13]，若該過(guò)程運(yùn)行顯著異常，會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不斷的增殖擴(kuò)散以及受損細(xì)胞的不恰當(dāng)存活[14，15]。此外，CDK1在miR-1271-5p[16]、miR-378[17]靶向下抑制凋亡、增殖并加強(qiáng)放射敏感性。據(jù)研究報(bào)道，能抑制腫瘤增殖的CDKs抑制劑[18]是醫(yī)治腫瘤的新興領(lǐng)域之一。

TOP2A是一類參與改變DNA拓?fù)錉顟B(tài)、編碼Topllα蛋白DNA片段的酶蛋白，在肝癌組織高表達(dá)，且與臨床預(yù)后顯著負(fù)相關(guān)[19]。通過(guò)參與p53、癌癥和細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)等多種途徑， 發(fā)揮原癌基因作用[20]，并對(duì)化療藥物蒽環(huán)類的療效具有預(yù)測(cè)性[21]。

FOS編碼的C-fos蛋白是AP-1的一個(gè)單體，AP-1通過(guò)JNK途徑被各種促炎性刺激物激活，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖凋亡等過(guò)程[22]。AP-1復(fù)合物亞基mu-1（AP1M1）在HBV轉(zhuǎn)染的HepG2肝癌細(xì)胞中被上調(diào)， 加速了蛋白激酶B的磷酸化和HepG2肝癌細(xì)胞增殖，是與HBV感染引起的肝癌進(jìn)展有關(guān)的關(guān)鍵因素之一[23]。

CCL2 是活化炎癥、血管生成和抗凋亡的關(guān)鍵介質(zhì)，參與JAK2-Stat5和p38MAPK通路，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24]。

PTGS2是一種易被多種因素（如炎癥損傷、激素水平、致癌劑）誘導(dǎo)表達(dá)的即刻反應(yīng)癌基因[25]，通過(guò)催化花生四烯酸釋放炎癥介質(zhì)前列腺素[26]。

CCNB1，亦稱Cyclin B1，是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M階段的有絲分裂調(diào)節(jié)蛋白，將其敲除或在miR-144靶向調(diào)節(jié)下抑制表達(dá)可延緩腫瘤的形成[27]。

3 富集分析

KEGG通路主要與細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移、炎癥和免疫相關(guān)。大量文獻(xiàn)報(bào)道，顯著富集的P53信號(hào)通路與細(xì)胞周期、DNA修復(fù)改變緊密相關(guān)，影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[28]。持續(xù)慢性細(xì)胞衰老參與腫瘤的發(fā)生，衰老肝細(xì)胞的蓄積和其免疫防御受損所導(dǎo)致的衰老共存將向著HCC的方向發(fā)展[29]。IL-17信號(hào)通路與自身免疫病、自身免疫防御、調(diào)節(jié)感染、活化炎癥反應(yīng)等相關(guān)[30]，另一個(gè)富集顯著的TNF信號(hào)通路涉及到下游NF-κB激活的傳導(dǎo)途徑[31]，參與基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和氧化應(yīng)激[32]。

4 分子對(duì)接

小柴胡湯中關(guān)鍵藥效物質(zhì)與核心靶點(diǎn)蛋白能夠穩(wěn)定的結(jié)合，表明小柴胡湯可能作用于 CDK1、CCNB2、 TOP2A 、FOS、 PTGS2、 CCL2 等靶點(diǎn)，調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡，調(diào)節(jié)免疫活性，從而抗肝癌。研究表明[33]，黃酮類化合物可以直接或間接地降落CDKs和cyclins的蛋白水平。這與本研究中“有效活性成分-藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”的槲皮素、山奈酚與CDK1、CCNB2中互相作用的觀點(diǎn)相一致。

綜上所述，本研究通過(guò)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與分子對(duì)接驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚為小柴胡湯的主要活性成分，以 CDK1、TOP2A、FOS、 CCL2 、CCNB1等為核心靶標(biāo)，涉及代謝合成、蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶活性、氧化結(jié)合調(diào)控等多個(gè)生物過(guò)程，并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期、合成代謝、免疫炎癥信號(hào)通路發(fā)揮抗HBV相關(guān)HCC，本研究最終通過(guò)分子對(duì)接驗(yàn)證了活性成分與核心靶標(biāo)之間的協(xié)同抗癌效應(yīng)，為后續(xù)分子層面的中藥抗癌研究提供理論支持。