程浩洋，李長(zhǎng)輝

1 遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 遼寧沈陽 110000

2 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 遼寧沈陽 110000

隨著新世紀(jì)的到來，我國居民的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式隨著時(shí)代的發(fā)展而改變，繁忙的生活帶來焦慮情緒和不規(guī)律的飲食，今年來流行的高油脂、高熱量飲食所導(dǎo)致的肥胖嚴(yán)重威脅著我們的健康。根據(jù)《中國成人超重和肥胖癥預(yù)防控制指南》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，我們認(rèn)為BMI在 25.0到29.9之間為超重，BMI≥30即為肥胖[1]。2005年全國肥胖調(diào)查發(fā)現(xiàn)，男性肥胖率23%，女性肥胖率22.7%，男性超重率6.6%，女性超重率7.6%，城市肥胖率和超重率均高于農(nóng)村[2]。郭春雷的研究顯示，我國兒童超重率逐年顯著提升，截至2014年已達(dá)7.3%[3]。基于1997-1998年12地區(qū)老年肥胖人口調(diào)查推測(cè)，我國老年群體男性超重率為32.92%，女性超重率為34.84%[4]。由此可見我國肥胖與超重在各個(gè)年齡段各個(gè)區(qū)域都有較高的發(fā)病率，肥胖作為多種疾病如高血壓、2型糖尿病、冠心病、睡眠呼吸暫停等的高危因素，大大威脅現(xiàn)代居民的健康，尋求干預(yù)肥胖進(jìn)展的手段已迫在眉睫。我國中醫(yī)藥對(duì)肥胖的認(rèn)識(shí)已有千年之久，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中對(duì)肥胖類型的認(rèn)識(shí)即有脂人、膏人、肉人之別，李東垣的《脾胃論》中有“脾胃俱旺，能食而肥；脾胃俱虛，則不能食而瘦”，指出患者常由于食欲旺盛為最初原因引起肥胖，隨著病情的演進(jìn)，諸如痰濁、濕熱、血瘀等病理產(chǎn)物的出現(xiàn)，肥胖的治療手段也根據(jù)具體證型而調(diào)整。其中黃連-黃芩以苦寒燥濕瀉熱為主要功效，是濕熱內(nèi)蘊(yùn)證型肥胖的常用藥對(duì)，首見于《傷寒雜病論》中協(xié)熱下利之葛根芩連湯證?，F(xiàn)代對(duì)其藥理學(xué)研究與觀察從未中斷，其中段陽泉所做的臨床療效觀察顯示，以二陳湯為基礎(chǔ)方，針對(duì)濕熱證型加黃連、黃芩、澤瀉等，經(jīng)3個(gè)月的治療，患者體重下降15公斤[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為，黃連調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進(jìn)有益菌群的增多，減少有害菌，以減輕慢性炎癥反應(yīng)，有著防治肥胖和延緩糖尿病并發(fā)癥的積極療效[6]。陳美珍[7]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，黃芩素改善胰島素抵抗，其機(jī)制可能是抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，黃芩苷能夠促進(jìn)NF－K B活化來減少炎癥因子釋放以減輕肥胖導(dǎo)致ASP時(shí)的肝損傷，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[8]。黃連堿對(duì)飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的體重有一定的控制作用，其機(jī)制是抑制LPS/TLR-4通路，緩解肝臟炎癥反應(yīng)，減少脂質(zhì)在脂肪細(xì)胞中的合成與積累[9]。黃連素能夠減輕氧化應(yīng)激，降低PAH1的表達(dá)降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯水平[10]。由此可見黃連-黃芩藥對(duì)治療肥胖及其并發(fā)癥的全面性，但許多機(jī)制尚有許多不明之處。本研究欲以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方式探究本藥對(duì)治療肥胖的基因位點(diǎn)和作用通路，以從系統(tǒng)性視角分析其作用機(jī)理。

資料與方法

1 相關(guān)數(shù)據(jù)庫及工具

藥 物 數(shù) 據(jù) 庫 TCMSP：https：//tcmspw.com，Pubchem：https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/，Uniprot：https：//www.uniprot.org/。 疾 病 數(shù) 據(jù) 庫 Genecards：https：//www.genecards.org/。

交 集 工 具 Venny2.1.0：https：//bioinfogp.cnb.csic.es/。PPI網(wǎng)絡(luò)繪制工具 STRING：https：//stringdb.org/。GO，KEGG 富 集 工 具 Metascape：https：//www.plob.org/tag/metascape。圖表繪制微生信：http：//www.bioinformatics.com.cn/?？梢暬治鲕浖﨏ytoscape3.8.0。

2 藥物靶點(diǎn)篩選標(biāo)準(zhǔn)

在中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫TCMSP中查找黃連-黃芩藥對(duì)，根據(jù) Lipinski 的 5 規(guī)則，即分子量 ＜500、-2＜ 脂水分配系數(shù) ＜ 5、氫鍵供體數(shù)（Hdon）＜ 5、氫鍵受體數(shù)（Hacc）＜ 10、旋 轉(zhuǎn) 鍵數(shù)（RBN）＜ 10 和 ADME（absorption， distribution，metabolism，excretion） 特性，設(shè)置類藥性（DL）≥0.18 和口服生物利用度（OB）≥30%篩選出活性較高的化合物。（來自《中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志》）并獲取化合物的相應(yīng)靶點(diǎn)MOLID及相應(yīng)數(shù)據(jù)，并在Uniprot網(wǎng)站轉(zhuǎn)換為基因名，剔除無效、重復(fù)靶點(diǎn)，建立藥物靶點(diǎn)基因集。

3 收集肥胖相關(guān)基因位點(diǎn)

獲取疾病靶點(diǎn)。使用Genecards數(shù)據(jù)庫，輸入“Obesity”，得到數(shù)據(jù)庫收錄的肥胖相關(guān)靶基因。搜集肥胖的疾病相關(guān)靶點(diǎn)，記錄基因名（gene symbol），并建立肥胖基因集。

4 建立化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

4.1 尋找交集基因 將藥物靶點(diǎn)基因與疾病基因集導(dǎo)入Venny2.1.0繪制交集圖，記錄交集基因以建立交集基因集。

4.2 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)映射 編輯交集基因，明確其中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系，編寫network、type文件，將其導(dǎo)入Cytoscape3.8.0，進(jìn)行可視化分析，并進(jìn)行美觀改良，獲得“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

4.3 交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)建設(shè) 將交集基因的基因名（gene symbol）導(dǎo)入STRING網(wǎng)站進(jìn)行分析，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)圖及tsv文件，將tsv文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.0進(jìn)一步分析改良以便于可視化圖表展示。

4.4 GO富集與KEGG富集分析 將交集基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫，并選取智人基因（homo sapiens）選項(xiàng)，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，其中，GO 功能富集分析的 BP 為生物學(xué)過程、CC 為細(xì)胞組成、MF 為分子功能。并以表格文件保留富集分析結(jié)果。使用微生信繪制圖表，GO富集中的GOterm、Subgroup、Enrichment sroce，繪制柱狀圖。KEGG富集分析中的 Pathway、Pvalue、Enrichment、count導(dǎo)入微生信，繪制氣泡圖。

結(jié) 果

1 黃連-黃芩藥對(duì)成分分析

黃連化合物成分計(jì)12種，黃芩化合物成分計(jì)30種，二者共有成分共2種為coptisine（黃連堿）與epiberberine（表小檗堿），黃連共計(jì)227個(gè)不重復(fù)藥物靶點(diǎn)，黃芩共計(jì)196個(gè)不重復(fù)藥物靶點(diǎn)，二者重疊靶點(diǎn)共13個(gè)。

2 疾病基因靶點(diǎn)匯總與藥物疾病靶點(diǎn)交集

肥胖基因靶點(diǎn)9513個(gè)，占總基因的99.6%，只與黃連交集靶點(diǎn)89個(gè)，占比0.9%，只與黃芩交集靶點(diǎn)37個(gè)，占比0.4%，與黃連黃芩共同交集70個(gè)，占比0.7%，見圖 1。

圖1 黃連-黃芩藥對(duì)作用靶點(diǎn)與肥胖基因位點(diǎn)Venny圖

3 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

利用STRING對(duì)213個(gè)交集基因進(jìn)行分子互相作用，得到3466個(gè)連結(jié)邊數(shù)并繪制分子互相作用網(wǎng)絡(luò)圖，將PPI互質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入cytoscape3.8.0進(jìn)行可視化分析，并繪制核心靶點(diǎn)PPI互質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖，取大于2倍degree值的中位數(shù)為核心靶點(diǎn)，共計(jì)39個(gè)核心靶點(diǎn) MAPK1、JUN、PRKCA、RELA、MYC、TP53、PRKACA、EGFR、TNF、AKT1、MAPK14、FOS、ESR1、CAV1、TGFB1、STAT1、PRKCB、IFNG、PRKCD、CXCL8、GSK3B、FN1、AR、VEGFA、EGF、RB1、IL1B、IL6、CDKN1A、BCL2、PPARG、CCND1、ERBB2、CASP3、IL2、HSPB1、HSPA5、HIF1A、E2F1。見圖 2-4，表1-2。

圖2 化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心靶點(diǎn)PPI分子互相作用網(wǎng)絡(luò)

表1 度值前10化合物

表2 度值前10基因靶點(diǎn)

4 GO富集分析與KEGG富集分析結(jié)果展示

黃連-黃芩藥對(duì)治療肥胖所涉及的生物過程有：有毒物質(zhì)反應(yīng)、受傷反應(yīng)、活性氧代謝過程、脂多糖反應(yīng)、凋亡信號(hào)通路、對(duì)氧氣水平反應(yīng)等。涉及的細(xì)胞成分：膜筏、突觸后膜、受體復(fù)合物、囊泡內(nèi)腔、枝晶膜等。涉及的分子功能：轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、核受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、蛋白質(zhì)均二質(zhì)活性等。癌癥的途徑、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、乙型肝炎、蛋白聚糖在癌癥中、IL-17信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、鉑金抗藥性、阿米巴病、血清素能突觸、甲狀腺激素信號(hào)通路是治療肥胖的主要作用通路，見圖5-7。

圖5 GO富集分析

圖6 KEGG分析通路可信度排行

圖7 KEGG分析氣泡

討 論

根據(jù)本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)KEGG富集分析結(jié)果所得通路，將“化合物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖所得度值前十名基因位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)應(yīng)，發(fā)現(xiàn)HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、血清素能突信號(hào)通路極有可能是黃芩-黃連藥對(duì)治療肥胖的作用途徑。

低氧誘導(dǎo)因子具有廣泛的生物效應(yīng)，有實(shí)驗(yàn)研究表明，當(dāng)受試小鼠HIF-1通路受抑制時(shí)下丘腦炎癥反應(yīng)增加，降低其葡萄糖攝取能力和基礎(chǔ)代謝率，使體重增加[11]。高糖水平下食欲控制神經(jīng)元中HIF-1的表達(dá)增加，抑制葡萄糖的攝取，使食欲減退[12]。脂肪形成和高胰島素血癥均能促進(jìn)HIF-1αmRNA的表達(dá)，加重慢性炎癥反應(yīng)使肥胖加劇[13]。HIF-1信號(hào)通路中的HIF-1α與葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體（GIPR）的表達(dá)正相關(guān)，GIPR在脂肪細(xì)胞中大量增殖產(chǎn)生IL-6等炎癥因子，破壞脂肪細(xì)胞的胰島素敏感性[14]。諸多研究表明，HIF-1信號(hào)通路對(duì)肥胖的調(diào)控是雙向的，更具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

IL-17能從基因調(diào)控的方面影響肥胖，通過調(diào)控炎癥基因如 TNF- α，IL-6，IL- β，COX-2，IL-17RA，IL-17RC，CXCL1等在脂肪組織中的表達(dá)以影響代謝[15]，例如其中NF-α，IL-6和IL-1β能阻礙胰島素信號(hào)通路的表達(dá)[16]。IL-17抑制小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子以及脂質(zhì)、葡萄糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)以抑制向脂肪細(xì)胞的分化，對(duì)于已分化的脂肪細(xì)胞，IL-17能減少其攝取葡萄糖[17]。實(shí)驗(yàn)研究，IL-17基因敲除小鼠脂肪細(xì)胞分化減少，脂肪細(xì)胞中促脂肪形成轉(zhuǎn)錄因子和脂肪因子的mRNA表達(dá)受抑制，改善了飲食引起的肥胖、脂肪肝、葡萄糖和脂質(zhì)代謝。其機(jī)制可能是當(dāng)IL-17缺乏時(shí)，脾臟和肝臟中的TBK1和IKBKE的表達(dá)降低，以改善代謝功能障礙[18]。Chong Chen[19]的研究表明，血清胰島素，胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF1）和白介素17（IL-17）之間有一個(gè)共有的基因位點(diǎn)GSK3，使二者常發(fā)生串?dāng)_，將GSK3基因敲除即可阻斷串?dāng)_，可改善胰島素代謝。

血清素能突觸（Serotonergic synapse）又名5-羥色胺能突觸，5-羥色胺（5-HT）在人體內(nèi)作用于不同組織的受體產(chǎn)生多種多樣的作用，近年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)減重治療存在巨大的的研究?jī)r(jià)值。針對(duì)肥胖患者而言，5-HT能夠激活胃腸道平滑肌5-HT2受體或腸壁內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞5-HT4受體均可以引起胃腸道平滑肌收縮，使胃腸道張力增加[20]。目前臨床上已有使用5-HT的主要受體5-HT2CR的激動(dòng)劑改善肥胖和血糖控制[21]。其能夠在孤立腦干核中選擇性激活，以抑制食欲，減少飲食[22]。使用5-HT2CR突變小鼠的實(shí)驗(yàn)研究顯示，突變體在中年時(shí)期表現(xiàn)出較多食物攝取和肥胖癥候群的傾向。對(duì)高脂喂養(yǎng)更敏感，更易發(fā)生肥胖和2型糖尿病[23]。

由此推論可得出，涉及以上三個(gè)通路的高頻核心靶點(diǎn)為 PTGS2、NOS2、PRKACA、PTGS1，涉及此四個(gè)靶點(diǎn)三個(gè)及以上的核心化合物有黃芩素（4）、漢黃芩素（3）、槲皮素（3）、（r）- 加拿大堿（3）、橙黃素 a（3）、醋酸乙酯（3）、5- 羥基 -7，8- 二甲氧基黃酮（3），可推測(cè)以上化合物可能是黃連-黃芩藥對(duì)治療肥胖的主要活性成分。由此推論HIF-1信號(hào)通路參與活性氧代謝過程和對(duì)氧氣水平反應(yīng)恢復(fù)胰島素敏感性，利用IL-17信號(hào)通路影響脂肪的轉(zhuǎn)錄因子減少前脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脂肪細(xì)胞，以及干預(yù)血清素能突觸通路中的神經(jīng)遞質(zhì)與受體結(jié)合以抑制食欲，以上三種模式來達(dá)到減肥療效。本文以應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)性探究黃連-黃芩藥對(duì)治療肥胖的作用機(jī)制為主旨研究得出以上結(jié)論，希望能為其進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)，為探尋其他中藥組方治療肥胖提供新思路。