陳志娟，耿乃志

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 黑龍江哈爾濱 150000

2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150000

室性期前收縮（premature ventricular beats），又名室性早搏，心律失常中最常見的類型之一，是希氏束及其分支以下的異位興奮點(diǎn)提前進(jìn)行除極從而產(chǎn)生的。該病在中醫(yī)學(xué)上歸類為"心悸"、"怔忡"，臨床上主要有以下幾種表現(xiàn)：即自覺心悸、胸悶、心跳間歇、脈結(jié)代等[1]。由器質(zhì)性病變導(dǎo)致的室性早搏，由器質(zhì)性病變引起導(dǎo)致的室性早搏，西醫(yī)學(xué)上治療的藥物有較為確切的療效，特別重要的是對(duì)于原發(fā)病的治療方面，以及對(duì)該類疾病進(jìn)行綜合護(hù)理等各個(gè)方面，但臨床應(yīng)用中仍然會(huì)受到諸多限制，如對(duì)于藥物存在不良反應(yīng)和嚴(yán)格手術(shù)適應(yīng)癥。因此更為安全有效的治療方法的研究意義重大。

室性早搏的中醫(yī)藥治療歷史悠久[2]。近年來，經(jīng)方治療室性早搏取得良好進(jìn)展，臨床較多采用的如桂甘龍牡湯、炙甘草湯、桂枝甘草湯等在基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用中均取得較大進(jìn)展[3]。其中桂枝甘草湯起源于《傷寒論》，該藥方被認(rèn)為是溫補(bǔ)心陽的藥物基礎(chǔ)方，且研究表明，中藥治療室性早搏使用頻率最高的藥對(duì)為甘草-桂枝藥對(duì)，有養(yǎng)血益氣、溫經(jīng)通陽、定悸復(fù)脈的功效[4]。本文采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)方法挖掘桂枝甘草湯的活性成分及靶點(diǎn)，揭示”藥物-成分-疾病靶點(diǎn)”的相互作用，為研究室性早搏的中藥作用機(jī)制提供思路，為臨床上的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 桂枝甘草湯活性成分的收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)及數(shù)據(jù)庫（TCMSP）檢索桂枝和甘草2味藥物的主要藥理化學(xué)成分，所需成分的篩選條件設(shè)定為口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18，得到2味藥物的化學(xué)成分。

2 桂枝甘草湯活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo)的獲取

利用TCMSP檢索桂枝和甘草的活性成分所對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因的名稱。

3 室性早搏疾病靶標(biāo)的獲取

通過檢索GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中與室性早搏相關(guān)的靶基因并進(jìn)行去重、合并，得到室性早搏相關(guān)靶點(diǎn)。

4 藥物-成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

取桂枝甘草湯的活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與室性早搏疾病的靶點(diǎn)的交集，從而獲得藥物治療該疾病靶點(diǎn)，并繪制Venn圖。使用Cytoscape3.8.2軟件構(gòu)建疾病-藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，探究桂枝甘草湯治療室性早搏的作用機(jī)制。

5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將桂枝甘草湯治療室性早搏潛在作用的靶蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)定物種為“人”，獲得各蛋白之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)，參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，隱藏網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，將結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，并使用R語言將每個(gè)靶標(biāo)的連接數(shù)目進(jìn)行排序，將前30位關(guān)鍵靶標(biāo)基因用柱狀圖的形式列出。

6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析

將得到的潛在靶標(biāo)基因ID導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，對(duì)其進(jìn)行GO和KEGG通路的富集分析。首先選擇滿足P＜0.05且Q＜0.05的生物學(xué)過程和通路，使用Bioconductor平臺(tái)及R語言繪制barplot柱狀圖和dotplot點(diǎn)圖。

結(jié) 果

1 桂枝甘草湯活性成分的收集及潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從TCMSP中共獲取甘草的活性成分280種，桂枝的活性成分220種。篩選后甘草活性成分92種，桂枝的活性成分7種，其中甘草活性成分中18α-羥基甘草次酸等四種成分未找到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，桂枝活性成分中過氧麥角甾醇未找到對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，故桂枝、甘草關(guān)鍵有效成分共94種。通過Uniprots數(shù)據(jù)庫獲得202個(gè)候選靶標(biāo)的對(duì)應(yīng)基因。檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中有關(guān)室性期前收縮的相關(guān)靶基因，得到3101個(gè)疾病相關(guān)基因，與藥物靶基因相映射，繪制Venn圖，得出甘草-桂枝藥對(duì)治療室性期前收縮的潛在作用靶標(biāo)一共145個(gè)，見圖1。

圖1 甘草-桂枝與室性早搏共同靶點(diǎn)基因

2 藥物-成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

使用Cytoscape3.8.2軟件對(duì)桂枝甘草湯的活性物質(zhì)和疾病靶點(diǎn)之間相互作用的關(guān)系等數(shù)據(jù)進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)，并做出了可視化的處理。該網(wǎng)絡(luò)共包括241個(gè)節(jié)點(diǎn)，1241種相互關(guān)系。其中紅色八邊形代表疾病室性早搏，綠色菱形代表甘草、桂枝兩種藥物，黃色三角形代表藥物的有效成分，綠色圓形代表藥物與疾病相關(guān)的潛在作用靶標(biāo)。連線代表其相互關(guān)系，見圖2。

圖2 關(guān)鍵活性成分與疾病靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)

3 桂枝甘草湯靶標(biāo)蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析

將桂枝、甘草中具有治療室性早搏作用的潛在靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到各蛋白之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，共145個(gè)節(jié)點(diǎn)和條邊，結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，然后使用R語言將每個(gè)靶標(biāo)的相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)排序，將排名前30的靶標(biāo)繪制為柱狀圖。其中AKT1的相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為105個(gè)，IL6的相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為98個(gè)，MAPK3的相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為92個(gè)，VEGFA的相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為92個(gè)，CASP3的相鄰節(jié)點(diǎn)數(shù)為87個(gè)?？赡転楣鹬Ω什轀委熓倚栽绮年P(guān)鍵基因，見圖3，圖4。

圖3 蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因

4 GO富集分析

GO富集分析產(chǎn)生的結(jié)果中，獲得了180條生物學(xué)過程，用條形圖的形式將排名前20位的生物過程表現(xiàn)出來。條形圖中，顏色越紅，說明富集越明顯。主要為RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、磷酸酶結(jié)合、核受體活性、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物學(xué)過程相關(guān)。可見桂枝甘草湯可通過多種生物學(xué)過程減少室性早搏的發(fā)生，見圖5。

圖5 甘草-桂枝治療室性早搏潛在作用靶標(biāo)的GO富集

5 KEGG富集通路分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)甘草-桂枝活性成分對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)進(jìn)行通路分析，獲得170條通路，將前20條通路繪制條形圖。條形圖中，顏色越紅，則富集越明顯，主要涉及的通路有糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17信號(hào)通路以及HIF-1信號(hào)通路等，表明桂枝甘草湯可通過多個(gè)靶點(diǎn)作用于不同通路治療室性早搏。另外，乙型肝炎、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、前列腺癌和胰腺癌、弓形體病、人巨細(xì)胞病毒感染、等多種通路提示桂枝甘草湯不僅可應(yīng)用于室性早搏的治療，還可應(yīng)用于其他疾病，體現(xiàn)了異病同治理論，見圖6。

圖6 甘草-桂枝治療室性早搏潛在作用靶標(biāo)的KEGG富集通路

討 論

室性早搏作為在我國在臨床上最常見的心律失常疾病之一，其在普通人群中具有高達(dá)1%～4%的發(fā)病率[5]，且隨年齡的增長而增加，病因包括器質(zhì)性疾病和功能性障礙，心臟器質(zhì)性病變、自主神經(jīng)重構(gòu)及失衡、交感神經(jīng)的興奮性增高、先天心內(nèi)結(jié)構(gòu)發(fā)育不良、藥物中毒以及電解質(zhì)紊亂等引起心室肌自律性增高，致使提前觸發(fā)除極活動(dòng)，以及局部微小折返環(huán)，從而引起室早[6-9]。

器質(zhì)性病變導(dǎo)致室早的患者，應(yīng)積極地治療本病的病因，而無器質(zhì)性病變的室早患者，應(yīng)首先給予生活指導(dǎo)，如在臨床上癥狀沒有明顯好轉(zhuǎn)時(shí)應(yīng)及時(shí)給予其他藥物治，如β受體阻滯劑、非二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，但兩種藥物療效有限，且有一定副作用。而導(dǎo)管消融治療可作為頻發(fā)室早癥狀明顯患者的更優(yōu)選擇，但手術(shù)成功率與早搏起源部位的高度有關(guān)，故部分區(qū)域消融難度較大[10]。

近年來，經(jīng)方治療心律失常尤其功能性室性早搏的研究取得良好進(jìn)展，室性早搏在祖國醫(yī)學(xué)中屬“心悸”“怔忡”的范疇，氣、血、陰、陽不足，致心神失養(yǎng)，氣滯、痰濁、血瘀阻于心脈而致氣血運(yùn)行不暢[11]，綜合為本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī)，治療上則虛者補(bǔ)氣養(yǎng)心安神，實(shí)者理氣消痰化瘀為基本治則[12]，桂枝甘草湯為《傷寒論》中治療心悸病的基礎(chǔ)方，且研究表明，基于數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，中醫(yī)藥治療室性早搏最常用藥對(duì)為甘草-桂枝藥對(duì)，功能益氣養(yǎng)血、復(fù)陽通脈，因中藥復(fù)方在臨床上治療疾病的特點(diǎn)為整體觀念和辨證論治，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多成分、多靶點(diǎn)、多通道的特征與之緊密結(jié)合，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供便利。

本文利用數(shù)據(jù)庫篩選出甘草中異甘草素、槲皮素、山柰酚以及甘草酸類化合物等88種有效成分，異甘草素可通過抗氧化、抗炎、阻斷電壓依賴性鉀電流通道和L型鈣電流通道，控制或減少室性早搏的的發(fā)生，另外，甘草酸類物質(zhì)通過抗氧化抗炎、阻斷心血管細(xì)胞間隙連接，保護(hù)心肌并起到抗心律失常的作用[13]，山奈酚可以發(fā)揮抑制平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移、抑制α-葡萄糖苷酶活性、抗糖化、抑制脂肪的合成和減輕急性肝損傷等作用[14]。刺芒柄花素具有抗腫瘤、抗炎、耐氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種微生物學(xué)功能的特性[15-17]。花旗松素可發(fā)揮抑制NF-kB信號(hào)通路從而起到對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[18]。槲皮素具有抗炎癥、抗腫瘤、抗衰老、抗氧、舒張血管等多種生物學(xué)效應(yīng)[19]。

丹皮酚、柚皮苷、槲皮素可作用于AKTI靶標(biāo)基因，在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于網(wǎng)絡(luò)中核心位置，AKT1蛋白在多種生物學(xué)過程中起作用，包括增殖、代謝、細(xì)胞存活和生長等，AKT信號(hào)通路是可起到調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡作用的重要信號(hào)通路[20]，抑制AKT1的正常表達(dá)能對(duì)心肌細(xì)胞起到一定保護(hù)作用[21]。篩選出桂枝中花旗松素、β-谷甾醇、谷甾醇、（+）-兒茶素、（+）-表兒茶素、紫杉葉素6種有效成分，實(shí)驗(yàn)研究表明，桂枝對(duì)大鼠有較強(qiáng)的抗焦慮和鎮(zhèn)靜的作用，可通過降低大鼠的交感神經(jīng)興奮性達(dá)到減少室性早搏發(fā)生的次數(shù)[22]。且研究表明桂枝甘草湯可在一定程度上抑制Na+通道，該方抗心律失常的主要作用機(jī)制可能與I類抗心律失常藥物的作用相一致[23]。多種成分作用于白介 素 6（IL6）、MAPK3、VEGFA、CASP3、EGF、JUN等多種靶標(biāo)基因，激活A(yù)GE-RAGE、TNF、IL-17等信號(hào)通路，通過作用DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶II特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、核受體活性等生物學(xué)過程，通過保護(hù)心肌細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡，改進(jìn)自主神經(jīng)功能，抑制交感神經(jīng)興奮，從而有效減少室性早搏的發(fā)生。