邢津溥，趙 欣，梁佳文，蒼 晶，張 達

(東北農業(yè)大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

低溫嚴重限制植物的分布和產量。茉莉酸(jasmonic acid, JA)作為一種信號分子，正向調控多種植物的抗寒性。低溫脅迫提高了水稻()和擬南芥()體內JA的含量，研究表明，這與JA生物合成基因的表達增加、JA分解代謝相關酶的基因表達受抑制有關。外源施加JA可顯著提高擬南芥的組成型及冷馴化誘導的抗寒能力；相反，阻斷植物內源JA的合成及信號轉導，則導致植物對寒害敏感。

JA的生物合成受環(huán)境脅迫影響，JA生物合成相關基因如脂氧合酶(lipoxygenase)基因、丙二烯氧化物合酶(allene oxide synthase)基因、丙二烯環(huán)氧化酶(allene oxide cyclase)基因、12-氧代植二烯酸還原酶(12-oxophytodienoate reductase)基因的轉錄均受JA誘導。低溫、高滲等脅迫也均能誘導JA的合成以及上述基因的表達。其中，LOX是含有非血紅素鐵的雙加氧酶，廣泛存在于植物中，在種子萌發(fā)、果實成熟、育性、衰老以及應對外界干旱、高滲、高溫、低溫、機械損傷、病原微生物侵染等脅迫中，均伴隨基因的表達。此外，基因的表達也受到外源物質如幾丁質、水楊酸、MeJA等誘導。小麥基因家族共鑒定到至少50 個成員，可分為9-和13-兩個亞家族，是JA合成途徑中的關鍵酶，主要催化JA前體生物合成的起始步驟。Menga等發(fā)現(xiàn)，硬粒小麥基因在遭受高滲脅迫下表達量明顯上升；Venegas-Molina等發(fā)現(xiàn)，擬南芥、西蘭花中基因在遭受蟲害和干旱脅迫下表達量發(fā)生顯著變化；Gao等發(fā)現(xiàn)，水稻中基因在細胞代謝、細胞死亡和疾病抵抗中發(fā)揮作用。擬南芥中LOX2-AOS-AOC復合物促進JA的生物合成，從而微調植物對生物和非生物刺激的反應。因此，研究JA合成相關基因及關鍵酶LOX2對解析JA對非生物脅迫的調控作用具有重要的意義。

東農冬麥1號(Dn1)是強抗寒性冬小麥品種，外源MeJA處理提高了Dn1在低溫脅迫下的抗寒能力以及JA信號轉導途徑關鍵基因、的表達量；且JA參與了低溫脅迫ICE-CBF途徑，提高了冷響應基因、、和的表達量，從而提高了其抗寒性。但Dn1的強抗寒性是否與內源JA合成基因的表達有關，外源MeJA處理對Dn1抗寒性的提高是否與內源JA的合成有關，都尚不清楚。本研究擬探討外源MeJA處理對低溫脅迫下Dn1中幾個JA生物合成基因(、、、、、、、和)表達量的影響，并結合生物信息學分析預測、和編碼蛋白的功能，進一步揭示JA合成基因在冬小麥響應抗寒中的作用，以期為闡明植物激素JA調控冬小麥抗寒性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

強抗寒性冬小麥品種東農冬麥1號(Dn1)，在黑龍江地區(qū)返青率達85%，由東北農業(yè)大學小麥室提供。于2018年9月8日播種于東北農業(yè)大學試驗田，行長2 m，行距0.25 m，10行區(qū)。每行播種量為150粒，播深5 cm，常規(guī)田間管理，于三葉期在葉面噴施1 mmol·L的MeJA，對照噴施等量水，分別用MeJA和CK表示。待大田自然降溫，連續(xù)10 d最低溫度平均為5 ℃(對照溫度，2018年10月15日)、0 ℃(2018年11月 2日)、 -10 ℃(2018年11月24日)和 -25 ℃(2019年1月14日)時，選取長勢一致的麥苗，剪取分蘗節(jié)和葉片，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取及表達量分析

使用RNA提取試劑盒Ultrapure RNA Kit(康為世紀，江蘇)提取冬小麥分蘗節(jié)和葉片的總RNA，使用反轉錄試劑盒(全式金，北京)進行cDNA第一條鏈的合成，反應體系為20 μL，包括1 μL RNA，1 μL Oligo(dT)，1 μL gRNA Remover，1 μL TranScript Enzyne Mix， 6 μL RNase-free Water，10 μL 2×Reaction Mix。反應程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。使用Primer Premier 5.0軟件設計(GQ166692)、(GQ166691)、(HQ913602)、(KJ001800)、(KF039887)和(KM216389)的qRT-PCR特異性引物(此處的引物為靶向小麥基因5A、5B、5D亞基因組同源區(qū)的引物)，以小麥為內參基因。此外，以NCBI發(fā)布的小麥基因序列(GQ166691)在小麥多組學數(shù)據庫進行BLAST，檢索到小麥5A、5B、5D基因組上的三個拷貝：TraesCS5A02G378700(5A)、Traes CS5B02G382300(5B)和TraesCS5D 02G388700(5D)，用在線軟件primer sever設計小麥、、的特異性引物，引物序列見表1。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書(諾唯贊，南京)反應體系進行表達量分析。反應程序： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 95 ℃ 15 s。用2-△△t方法 計算待測基因的相對表達量。3次生物學重復， 采用Prism 6.0軟件進行數(shù)據統(tǒng)計和顯著性 分析。

表1 本研究所用到的qRT-PCR引物Table 1 Primers for qRT-PCR used in the study

1.2.2、、的生物信息學分析

從小麥多組學數(shù)據庫網站(http://202.194.139.32/#)對染色體位置進行確定，使用ExPASy-ProtParam tool(https://web.expasy.org)在線程序分析、、基因編碼蛋白的理化性質；采用ProtComp 9.0(http://www.softberry.com/)在線程序預測蛋白的亞細胞定位；應用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html和SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在線程序預測蛋白的二級和三級結構；利用MEGA 6軟件N-J法對小麥()及其他7個物種的LOX2蛋白構建系統(tǒng)進化樹并分析。利用MEME-Submission form(http://meme-suite.org/tools/meme)對上述物種LOX2蛋白的基序進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA處理對低溫脅迫下Dn1分蘗節(jié)及葉片JA合成基因表達量的影響

2.1.1 JA合成基因、和表達量的變化

如表2所示，隨著溫度的降低，在分蘗節(jié)中，對照組和基因的相對表達量呈降-升-降的變化趨勢，分別在 -10 ℃、5 ℃時達到最大值，而基因的相對表達量呈先升后降的變化趨勢，在 -10 ℃時達到最大值；而處理組和基因的相對表達量呈升-降-升的變化趨勢，均在0 ℃達到最大值，基因則呈現(xiàn)持續(xù)下降的變化趨勢。在葉片中，對照組基因的相對表達量呈先降后升的變化趨勢，在 -25 ℃時達到最大值，而、基因的相對表達量呈升-降-升的變化趨勢，分別在0 ℃、 -25 ℃時達到最大值；處理組、基因呈先降后升的變化趨勢，在 -25 ℃時達到最大值，而基因呈先升后降的變化趨勢，在 -10 ℃時達到最大值。

表2 外源MeJA處理對JA合成基因 TaLOX1、 TaLOX2、 TaLOX3相對表達量的影響Table 2 Effect of MeJA treatment on the relative expression of JA synthesis genesTaLOX1, TaLOX2andTaLOX3

與對照組相比，外源MeJA處理提高了Dn1分蘗節(jié)在0 ℃下、和的相對表達量，降低了 -10 ℃下這三個基因的相對表達量，且、的降幅達極顯著水平，的降幅達顯著水平；外源MeJA處理顯著降低了Dn1葉片在0 ℃和 -25 ℃下以及 0 ℃下的相對表達量，顯著提高了 -10 ℃下的表相對達量。表明低溫和MeJA處理提高了早期(0 ℃)Dn1的內源JA合成，啟動了JA信號轉導。

2.1.2、、表達量的 變化

如表3所示，隨著溫度的降低，在分蘗節(jié)中，對照組和基因的相對表達量呈降-升-降的變化趨勢，分別在5 ℃和 -10 ℃時達到最大值，而基因的相對表達量則呈先升后降的變化趨勢，在 -10 ℃時達到最大值；處理組、基因的相對表達量分別呈先降后升、持續(xù)下降的變化趨勢，均在5 ℃時達到最大值，而基因的相對表達量呈升-降-升的變化趨勢，在0 ℃時達到最大值。在葉片中，對照組、基因的相對表達量均呈先降后升的變化趨勢，均在5 ℃時達到最大值，而基因呈先升后降的變化趨勢，在 -10 ℃時達到最大值；處理組基因的相對表達量呈降-升-降的變化趨勢，在 -10 ℃時達到最大值，而、基因的相對表達量呈先降后升的變化趨勢，分別在 5 ℃和 -25 ℃時達到最大值。

表3 外源MeJA處理對JA合成基因TaAOS、TaAOC、 TaOPR2相對表達量的影響Table 3 Effect of MeJA treatment on the relative expression of JA synthesis genes TaAOS,TaAOC and TaOPR2

與對照組相比，外源MeJA處理提高了Dn1分蘗節(jié)在0 ℃下、、三個基因的相對表達量，且的增幅達極顯著水平，的增幅達顯著水平；降低了這三個基因在 -10 ℃下的相對表達量，其中、的降幅達極顯著水平，的降幅達顯著水平；且外源MeJA處理極顯著提高了Dn1葉片 -10 ℃下和 -25 ℃下的相對表達量，顯著提高了-25 ℃下葉片中的相對表達量，極顯著降低了0 ℃、 -10 ℃和 -25 ℃下葉片中的相對表達量。

2.1.3、、表達量變化

如表4所示，隨著溫度的降低，在分蘗節(jié)中，對照組和基因的相對表達量呈先升后降的變化趨勢，均在0 ℃時達到最大值，而基因的相對表達量呈降-升-降的變化趨勢，在 -10 ℃時達到最大值；處理組和基因的相對表達量呈升-降-升的變化趨勢，均在 -25 ℃時達到最大值，而基因的相對表達量呈先降后升的變化趨勢，在 -25 ℃時達到最大值。在葉片中，對照組和處理組Dn1葉片中、和基因的相對表達量均呈持續(xù)上升趨勢(除處理組0 ℃下和除外)，均在 -25 ℃時達到最大值。

表4 外源MeJA處理對TaLOX2A、TaLOX2B、TaLOX2D相對表達量的影響Table 4 Effect of MeJA treatment on the relative expression of TaLOX2A, TaLOX2Band TaLOX2D

與對照組相比，外源MeJA處理降低了Dn1分蘗節(jié)和葉片在0 ℃、 -10 ℃下、和的相對表達量，部分基因降幅達顯著或極顯著水平；外源MeJA處理提高了 -25 ℃下分蘗節(jié)中、和的相對表達量，且的降幅達極顯著水平，的降幅達顯著水平；外源MeJA處理極顯著降低了-25 ℃下葉片中的相對表達量，極顯著提高了 -25 ℃下葉片中和基因的相對表達量。

2.2 TaLOX2A、TaLOX2B、TaLOX2D的生物信息學分析

2.2.1 蛋白質理化性質分析

基因(TraesCS5A02G378700)位于基因組5A染色體575 705 509～575 709 396區(qū)間，基因全長為3 888 bp，編碼864個氨基酸。蛋白相對分子量為96.8 kDa，理論等電點為 6.09，屬于酸性蛋白；280 nm下的消光系數(shù)為 1.505～1.506，預測半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為33.63，脂肪指數(shù)為87.03，親水性總平均值為 -0.299，為穩(wěn)定的親水性蛋白。

基因(TraesCS5B02G382300)位于小麥基因組5B染色體560 441 118～560 444 767區(qū)間，基因全長為3 650 bp，編碼864個氨基酸。該蛋白的相對分子量為 96.5 kDa，理論等電點為6.10，屬于酸性蛋白；280 nm下的消光系數(shù)為 1.509～1.510，預測半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為32.85，脂肪指數(shù)為87.37，親水性總平均值為-0.280，為穩(wěn)定的親水性蛋白。

基因(TraesCS5D02G388700)位于基因組5D染色體458 094 426～458 098 176區(qū)間，基因全長為3 751 bp，編碼864個氨基酸。蛋白分子量為96.6 kDa，理論等電點為 6.17，屬弱酸性蛋白；280 nm下的消光系數(shù)為1.508～ 1.510，預測半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為34.46，脂肪指數(shù)為87.14，親水性平均值為 -0.283，為穩(wěn)定親水性蛋白。

2.2.2 亞細胞定位預測結果

利用ProtComp 9.0在線程序對、和基因編碼的蛋白分別進行亞細胞定位預測，預測結果顯示這些蛋白均位于細胞質中。

2.2.3 TaLOX2蛋白二、三級結構預測結果

TaLOX2A蛋白二級結構預測結果(圖1A)顯示，無規(guī)則卷曲占44.33%，α-螺旋占 36.11%，延伸鏈占14.00%，β-轉角占5.56%，表明該蛋白為無規(guī)則卷曲型。同源建模SWISS-MODEL在線程序對其蛋白三級結構建模，結果顯示該蛋白為3pzw.1.A，與模板序列相似度為55.95%，GMQE值為0.79，QMEAN值為 -1.72。

圖1 TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D蛋白二級(左)、三級(右)結構預測

TaLOX2B蛋白二級結構預測結果(圖1B)顯示，無規(guī)則卷曲占43.98%，α-螺旋占36.46%，延伸鏈占14.24%，β-轉角占5.32%，表明該蛋白為無規(guī)則卷曲型。同源建模SWISS-MODEL在線程序對其蛋白三級結構建模，結果與TaLOX2A一致。

TaLOX2D蛋白二級結構預測結果(圖1D)顯示，無規(guī)則卷曲占43.52%，α-螺旋占 37.62%，延伸鏈占13.77%，β-轉角占5.09%，表明該蛋白為無規(guī)則卷曲型。同源建模SWISS-MODEL在線程序對其蛋白三級結構建模，結果顯示該蛋白為3pzw.1.A，與模板序列相似度為 55.58%，GMQE值為0.79，QMEAN值為-1.63。

2.2.4 進化樹與基序分析

利用MEGA 6軟件的N-J法對冬小麥Dn1中TaLOX2A、TaLOX2B和TaLOX2D蛋白以及擬南芥、水稻、大豆()、玉米()、大麥(subsp.)、燕麥()和高粱()的LOX2蛋白進行系統(tǒng)進化分析，結果(圖2)表明，Dn1中TaLOX2A蛋白與TaLOX2D蛋白同源性最高，二者與TaLOX2B蛋白聚類在一個大分支上，且這三個蛋白與大麥LOX2蛋白親緣性較近，與擬南芥、水稻LOX2蛋白親緣性較遠?；蚍治鼋Y果(圖3)顯示，TaLOX2A、TaLOX2B、TaLOX2D蛋白含有相同的結構域，均屬于LOXs家族蛋白，與大麥、燕麥、玉米、大豆、高粱均含有10個相同的基序；而擬南芥、水稻含有8個相同的基序，說明LOX2蛋白保守性較高。推測小麥LOX2蛋白可能與擬南芥、水稻LOX2蛋白行使的功能存在一定差異，也驗證了系統(tǒng)進化樹分析結果。

圖2 不同物種LOX2蛋白系統(tǒng)進化樹分析

Zm： 玉米；Sb：高粱；As:燕麥；Hv：大麥；Ta：小麥；Gm:大豆；At：擬南芥；Os：水稻。

3 討 論

Dn1安全越冬的主要部位是分蘗節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理提高了Dn1分蘗節(jié)中、、和的相對表達量，在-10 ℃表達量達到最大值，這與我們前期發(fā)現(xiàn)Dn1分蘗節(jié)中JA響應基因(響應內源JA水平)和JA信號轉導基因的表達量在-10 ℃最高一致，表明低溫誘導JA合成基因的表達，進而提高內源JA的含量。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，外源MeJA處理顯著提高了0 ℃下分蘗節(jié)中、、、和的表達量，表明MeJA處理使JA合成基因的表達提前，為抵御持續(xù)低溫的到來做好了抗寒準備。

JA 的生物合成是通過JA生物合成基因、、和的作用完成的，可提高低溫脅迫下作物的抗寒性。LOX2是JA生物合成的關鍵酶。研究表明，外源MeJA處理可誘導辣椒基因上調表達，提高番石榴果實的LOX活性，進而使其有效抵抗低溫脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)，外源MeJA處理提高了分蘗節(jié)在0 ℃下的表達量，降低了在-10 ℃下的表達量；而0 ℃和-10 ℃下、、的表達量均有所下降。原因可能是的表達量是針對A、B、D亞基因組的同源區(qū)定量，而、、的表達量是針對這三個同源基因的特異區(qū)段定量，由于其序列的高度相似性使得特異區(qū)段的選擇受限，導致和、、表達量變化趨勢出現(xiàn)不一致。前人研究表明，家族各成員在不同脅迫或者同一脅迫反應中表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗效應，從而表現(xiàn)出相似或相反的響應。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫提高了分蘗節(jié)中和的表達量，降低了的表達量，同時葉片中LOX1、LOX2、LOX3的表達量均有所提高，表明分蘗節(jié)家族各成員對低溫脅迫表現(xiàn)出拮抗的反應，而葉片則表現(xiàn)出協(xié)同的反應。這可能與葉片在極低溫度下被積雪覆蓋或被寒風抽干，代謝減弱；而分蘗節(jié)被土層覆蓋，是Dn1安全越冬的主要部位有關。

在擬南芥、大豆等植物中發(fā)現(xiàn)，LOX2-AOS-AOC復合物促進了JA的生物合成。本研究初步探討了低溫脅迫和外源MeJA處理下Dn1中JA合成基因的表達量變化及JA合成關鍵酶基因不同亞基因組同源基因表達量的變化。推測Dn1中也存在LOX2-AOS-AOC復合物，促進JA的生物合成，但還有待進一步研究。