蔣擎玉 尚愛加 高 干 陶本章 汪 匯 王培新 孫夢純 吳 言

脊髓拴系綜合征（tethered cord syndrome，TCS），又稱脊髓拴系，因先天發(fā)育異常，使短而增厚的終絲組織彈性降低，對脊髓施加過度的牽引力導(dǎo)致脊髓圓錐低位、馬尾神經(jīng)受到牽拉，產(chǎn)生排尿和排便障礙、下肢感覺和運(yùn)動障礙、足畸形等癥狀，隨著生長發(fā)育，癥狀也會逐漸加重[1]。早期對該病的認(rèn)識不足，脊髓圓錐被定義為脊髓的末端，終絲則被認(rèn)為是一束無功能的纖維組織，部分學(xué)者將其稱為“脊髓韌帶”，也有學(xué)者將其描述為脊髓的末端，更有學(xué)者將其視為“脊髓的殘余物”，忽略了終絲在TCS 發(fā)病機(jī)制中起到不可或缺的作用[2]。本文通過對比正常人與TCS終絲差異，探討TCS的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選擇2021 年10 月～2022 年5 月手術(shù)切除的16例TCS病人的終絲標(biāo)本，其中男5例，女11例；年齡3～69歲。16例均有大小便功能障礙及會陰區(qū)感覺減退，其中4例有明顯的下肢肌肉萎縮；腰骶部皮膚出現(xiàn)異常毛發(fā)增多1 例，實性包塊、異常毛發(fā)、先天性皮毛竇、骨贅以及色素沉著15例。MRI可見16 例圓錐位置均平齊或低于腰2 椎體下緣。1 例正常終絲取自腰骶部神經(jīng)鞘瘤，其終絲與神經(jīng)鞘瘤粘連緊密，難以分離，同腫瘤一并切除。為預(yù)防馬尾神經(jīng)損傷，在電生理監(jiān)測技術(shù)保護(hù)下，取新鮮終絲。3 例有肉眼可見的與脂肪交織混雜的終絲組織?？紤]到TCS通常伴有圓錐低位，為避免脊髓損傷，均取骶1椎體水平及以下硬膜囊內(nèi)終絲。本文經(jīng)病人及其家屬知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 組織染色

1.2.1 HE染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化，蘇木素染液染細(xì)胞核，85%、95%的梯度酒精脫水，伊紅染液染細(xì)胞質(zhì)，無水乙醇、二甲苯透明后，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.2.2 天狼猩紅染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化。天狼猩紅染液（武漢賽維爾生物科技有限公司）染色，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并分析。

1.2.3 網(wǎng)狀纖維染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化。酸化液氧化（0.5%高錳酸鉀與0.5%硫酸1:1 混勻），超純水浸洗。滴加2%草酸漂白，超純水浸洗。滴加網(wǎng)狀纖維染液F（武漢賽維爾生物科技有限公司）避光媒染，超純水浸洗。滴加網(wǎng)狀纖維孵育液避光處理，超純水浸洗。滴加10%中性甲醛液避光還原，肉眼觀察組織未出現(xiàn)黃棕色時，可延長作用時間。超純水浸洗，無水乙醇、二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察并分析。

1.2.4 間二苯酚品紅染色 將石蠟切片依次放入二甲苯、無水乙醇、75%酒精脫蠟水化。間苯二酚品紅染液A室溫浸染，流水沖洗至流水無色。1%鹽酸酒精分化液快速分化，顯微鏡觀察到清晰的紫色的彈力纖維，背景淡紫色至幾乎無色。間苯二酚堿性品紅染液B 與間苯二酚堿性品紅染液C 混合染色，無水乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠濕封，顯微鏡觀察并分析。

1.3 電鏡檢測

1.3.1 透射電鏡檢測 新鮮組織確定取材部位，盡量減小牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，1～3 min內(nèi)取樣，大小1 mm3。0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min。隨后，0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）配制的1%鋨酸避光室溫固定2 h。0.1 M 磷酸緩沖液（pH7.4）漂洗3 次，每次15 min。次入30%-50%-70%-80%-95%-100%-100%酒精脫水（每次20 min），100%丙酮脫水兩次（每次15 min）。812 包埋劑包埋，37 ℃烤箱過夜，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片機(jī)（60～80 nm）超薄切片，150 目方華膜銅網(wǎng)撈片。2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min；70%酒精清洗3 次；超純水清洗3 次；2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min；超純水清洗3次，濾紙稍吸干。銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。最后透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

1.3.2 掃描電鏡檢測 取材同透射電鏡。0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3 次，每次15 min。0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）配制1%鋨酸室溫避光固定1～2 h。0.1 M 磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗3 次，每次15min。30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%-100%酒精依次脫水，每次15 min，乙酸異戊酯脫水15 min。臨界點干燥儀內(nèi)干燥。隨后，導(dǎo)電碳膜雙面膠上放入離子濺射儀樣品臺上進(jìn)行噴金30 s。掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

HE染色：正常終絲絕大部分由松散的結(jié)締組織組成，膠原纖維主體呈粉紅色，未見藍(lán)染的細(xì)胞核（圖1B）。TCS 終絲波浪狀的彈性纖維明顯減少，膠原纖維明顯增多，可見大量的脂肪細(xì)胞（圖1A），這很可能與TCS終絲增粗有關(guān)。

天狼猩紅染色：Ⅰ型膠原呈橘黃色或亮紅色，而Ⅲ型膠原呈綠色的細(xì)纖維，這說明TCS 終絲的大部分為較粗的縱向膠原束（圖1C、1D），以Ⅰ型膠原纖維為主，Ⅲ型則嵌入其中。

間二苯酚染色：正常終絲的彈力纖維呈紫紅色，大多縱向伸展，為保證終絲的伸展性，粉紅色膠原纖維則十分稀疏（圖1F）；然而TCS 終絲幾乎都是淺色的膠原纖維（圖1E）。

網(wǎng)狀纖維染色：正常終絲彈力纖維呈黑色（1H）。TCS 終絲多見空泡狀的脂肪細(xì)胞，偶見穿梭于膠原纖維中的黑色網(wǎng)狀纖維（圖1G）。

圖1 TCS終絲病理染色

掃描電鏡觀察：正常終絲纖維相對規(guī)整、粗細(xì)均勻。TCS 終絲多見大量排列紊亂、方向性差的膠原纖維，部分可見散在的脂肪細(xì)胞（圖2A）；終絲以縱向膠原纖維束為主，橫向纖維束穿插其中，互有間隔，纖維與纖維間不是緊密貼合（圖2B）。

透射電鏡觀察：終絲內(nèi)部多見密集交錯的膠原纖維以及這些纖維的規(guī)律性的橫紋，偶可見成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等（圖2C、2D）。

16 例Ⅰ型膠原纖維數(shù)量增多，占終絲的大部分；6 例可見脂肪細(xì)胞，3 例顯示小血管。16 例終絲掃描電鏡下可見雜亂無章且呈束的膠原纖維，5 例Ⅰ型膠原纖維增粗、變形，5例可見脂肪細(xì)胞。16例終絲透射電鏡可見縱橫交錯的膠原纖維以及有規(guī)律的橫紋，其中1例可見成纖維細(xì)胞。

3 討論

TCS 最早于19 世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)。然而，直到1953年，Garceau[3]才首次描述了終絲綜合征，并推斷可能是異常增厚的終絲過度牽引脊髓從而產(chǎn)生臨床癥狀。此后于1981 年，Yamada 等[4]經(jīng)動物研究后得出終絲牽拉后產(chǎn)生脊髓神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙可能是線粒體氧化消化及代謝損傷所致。20 多年后，George等[5]對比了正常人和TCS 終絲，確認(rèn)大量室管膜細(xì)胞、神經(jīng)和膠質(zhì)組織的存在，顛覆了以往僅將終絲視為韌帶的錯誤認(rèn)識[6]。

目前認(rèn)為引起TCS 的病因主要有：①先天神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育畸形[7]。遠(yuǎn)端神經(jīng)管由尾部細(xì)胞團(tuán)發(fā)育形成，發(fā)展成脊髓圓錐、馬尾和終絲，其異?？赡軐?dǎo)致病理性終絲形成，增加未來拴系的可能性。②黏連、炎癥或硬膜內(nèi)手術(shù)后多見[8]，常拴系于硬膜背側(cè)。有學(xué)者分析終絲的蛋白組學(xué)，通過對比正常終絲，提出差異蛋白可能參與異常的脂質(zhì)等代謝，從而使終絲發(fā)生病理改變[9]。關(guān)于原發(fā)性TCS的分型，一直充滿爭議。目前，國內(nèi)較為廣泛接受的是Gabriel 等[10]的分型：脊髓脊膜膨出修復(fù)術(shù)后型；蛛網(wǎng)膜粘連型；終絲緊張型；脂肪瘤型；脊髓縱裂畸形型。而尚愛加等[11]根據(jù)多年治療兒童TCS 的經(jīng)驗，將此分型進(jìn)一步修改完善：脊髓脊膜膨出修復(fù)術(shù)后型；脊髓脊膜膨出型；終絲緊張型；脂肪瘤型；脊髓縱裂畸形型。目前，TCS 的主要治療方法是終絲切斷術(shù)，尤其是伴有臨床表現(xiàn)的病人[12]。因為脊髓圓錐位置正常的病人也可能伴有終絲高張力的現(xiàn)象，無論終絲外觀看起來是否正常，早期終絲切斷都是首選的治療方法[13，14]。

本文以TCS 終絲為研究對象，采用電鏡和染色技術(shù)對終絲結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致觀察，探討TCS 終絲彈性減退、張力增大的機(jī)制。Chrenek等[15]在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常終絲可見室管膜細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元等原始成分。終絲具有狹長的中央管，該管由室管膜細(xì)胞排列，同時被成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞包圍，形成典型的灰質(zhì)。有髓纖維和無髓纖維在終絲周圍的白質(zhì)中呈島狀分布。本研究發(fā)現(xiàn)TCS病人MRI 顯示終絲張力明顯增大、圓錐低位的原因可能是Ⅰ型膠原纖維、彈性纖維以及網(wǎng)狀纖維的含量變化，與此同時大量的脂肪組織浸潤其中可能是終絲彈性下降的原因。文獻(xiàn)報道，哺乳動物Ⅰ型膠原蛋白是皮膚中主要的膠原蛋白類型，占皮膚膠原蛋白的80%～90%，由真皮中成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。深度創(chuàng)傷會導(dǎo)致疤痕。疤痕主要由過度合成和雜亂無章的Ⅰ型纖維組成。若在重組過程中，有神經(jīng)參與其中，則膠原纖維排布得井然有序[16]。這是否是TCS病因之一有待進(jìn)一步論證。

除了終絲，脂肪浸潤也可見于肌肉中。Xu 等[17]研究脂肪浸潤損傷后的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)的主要細(xì)胞群包括成纖維細(xì)胞和脂肪組細(xì)胞，證實PI3K/AKT 和MAPK信號通路在內(nèi)的脂質(zhì)代謝途徑改變了肌肉中的脂肪酸組成。張宇等[9]在終絲蛋白組學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)載脂蛋白A1 的表達(dá)上調(diào)。這表明當(dāng)神經(jīng)管發(fā)育異常時該蛋白有參與抑制高密度脂蛋白受體SRB1的的作用[18]。這與TCS病因一致。

綜上所述，本研究結(jié)果表明MRI 顯示的具有較高張力的終絲在顯微結(jié)構(gòu)下多由于彈性纖維、網(wǎng)狀纖維減少，Ⅰ型膠原纖維及脂肪組織異常增加，最終使得終絲彈性減退、張力變大，從而導(dǎo)致大小便功能障礙、下肢肌肉萎縮等臨床表現(xiàn)。本研究也存在諸多不足，如樣本量不足以及正常終絲較難取得等問題，所觀察的微觀結(jié)構(gòu)可能未必全面。